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Angiogenic profile in Myelodysplastic Syndromes and genetic characterization of the endothelial compartment - biologic and clinic relevance

Osório, Catarina Raquel de Sousa 25 July 2007 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Pesquisa de mutações do gene Six4 em carcinoma ductal in situ da mama

Figueiredo, Elisabete Simões de 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular Oncology
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HLA e polimorfismos genéticos de citocinas inflamatórias na caracterização imunogenética da sarcoidose

Morais, António Manuel Martins de 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Doença de fabry: estudo da frequência das variantes alélicas do gene GLA na população portuguesa

Sousa, Sérgio Abílio Teixeira Bernardo de 25 January 2008 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Activação das vias de sinalização intracelular das ERKs 1 e 2 e da p38 em carcinomas de células de transição da bexiga

Pinto, Rui Miguel Correia de Almeida 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Detecção e quantificação da expressão de genes de resistência aos azoles em Candida albicans

Ricardo, Elisabete Travassos Araújo 12 February 2008 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / 1. Resumo Diversos mecanismos moleculares estão associados a resistência a antifúngicos em fungos patogénicos mais propriamente, Candida albicans: sobre-expressão dos genes CDR1, CDR2 e MDR1 que codificam para bombas de efluxo; alterações no nível de expressão ou mutações pontuais no gene ERG11, que codifica para a proteína alvo dos antifúngicos azoles, lanosterol 14 -desmetilase, envolvida na via biossintetica do ergosterol. Com o presente trabalho pretendeu-se esclarecer o(s) mecanismo(s) de resistência associados a um grupo alargado de estirpes clínicas de C. albicans procedendo a estudos fenotípicos e de expressão génica. Foram utilizadas 5 estirpes controlo e 62 estirpes clínicas de C. albicans (isoladas de diferentes produtos biológicos). Procedeu-se à determinação do fenótipo das estirpes controlo e clínicas, através do protocolo padrão do CLSI M27-A2, estabelecendo-se a concentração inibitória mínima para os antifúngicos fluconazole, itraconazole e voriconazole, na presença e ausência do ibuprofeno (100µg/ml). Para além disto, foi testada a hipótese de reversão de resistência devido a efluxo, por citometria de fluxo, usando o marcador fluoresecente FUN-1, descrito como marcador de efluxo. Em seguida, procedeu-se à optimização dos protocolos para a detecção e quantificação da expressão dos genes alvo CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, por PCR em Tempo Real. Diferentes parâmetros de reacção foram ensaiados para obtenção de curvas padrão, com valores de eficiência e erro dentro dos limites de referência, para assegurar a fiabilidade dos ensaios realizados. O gene ACT1 que codifica para a actina foi usado como gene normalizador dos níveis de expressão. A maioria das estirpes clínicas de C. albicans, resistentes a múltiplos azoles apresentaram uma sobre-expressão significativa dos genes CDR1 e principalmente CDR2, quando comparados com o gene ERG11; nestas o ibuprofeno induziu a reversão de resistência, aumentando a coloração pelo FUN-1. Nas 2 estirpes em que não ocorreu reversão do fenótipo resistente, o ibuprofeno não aumentou a fluorescência das células marcadas com FUN-1; para além disso, o aumento da expressão dos genes não se limitou ao CDR1 e CDR2 mas foi também significativa para o gene ERG11. De referir que a estirpe controlo 12-99 com múltiplos mecanismos de resistência descritos, não reverteu o seu fenótipo resistente na presença do ibuprofeno. Não foi detectada expressão do gene MDR1 em qualquer uma das estirpes clínicas resistentes. Estirpes com múltiplos mecanismos de resistência não reverteram pelo que o ibuprofeno parece ser um potencial bloqueador de efluxo de antifúngicos. A técnica de PCR em Tempo Real é um método prático e sensível em estudos de expressão génica, assim como o uso de SYBR Green é fiável, apesar de ser um marcador inespecífico, quando se insere em cada ensaio uma curva de fusão. / 2. Abstract Several resistance mechanisms are associated to antifungal resistance in pathogenic fungi, namely C. albicans: over-expression of CDR1, CDR2 and MDR1 genes encoding for eflux pumps; alterations in gene expression levels or point mutations in ERG11 gene, encoding for the azoles target enzyme lanosterol 14 - demethylase, associated to ergosterol biosynthesis. The aim of the present work was to uncover the resistance mechanisms in a large group of clinical C. albicans strains, performing phenotypic and gene expression studies. Five control strains and 62 clinical strains of C. albicans were used. Standard protocol from CLSI M27-A2 was used to determine the susceptibility phenotype calculating minimal inhibitory concentration for the antifungals fluconazole, itraconazole and voriconazole, with and without ibuprofen (100µg/ml). Also, reversion by efflux hypothesis was tested by flow cytometry, using as fluorescent marker FUN-1, known as an efflux marker. Next, real time PCR protocols for detection and quantification of the target genes CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, were optimized. Different reaction parameters were tested, to achieve values of efficiency and error obtained from standard curves, according to reference values, to ensure accuracy. ACT1 gene, which encodes for actin was used as normalizing gene for the gene expression levels. Most clinical strains resistant to all tested azoles showed a significant over-expression of CDR1 and specially CDR2 when compared to ERG11; in these strains ibuprofen induced the reversion of resistance and an increase in FUN-1 fluorescence. The 2 strains that did not revert their phenotype, ibuprofen did not increase the fluorescence of cells stained with FUN-1 and gene over-expression was not only for CDR1 and CDR2 but mostly for ERG11 gene. It should be stressed that C. albicans control strain 12-99 with known multiple resistance mechanisms did not revert the resistance phenotype in the presence of ibuprofen. MDR1 expression was not detected in none of the C. albicans clinical strains. Strains with multiple resistance mechanisms did not revert, wich might indicate that ibuprofen could be a potential antifungal efflux blocker. Real Time PCR is easily available and a sensitive method for gene expression studies, and also SYBR Green is acceptable, although being an unspecific marker, when a melting curve is added in each assay.
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Molecular dissection of CLASPs function in mitosis: A proteomic approach

