Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / A caderina-E é uma glicoproteína calcio-dependente que medeia a adesão célula-célula, e é fundamental na manutenção da polaridade celular, no crescimento celular e diferenciação. O envolvimento da caderina-E no desenvolvimento tumoral foi amplamente demonstrado, com vários carcinomas humanos a exibir redução da sua expressão proteica. Em carcinomas gástricos, a expressão de caderina-E é diminuída ou mesmo perdida em cerca de metade dos casos do tipo difuso. Mutações germinativas no gene CDH1, que causam perda de função da proteína, foram identificadas como a causa genética em um terço dos casos do síndrome HDGC. Durante a progressão tumoral, a perda da expressão ou função da caderina-E pode provocar o aumento da motilidade celular, a diminuição da adesão célula-célula, e como culminar em invasão tecidular. Recentes linhas de investigação sugerem um ainda maior envolvimento da caderina-E no processo tumorigénico, graças à uma hipotética modulação das vias de sinalização intracelular. Para investigar a possível capacidade da caderina-E modular vias de sinalização intracelular e para compreender se essa capacidade é alterada ou perdida pela presença de mutações do tipo substituição em diferentes domínios da proteína, infectamos uma linha celular humana que não expressa caderina-E com diferentes formas da proteína a forma nativa, uma forma com uma mutação na região extracelular e uma forma com uma mutação no domínio intracelular. Os putativos efeitos foram avaliados pela análise da expressão de proteínas, e suas formas activas, centrais na sinalização de quatro vias envolvidas na proliferação e sobrevida celular, na adesão célula-matriz e na invasão. Nós demonstramos que a expressão de caderina-E nativa inibe a sinalização de PI3K e dos RTKs, muito provavelmente com o contributo do domínio extracelular. Os nossos resultados revelam que a actividade proteolíticas das MMPs e a sinalização intracelular dependente das FAK diminuiu na presença da forma normal da caderina-E. Quanto às mutações, apesar de provocarem os mesmos efeitos em termos de invasão, motilidade e malignidade, no nosso estudo produziram desfechos opostos. Os resultados obtidos para a mutação extracelular assemelharam-se aos obtidos nas células sem caderina-E, enquanto as observações retiradas das células com a mutação intracelular se aproximaram mais das obtidas nas células com a forma nativa. Como conclusão, os nossos resultados demonstram que a caderina-E tem um papel mais alargado na célula, nomeadamente na modulação de vias de sinalização. Tal capacidade pode contribuir ainda mais para o desenvolvimento tumoral, através de efeitos na proliferação, sobrevida, adesão e motilidade celular bem como invasão tecidular. Apesar de estes serem dados muito preliminares, revela-se promissora a possibilidade de estarmos perante a identificação das causas de malignidade associadas às formas mutadas na região extracelular de caderina-E. A confirmar-se tal hipótese, seria de particular importância para o tratamento de neoplasias gástricas. / E-cadherin is a calcium-dependent glycoprotein that mediates cell-cell adhesion and is important in differentiation, cell growth and maintenance of cell polarity. The involvement of E-cadherin in tumour development has been extensively demonstrated, with many human carcinomas exhibiting reduced E-cadherin expression. In gastric cancer, the protein is abnormally expressed in more than half of the cases of the sporadic diffuse subset. Furthermore, germline loss-of-function mutations in the CDH1 gene were shown to represent the genetic cause of approximately 1/3 of HDGC cases. During tumourigenesis, loss of E-cadherin expression and/or function can lead to increased cell motility, cell-cell detachment and, ultimately, to invasion. Moreover, recent evidences point for the possible involvement of the protein in modulating intracellular signalling and thus have a contribution during initial stages of tumour development. To investigate the hypothesis that E-cadherin modulates intracellular signalling and to understand to what extent two germline mutations localized in different domains of E-cadherin and identified in HDGC cases maintain normal function, we transduced Wild-type, extracellular-mutated and intracellular-mutated forms of E-cadherin to a cell that does not express the protein. We analyzed expression and putative activity changes to key proteins of four signalling pathways implicated in cell survival, proliferation, cell-matrix