As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.

O genoma humano é composto por diversos tipos de variações estruturais, como por exemplo, as variações no número de cópias (CNVs), que, mesmo sendo muito pequenas, podem gerar diversas alterações clínicas específicas, como as malformações congênitas e o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (MC/ADNPM). Para a detecção destas alterações existem diferentes técnicas citogenômicas dentre elas a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) e a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), que investigam um número limitado de regiões do genoma, como as regiões envolvidas nas síndromes de microdeleções/microduplicações mais comuns e as regiões subteloméricas. Outros métodos como a cariotipagem clássica e o array genômico possibilitam uma análise completa do DNA em uma única reação, aumentando a taxa de detecção de desequilíbrios complexos. Alcançar um diagnóstico inequívoco é fundamental para entender a natureza da doença, fornecendo respostas sobre o prognóstico, sobre os riscos de recorrência e direcionando o paciente à terapia específica, o que pode minimizar o custo financeiro dessas doenças e até mesmo possibilitar a inclusão desses indivíduos na sociedade. O projeto teve como objetivo comparar a capacidade diagnóstica destas tecnologias (FISH, MLPA e array) para a elucidação etiológica de pacientes sindrômicos encaminhados para a unidade de genética. A casuística deste trabalho foi composta pela análise dos resultados das técnicas de FISH e/ou MLPA e array, utilizadas no diagnóstico de 78 pacientes com MC/ADNPM. Na técnica de FISH, empregada na análise genômica de 22 pacientes, foram utilizadas sondas locus específicas para as regiões das principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas de cromossomos específicos. Por meio desta metodologia, foram identificados ~18,2% dos pacientes com diferentes alterações. Já a técnica de MLPA, utilizada no diagnóstico dos 78 pacientes, por meio dos kits para as principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas, detectou ~34,6% de pacientes com diversas alterações. A técnica de array, realizada em todos os pacientes utilizando diferentes plataformas (Agilent, Affymetrix ou Illumina) apresentou uma taxa de ~42,3% de detecção de pacientes com pelo menos uma alteração patogênica e ~38,5% de pacientes com alterações benignas ou de significado clínico incerto. Ao avaliar as três técnicas concomitantemente foi verificada uma taxa de ~93,6% de concordância, apesar dos resultados não serem iguais em todos os casos e da técnica de MLPA não detectar ~66,2% das alterações em relação ao array. Os resultados obtidos corroboraram com dados da literatura, mas no geral a taxa de detecção foi superior às taxas descritas, o em que em parte pode ser devido ao critério de seleção dos pacientes, sugerindo fortemente que a hipótese clínica adequada é crucial para o sucesso da detecção de alteração. Embora o array seja a ferramenta mais eficiente para o diagnóstico de pacientes com malformações, seu uso como primeiro teste diagnóstico nem sempre é o mais apropriado devido ao seu custo elevado ou sua limitação em detectar inversões e translocações balanceadas. Portanto todas as técnicas estudadas têm suas vantagens e desvantagens, e poderão ser aplicadas em conjunto para que o diagnóstico molecular seja concluído. Dessa forma, são necessárias uma interação clínico-laboratorial e uma equipe técnica multiprofissional especializada para o direcionamento do diagnóstico molecular mais eficaz em relação ao custo-benefício / The human genome is composed of several types of structural variations, such as copy number variation (CNVs) which, although very small, can generate several specific clinical abnormalities, such as congenital malformations and developmental delay (CM/DD). To detect these changes there are different cytogenomics techniques, among them, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) that can investigate a limited number of genomic regions for example the most common microdeletion/microduplications syndromes and subtelomeric regions. Other methods such as classical karyotyping and array provide a complete DNA analysis in a single reaction, increasing the detection rate of complex imbalances. Acquire an unequivocal diagnosis is critical to understand the nature of the disease, providing answers about the prognosis, risks of recurrence and directing the patients to specific therapy, which can minimize the cost of these diseases and even allow the inclusion of these individuals in society. The objective of this project was to compare the diagnostic ability of these technologies (FISH, MLPA and array) for the etiologic diagnosis of syndromic patients referred to the clinical unit of genetics. The casuistry was composed by the results of analysis of 78 patients with CM/DD using FISH and/or MLPA and array. The FISH technique was utilized in genomic analysis for 22 patients and locus specific probes were used for regions of the microdeletion/microduplication syndromes and the subtelomeric regions of specific chromosomes. By this methodology ~18.2% of the patients were identified with different genomic changes. The MLPA technique was used in the diagnosis of 78 patients, with microdeletion/microduplication syndrome and subtelomeric regions, and detected ~34.6% of patients with several changes. The array technique was performed in all patients using different platforms (Agilent, Illumina or Affymetrix) and shows a rate of ~42.3% of detection at least one pathogenic change and ~38.5% of patients with benign or uncertain clinical significance changes. In assessment of the three techniques concomitantly was observed a rate of ~93.6% of concordance, although the results are not the same in all cases and the MLPA technique to detect ~ 66.2% of the changes in relation to the array. The results obtained corroborated with literature data, but the overall detection rate was higher than the rates described in the literature, due in part to the criteria selection of patients. Our results strongly suggesting that appropriate clinical hypothesis is crucial for successful change detection. Although the array is the most efficient tool for the diagnosis of patients with abnormalities, using this test as a first diagnostic approach is not always the most suitable tool because of the high cost or the limitation to detect inversions and balanced translocations. Therefore, all techniques studied have their advantages and disadvantages, and could be applied together for the completed molecular diagnosis. Thus, a clinical laboratory interaction and multidisciplinary skilled technicians is required for targeting the most effective molecular diagnosis in relation to cost-benefit