Maia, Ana Rita Ramada 09 October 2007 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / CLASPs são proteínas altamente conservadas que participam na segregação dos cromossomas através do seu papel fundamental na interface cinetocoro-microtúbulo durante a mitose. Em levedura, Drosophila, e Xenopus, um único ortólogo da CLASP está presente, o qual é necessário para a formação do fuso mitótico através da regulação da dinâmica dos microtúbulos a nível do cinetocoro. Em mamíferos, no entanto, somente a CLASP1 tem sido implicada na divisão celular, apesar da existência de um segundo parólogo, CLASP2. Neste estudo descrevemos a localização mitótica da CLASP2 humana em células HeLa e mostramos que a sua localização nos cinetocoros, centrossomas, e fuso durante toda a mitose é notavelmente semelhante à CLASP1. A análise de fibroblastos embrionários de ratinho KO para a Clasp2 revelou que a localização da CLASP1 no cinetocoro e a resposta do checkpoint da Mad2 não estão comprometidos pela ausência de CLASP2. Para melhor compreender as funções das CLASPs em mitose, nomeadamente para determinar potenciais funções redundantes, nós realizamos a depleção de cada CLASP por RNAi. Notavelmente, a depleção isolada de cada CLASP não induziu qualquer erro significativo na mitose; a redução dos níveis de ambas as CLASPs por RNAi causou severos defeitos mitóticos a nível do fuso (principalmente células com fusos multipolares), e conteúdo anormal de DNA (aneuploidia). No geral, estes resultados sugerem que CLASP1 e CLASP2 possuem papéis sobreponíveis durante a mitose. A fim de compreender os mecanismos moleculares subjacentes à função das CLASPs humanas durante a mitose, nós realizamos um estudo proteómico para a identificação das proteínas interactoras da CLASP1 durante a mitose através de espectrometria de massa. Os nossos resultados confirmaram as interações entre CLASP1 - CLIP-170 e LL5ß, ambos descritas em interfase. Além disso, novas interacções foram encontradas como CENP-E, Astrin, GCC185, CENP-J/CPAP, MARK2 e a nova proteína KIAA0802. Em células interfásicas, as CLASPs acumulam-se no aparelho de Golgi e esta acumulação está relacionada com a presença de microtúbulos estabilizados. No entanto, há pouca informação a respeito da função de Golgi durante a mitose. A análise da distribuição mitótica da GCC185 mostrou que em estadios precoces a GCC185 localiza-se em torno dos centrossomas, e dispersa-se em metafase e anafase. Em telofase, a GCC185 relocaliza-se na região perinuclear e nos centrossomas. De notar que nós encontramos um co-localização extensiva entre a GCC185 e a CLASP1 (especialmente em profase, prometafase e telofase). A interacção entre a GCC185 e a CLASP1 foi também confirmada em extractos celulares interfásicos. Finalmente, muitas +TIPs como o APC, CLIP-170/Restin e EB1 têm sido implicadas em processos de aneuploidia e tumorigénese, formando uma complexa rede proteica com as CLASPs. Para determinar as implicações da CLASP1 nos mecanismos de tumorigénese, realizamos uma pesquisa mutacional numa linha celular humana derivada do carcinoma do cérvix (células HeLa). Na nossa análise mutacional encontramos três deleções: duas correspondem a isoformas da CLASP1 resultantes de splicing alternativo (737 1538 e 1125 1164), e a terceira deriva da perda parcial do exão 21 (673 679). Estas mutações podem estar relacionadas à instabilidade dos cromossomas que conduz a mutações aleatórias, ou podem reflectir que o gene CLASP1 é um alvo principal para mutações. Estes resultados incentivam a um exame maior para mutações da CLASP noutras linhas celulares tumorais e tumores primários. No geral, nós encontramos que a CLASP1 e CLASP2 possuem papéis redundantes durante a mitose, cuja ausência pode originar diversos defeitos mitóticos, conduzindo em último efeito à aneuploidia. Adicionalmente, descobrimos novas interacções moleculares com importantes proteínas mitóticas e fornecemos a ligação molecular entre a função da CLASP e o papel desconhecido do aparelho de Golgi durante a mitose. / CLASPs are well-conserved microtubule plus-end-tracking proteins that participate in chromosome segregation through their key role at the kinetochore-microtubule interface. In yeast, Drosophila, and Xenopus, a single CLASP