adhesion and invasion. We demonstrate that expression of Wild-type E-cadherin inhibits PI3K and RTKs signalling, a capacity most likely dependent on the extracellular domain. We show that MMPs activity and FAK-dependent intracellular signalling is decreased with the expression of normal E-cadherin. Finally, and despite similar outcomes in terms of invasion, motility and overall malignancy, missense mutations localized in different domains of E-cadherin render opposite effects in intracellular signalling. Results obtained for the extracellular mutation were comparable to the lack of protein situation. In contrast, cells with the intracellular mutation behaved more similarly to Wild-type cells. Taken together, our results show that E-cadherin modulates intracellular signalling. These novel properties may contribute to tumour development by influencing cell proliferation and survival, cell adhesion, motility and invasion. Although these are preliminary findings, the possibility that causes for malignancy associated with mutations localized at the extracellular domain of E-cadherin may have been identified is very promising, in particular for gastric neoplasias treatment.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Papel do Imatinib na Angiogénese de Cancro da Mama Hormono-dependente Em estudos anteriores decobrimos que a progesterona é capaz de induzir a expressão do factor de crescimento A derivado das plaquetas (PDGF-A) em células humanas de cancro da mama (células MCF7). Sabendo que o PDGF tem um papel relevante na angiogénese, e que o imatinib tem como alvo o receptor de tirosina-cinase do PDGF (PDGFR), o objectivo do presente trabalho foi examinar o efeito do imatinib em células MCF7, células de músculo liso de aorta humana (HAoSMC) e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) tratadas com progesterona. A expressão do PDGFR- fosforilado (activado) foi detectada em células MCF7 e HAoSMC, e, de forma muito ténue, em HUVEC. Os efeitos do imatinib no crescimento celular, apoptose e migração foram então analisados. Nas células MCF7 o imatinib inibiu efectivamente a formação de colónias e a viabilidade celular, avaliada por MTT. A corroborar estes resultados foram também encontrados aumentos significativos na percentagem de células apoptóticas após incubação, das células MCF7, com imatinib. Surpreendentemente, estes efeitos inibitórios foram todos aumentados pela presença de progesterona. Os ensaios de migração celular em células MCF7 também mostraram uma redução na capacidade de migração após tratamento com imatinib. Em concordância com a falta de PDGFR- activo, o imatinib não foi capaz de prevenir o crescimento, sobrevivência e migração das HUVEC. Em contraste, a viabilidade e proliferação das HAoSMC, avaliadas por MTT e BrdU respectivamente, foram inibidas pelo imatinib. Foi ainda encontrado um aumento significativo na percentagem de células HAoSMC apoptóticas após incubação com imatinib. Os ensaios de migração celular mostraram também uma redução na capacidade migratória após tratamento com o fármaco. Todos estes resultados revelam que o imatinib é capaz de afectar a sobrevivência, crescimento e migração de células MCF7 e HAoSMC. Além disso, a incubação com progesterona parece sustentar a actividade do PDGFR- , promovendo, nestas células, a acção inibitória do imatinib. Assim, este estudo indica que o imatinib pode ser um bom agente terapêutico em cancro da mama hormono-dependente e, possivelmente, contra outras patologias vasculoproliferativas, como a ateroesclerose, em que também existe um crescimento anormal de células do musculo liso. Ramo de especialização: Angiogénese / In previous studies, we found that progesterone was able to induce the expression of platelet-derived growth factor A (PDGF-A) in human breast cancer MCF7 cells. Knowing that PDGF plays a relevant role in angiogenesis, and that imatinib mesylate targets PDGF receptor tyrosine kinase activity, the aim of the present study was to examine the effects of imatinib on progesterone-treated MCF7 cells, Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) and Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Expression of phosphorylated (activated) PDGFR- was detected in MCF7 cells and HAoSMC, but in a very low extent in HUVEC. The effects of imatinib on cell growth, apoptosis and migration were then analyzed. In MCF7 cells imatinib effectively inhibited anchorage-dependent colony formation, and cell viability as evaluated by MTT assay. Corroborating these findings, a significant