O comportamento do câncer de mama pode ser influenciado pela interação entre células tumorais e estromais que infiltram e circundam o tumor. Acredita-se também que as células que compõem o microambiente linfonodal possam influenciar o perfil da expressão gênica de células mamárias malignas MDA-MB231, induzindo ou inibindo o desenvolvimento de metástase regional. Para avaliar essa possibilidade, células MDA-MB231 foram co-cultivadas com fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos ou não comprometidos de pacientes com câncer de mama, separadas por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi avaliado através de uma plataforma de cDNA microarray de 4608 genes. Observamos que 155 e 188 genes foram modulados em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos não comprometidos e comprometidos, respectivamente, quando comparados com células MDA-MB231 cultivadas isoladamente. Análise do agrupamento hierárquico não supervisionado utilizando os genes diferencialmente expressos revelou a presença de dois grupos, um constituído por células MDA-MB 231 em monocultura e outro por células mantidas em co-cultura com fibroblastos. Splicing de RNAm, via spliceossoma, ciclo celular e regulação da transcrição por promotores da RNA polimerase II, foram algumas funções moduladas em células MDA-MB231. A seguir novos ensaios de co-cultura foram realizados e a expressão de alguns genes foram analisados por RT-PCR. FN3K e COMT foram menos expressos em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos, mas não em co-cultura com células MCF-7, nas quais apenas HTRA1 mostrou-se hipoexpresso em casos de co-cultura com fibroblastos. Esses resultados sugerem que a inter-relação entre células estromais e células tumorais são dependentes do subtipo do tumor, de fenótipo luminal ou basal / Breast cancer behavior may be influenced by interactions between cancer and stromal cells, which infiltrate and surround the tumor. It is also believed that cells within the lymph node microenvironment may influence the gene expression profile of breast cancer cells, stimulating or inhibiting regional metastasis development. To evaluate this possibility, breast cancer MDAMB231 cells were co-cultured with fibroblasts obtained from involved or uninvolved lymph nodes from breast cancer patients, using a porous membrane, for 72 hours. Gene expression profile was evaluated through a cDNA microarray platform containing 4608 genes. MDA-MB231 cells had 155 and 188 genes modulated by the presence of fibroblasts from uninvolved or involved nodes, respectively, as compared to MDA-MB231 cells cultured alone. Unsupervised hierarchical clustering using the differentially expressed genes revealed the presence of two groups, one comprising MDA-MB231 cells cultured aloned and another one, MDA-MB231 cells co-cultured with fibroblasts. Nuclear mRNA splicing, via spliceosome, cell cycle, and regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, were functions regulated in cocultured MDA-MB231 cells. New co-culture assays were performed and expression of a few genes was further evaluated by RT-PCR. FN3K and COMT were both down-regulated in MDA-MB231 cells in the presence of nodes\' fibroblasts, but not in co-cultured MCF7 cells, while HTRA1 was just down regulated in MCF7 co-cultured cells. These results suggest that the interrelationship between stromal and cancer cells are dependent on the subtype of tumor, whether from luminal or basal-like phenotype