orthologue is present, which is required for mitotic spindle assembly by regulating microtubule dynamics at the kinetochore. In mammals, however, only CLASP1 has been directly implicated in cell division, despite the existence of a second paralogue, CLASP2. Here we describe the mitotic localization of human CLASP2 in HeLa cells and show that its localization at kinetochores, centrosomes, and spindle throughout mitosis is remarkably similar to CLASP1. Analysis of Clasp2 KO mouse embryonic fibroblasts revealed that CLASP1 kinetochore localization and Mad2 checkpoint response is not compromised in the absence of CLASP2. To further understand CLASP roles in mitosis, namely to rule out potential redundant functions, we performed single CLASP depletion by RNAi. Remarkably, single CLASP depletion caused no significant impairment of mitosis, while reducing the levels of both CLASPs by RNAi caused severe mitotic spindle defects (mainly cells with multipolar spindles), and abnormal DNA content (aneuploidy). Overall, these results suggest that CLASP1 and CLASP2 play overlapping roles during mitosis. In order to understand the molecular mechanisms underlying the function of human CLASPs during mitosis, next we performed a proteomic study for the identification of CLASP1 interacting proteins during mitosis by mass-spectrometry. Our results confirmed the interactions between CLASP1 CLIP-170 and LL5ß, both described in interphase. Moreover, new interactors were found such as CENP-E, Astrin, GCC185, CENP-J/CPAP, MARK2 and the novel protein KIAA0802. In interphase cells, CLASPs accumulate at the Golgi apparatus and this accumulation is related to the presence of stabilized microtubules. However, there is little information concerning Golgi function during mitosis. Analysis of GCC185 mitotic distribution showed that in early stages GCC185 localizes around centrosomes, and disperses in metaphase and anaphase. In telophase, GCC185 re-localizes to the perinuclear region and centrosomes. Noteworthy, we found an extensive co-localization between GCC185 and CLASP1 (especially in prophase, prometaphase and telophase). The interaction between GCC185 and CLASP1 was also confirmed in interphase cell extracts. Finally, many +TIPs like APC, CLIP-170/Restin and EB1 have previously been implicated in aneuploidy and tumourigenesis, forming a complex protein network with CLASPs. To determine the implications of CLASP1 for the mechanisms of tumourigenesis, we performed a mutational screening in a human cell line derived from cervix carcinoma (HeLa cells). In our mutational analysis we found three deletions: two of them correspond to CLASP1 alternative spliced isoforms (737 1538 and 1125 1164), and the third derives from the partial loss of exon 21 (673 679). These mutations could be related to chromosomal instability leading to random mutations, or may reflect that CLASP1 gene is a main target for mutations. These results encourage a larger survey for CLASP mutations in other tumour cell lines and primary tumours. Overall, we found that CLASP1 and CLASP2 play redundant roles during mitosis, whose absence can originate several mitotic defects, and ultimately lead to aneuploidy. Additionally, we uncovered new molecular interactions with important and novel mitotic proteins and provided the molecular linkage between CLASP function and the still mysterious role of the Golgi apparatus during mitosis.
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Integration of stimulatory and inhibitory signals in pituitary tumor cells through the PI3K pathway

Colaço, Tânia Cristina Antunes 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Expressão da Ciclina D1 em células mononucleares fagocitárias (PBMCs): um estudo em doentes com hemocromatose hereditária e controlos

Almeida, Susana Paula Pinto de 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine
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Tyrosine phosphorylation profile of Listeria monocytogenes infected cells:Identification of new host factors hijacked to promote infection

Almeida, Maria Teresa da Conceição Malheiro Pinto de 07 February 2011 (has links)
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine

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