increase in the percentage of apoptotic cells was observed when MCF7 cells were treated with imatinib. Surprisingly, these inhibitory effects were all enhanced by the presence of progesterone. Cell migration assays in MCF7 cells did also show a reduction in the migratory capacity after incubation with imatinib. In agreement with the lack of active PDGFR- , imatinib was unable to prevent HUVEC growth, survival or migration ability. In contrast, HAoSMC viability and proliferation were effectively inhibited by imatinib, as evaluated by MTT and BrdU assay, respectively. Supporting these findings, a significant increase in the percentage of apoptotic HAoSMC was also observed after treatment with imatinib. Cell migration assays did also show a reduction in the migratory ability after incubation with imatinib. Altogether, these facts reveal that imatinib is able to affect MCF7 and HAoSMC survival, growth and migration. Furthermore, incubation with progesterone seems to sustain PDGFR activity, prompting these cells to the inhibitory action of imatinib. Our findings indicate that imatinib might be a good therapeutic agent in progesterone-dependent breast cancer and, possibly, against other vascular-associated disorders, such as atherosclerosis, that carry in common smooth muscle cells abnormal growth.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Os oncocitomas renais são constituídos por células cujo citoplasma contém numerosas mitocôndrias, morfológica e bioquimicamente anormais (células oxifílicas, oncocíticas ou células de Hürthle). Tumores com fenótipo oncocítico, condicionado pela acumulação de mitocôndrias, podem ocorrer em diversos órgãos, preferencialmente em tecidos com baixo índice proliferativo. Na tireóide, onde são denominados tumores de células de Hürthle, foram identificadas alterações do ADN mitocondrial (mtDNA) e de um gene nuclear que codifica uma proteína mitocondrial (GRIM-19), com diferenças significativas em comparação com tumores não oncocíticos. Nos oncocitomas renais não há, até à data, estudos que descrevam a ocorrência destas alterações. A acumulação de mitocôndrias no citoplasma das células pode ser consequência de uma alteração primária no mtDNA que codifica enzimas mitocondriais, ou provocada por mutações no ADN nuclear (nDNA) que codifica proteínas mitocondriais. Na tentativa de perceber melhor a tumorigénese dos tumores oncocíticos em geral e dos oncocitomas renais em particular, estudámos uma série de 14 oncocitomas renais e o parênquima renal não neoplásico adjacente, no que diz respeito a algumas alterações do mtDNA e do nDNA. Foi efectuada a reavaliação do material anátomopatológico e fez-se extracção de ADN dos tecidos obtidos após microdissecção do material incluído em parafina. Foram pesquisadas alterações do mtDNA como a delecção comum, mutações na região D-loop e nas subunidades 6 e 8 do complexo V (ATPase). As alterações do GRIM-19 foram avaliadas por estudo imuno-histoquímico. A delecção comum foi detectada em 78,6% dos oncocitomas renais e em 50% dos casos também no parênquima não neoplásico. Verificou-se instabilidade na região não codificadora D-loop em 42,9% dos tumores. Foram identificadas mutações somáticas da ATPase 6 e/ou 8 em 14,3% dos casos. A expressão de GRIM-19 nos oncocitomas renais foi discretamente menos intensa do que a observada nas células dos túbulos proximais adjacentes. As alterações encontradas no mtDNA de oncocitomas renais não se afastam substancialmente das observadas anteriormente no estudo de tumores de células de Hürthle da tireóide, tanto no que diz respeito ao tipo de alterações, como à sua frequência. Estudo das alterações do ADN mitocondrial e do GRIM-19 em oncocitomas renais: Comparação com os tumores de células de Hürthle da tireóide 2 A homogeneidade celular fenotípica dos oncocitomas renais e a notável transformação oncocítica observada no parênquima renal não neoplásico na maioria (12/14) dos casos estudados leva a presumir que o evento carcinogénico deverá ter ocorrido numa célula com anomalia prévia do mtDNA ou do nDNA que codifica enzimas mitocondriais. Esta hipótese é favorecida pela existência da delecção comum no parênquima renal não neoplásico numa maior percentagem de casos (50%) que a observada no parênquima não neoplásico tireoideu nos casos de tumores de células de Hürthle (25-33%). É possível que a delecção comum seja um marcador das alterações que ocorrem na biogénese mitocondrial nestas condições. As mutações na ATPase 6 parecem ocorrer preferencialmente nos tumores de células