O comportamento do câncer de mama pode ser influenciado pela interação entre células tumorais e estromais que infiltram e circundam o tumor. Acredita-se também que as células que compõem o microambiente linfonodal possam influenciar o perfil da expressão gênica de células mamárias malignas MDA-MB231, induzindo ou inibindo o desenvolvimento de metástase regional. Para avaliar essa possibilidade, células MDA-MB231 foram co-cultivadas com fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos ou não comprometidos de pacientes com câncer de mama, separadas por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi avaliado através de uma plataforma de cDNA microarray de 4608 genes. Observamos que 155 e 188 genes foram modulados em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos não comprometidos e comprometidos, respectivamente, quando comparados com células MDA-MB231 cultivadas isoladamente. Análise do agrupamento hierárquico não supervisionado utilizando os genes diferencialmente expressos revelou a presença de dois grupos, um constituído por células MDA-MB 231 em monocultura e outro por células mantidas em co-cultura com fibroblastos. Splicing de RNAm, via spliceossoma, ciclo celular e regulação da transcrição por promotores da RNA polimerase II, foram algumas funções moduladas em células MDA-MB231. A seguir novos ensaios de co-cultura foram realizados e a expressão de alguns genes foram analisados por RT-PCR. FN3K e COMT foram menos expressos em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos, mas não em co-cultura com células MCF-7, nas quais apenas HTRA1 mostrou-se hipoexpresso em casos de co-cultura com fibroblastos. Esses resultados sugerem que a inter-relação entre células estromais e células tumorais são dependentes do subtipo do tumor, de fenótipo luminal ou basal / Breast cancer behavior may be influenced by interactions between cancer and stromal cells, which infiltrate and surround the tumor. It is also believed that cells within the lymph node microenvironment may influence the gene expression profile of breast cancer cells, stimulating or inhibiting regional metastasis development. To evaluate this possibility, breast cancer MDAMB231 cells were co-cultured with fibroblasts obtained from involved or uninvolved lymph nodes from breast cancer patients, using a porous membrane, for 72 hours. Gene expression profile was evaluated through a cDNA microarray platform containing 4608 genes. MDA-MB231 cells had 155 and 188 genes modulated by the presence of fibroblasts from uninvolved or involved nodes, respectively, as compared to MDA-MB231 cells cultured alone. Unsupervised hierarchical clustering using the differentially expressed genes revealed the presence of two groups, one comprising MDA-MB231 cells cultured aloned and another one, MDA-MB231 cells co-cultured with fibroblasts. Nuclear mRNA splicing, via spliceosome, cell cycle, and regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, were functions regulated in cocultured MDA-MB231 cells. New co-culture assays were performed and expression of a few genes was further evaluated by RT-PCR. FN3K and COMT were both down-regulated in MDA-MB231 cells in the presence of nodes\' fibroblasts, but not in co-cultured MCF7 cells, while HTRA1 was just down regulated in MCF7 co-cultured cells. These results suggest that the interrelationship between stromal and cancer cells are dependent on the subtype of tumor, whether from luminal or basal-like phenotype

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.

As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.

Thesis (Ph. D.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2005. / Typescript (photocopy).