Thesis (Ph.D. in Epidemiology) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 96-112). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Mestre -- Sao Paulo (Estado). Secretaria da Saude. Coordenacao dos Institutos de Pesquisa. Programa de Pos-Graduacao em Ciencias, Sao Paulo, 2004.

Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2004. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 118 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 3 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 4 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 5 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5) Publico-12671e.pdf: 132448 bytes, checksum: 7153a9583a94f50f2a56c79c6d7d320a (MD5) / O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular. / Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4543_1.pdf: 1690700 bytes, checksum: da5dc337c7de1a577ea7ee10118fbca6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cerca de 490.000 novos casos de câncer cervical têm ocorrido entre mulheres do mundo todo a cada ano. No Brasil, a estimativa de incidência aponta o câncer de colo do útero como o terceiro mais comum entre as mulheres no ano de 2006, com estimativa de 19.260 novos casos em todo o país. Segundo o INCA (2006), no estado de Pernambuco, estima-se que ocorram 22,16 novos casos para cada 100.000 mulheres. O papilomavirus humano (HPV) é o principal agente envolvido em lesões benignas e malignas, sendo caracterizados como baixo-risco e alto-risco, respectivamente. Os HPVs de alto-risco, como os sorotipos 16 e 18, são capazes de produzir as oncoproteínas E6 e E7 que alteraram as funções das proteínas regulatórias do ciclo, como as proteínas p53 e retinoblastoma, respectivamente. Devido à dificuldade de cultivo do HPV em cultura de tecidos, a clonagem destes genes representa uma possibilidade de estudos mais avançados. Entre os novos sistemas de expressão de proteínas heterólogas, pode-se destacar Pichia pastoris que é facilmente manipulada, e possui a capacidade de expressar a proteína de interesse em altos níveis e também realizar modificações pós-transducionais. Assim, o objetivo do presente trabalho é clonar o gene E6 do HPV 16 em P. pastoris. Para tanto, o gene E6 do HPV 16 (477 bp) foi clonado diretamente no vetor pPICZA (3.300 bp), amplificado em Escherichia coli DH5α e linearizado com SacI para ser integrado ao genoma da levedura por recombinação. Todos os clones obtidos foram submetidos à PCR com primers específicos, linearizações com enzimas e seqüenciamento. O resultado obtido com o PCR da P. pastoris transformante apresentou tamanho correspondente ao gene E6. A seqüência gênica dos nucleotídeos apresentou um score de 93% quando alinhado com a seqüência gênica da E6 do HPV 16 depositada nos bancos de dados gênicos. Os clones obtidos permitirão a expressão desta oncoproteína por P. pastoris, e desta forma, o desenvolvimento de vacinas terapêuticas ou medicamentos sítio-específico capazes de erradicar a doença

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20243号 / 医博第4202号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 齊藤 博英, 教授 原田 浩, 教授 秋山 芳展 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

The treatment and/or prevention of cancer by selective down regulation of cancer causing gene (oncogene) transcription would represent a significant advance in the area of anticancer drug design. Non-canonical higher order DNA structures formed in oncogene promoter regions are novel targets for the modulation of oncogene expression. An obvious advantage of selectively targeting oncogene expression would be that general cytotoxicity would be minimized and the negative side effects of current chemotherapy approaches could be minimized or eliminated. To provide a foundation for the design of drugs that target oncogene promoter G-quadruplexes and i-Motifs, the basic understanding is required of the folding of guanine and cytosine rich sequences and how small molecules bind to these structures. The research reported here focuses on higher order DNA structures of two oncogenes, K-ras that is overexpressed in pancreatic cancer, and Bcl-2 that is overexpressed in a number of cancers, and one non-oncogene, HAR1. We have probed the overall structure, stability, and binding of a model drug compounds to G-quadruplex and i-Motif DNA structures in these genes. The overall objectives of this work were: 1) to understand the relationship between oligonucleotide sequence and intramolecular folding topology and stability, and 2) to understand the mechanisms for the selective binding of small molecules to these structures. Biophysical techniques including: microcalorimetry, spectroscopy, analytical ultracentrifugation, gel electrophoresis, and computational methods were used to characterize both the folding and the binding interactions. We have shown that the native K-ras purine and pyrimidine rich sequences form stable G-quadruplexes and i-Motifs. We have also characterized four G-rich sequences found within the reading frame of the human HAR1 gene. This is the first report on the formation of stable G-quadruplex motifs within the RF of any gene. The model drug, TMPyP4, binds to the Bcl-2, K-ras, and HAR1 G-quadruplexes by two different binding modes, end binding and intercalation. The significance of this research is that the results of the K-ras and Bcl-2 studies could lead to the design of drugs that selectively target oncogenes while the HAR1 results could provide new approaches to the treatment of Schizophrenia and Alzheimer’s disease.

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