oxifílicas, pelo menos do rim e da tireóide. Os nossos resultados não favorecem a existência de um papel determinante para a instabilidade na região não codificadora D-loop na transformação oncocítica, apesar dessa alteração estar presente em 42,9% dos tumores. É provável que as mutações na região D-loop resultem, sobretudo, da produção aumentada de espécies reactivas de oxigénio pelas células tumorais em geral. A função principal do GRIM-19 na tumorigénese renal não parece estar relacionada com a cadeia respiratória mitocondrial, ou pelo menos, não parece estar relacionada com o fenótipo oncocítico, uma vez que a expressão de GRIM-19 está significativamente mais afectada nos carcinomas de células renais que nos oncocitomas. / Renal oncocytomas are composed by cells whose cytoplasm is packed with an abnormally high mumber of biochemically and morphologically deficient mitochondria (oxyphilic, oncocytic or Hürthle cells). Tumours with an oncocytic fenotype, resulting from mitochondria accumulation, may occur in many organs, predominantly in tissues with low proliferation index. In the thyroid, where they are called Hürthle cell tumours, our group has identified alterations in the mitochondrial DNA (mtDNA) and in a nuclear gene that encodes for a mitochondrial protein (GRIM-19), with significant differences when compared to non-oncocytic tumours. Regarding renal oncocytomas there are no publications describing the occurrence of such alterations. The mitochondria accumulation in the cytoplasm of cells may be the result of a primary alteration in mtDNA that encodes for mitochondrial enzymes, or it can be a consequence of mutations in nuclear DNA (nDNA) that encodes for mitochondrial proteins. In an attempt to contribute to a better understanding of the tumourigenesis of oxyphilic cell tumours in general and of renal oncocytomas in particular, we studied 14 renal oncocytomas and the respective non neoplastic parenchyma regarding some mtDNA and nDNA alterations. The cases were reviewed and DNA extraction was performed in microdissected tissues obtained from the paraffin-embedded material. We searched for mtDNA alterations such as the common deletion, mutations in the D-loop non codifying region and in the subunits 6 and 8 of complex V (ATPase). GRIM-19 alterations were evaluated by immunohistochemistry. The mtDNA common deletion was detected in 78.6% of renal oncocytomas and in 50% of the cases in the respective non neoplastic parenchyma. Instability in the Dloop region was detected in 42.9% of the tumours. We identified somatic mutations in ATPase 6 and/or 8 in 14,3% of the cases. GRIM-19 expression was slightly less intense in the oncocytomas than in the adjacent proximal renal tubules. Our results do not differ substantially from those obtained in Hürthle cell tumours of the thyroid, namely in the kind of alteration and its relative frequency. The homogenous cellular fenotype of renal oncocytomas and the obvious oncocytic transformation observed in the non neoplastic renal parenchyma in most of the studied cases (12/14) indicates that the carcinogenic event must have occurred in a Estudo das alterações do ADN mitocondrial e do GRIM-19 em oncocitomas renais: Comparação com os tumores de células de Hürthle da tireóide 4 cell with a previous anomaly of mtDNA and/or nDNA that encodes for mitochondrial enzymes. This hypothesis is favoured by the presence of the common deletion in a higher percentage of the non-neoplastic parenchyma of oncocytomas (50%) than in nonneoplastic thyroid parenchyma in the cases of Hürthle cell tumours (25-33%). It is possible that the common deletion may be an indirect biomarker of the alterations occurring in mitochondrial biogenesis in these conditions. Mutations in ATPase 6 seem to occur predominantly in oxiphylic cell tumours, at least in kidney and thyroid. Our results do not favour the existence of a determinant role for the instability of the non codifying D-loop region in the oncocytic transformation, despite finding such alterations in 42.9% of the tumours. It is probable that mutations in the D-loop region are mainly the result of increased reactive oxygen species production by tumoural cells in general. The main role of GRIM-19 in renal tumourigenesis does not seem to be related to the mitochondrial respiratory chain, or at least, does not seem to be related with oncocytic features, since the expression of GRIM-19 is significantly more affected in renal cell carcinomas than in oncocytomas.

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