Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / O sistema Fas/FasL é uma das vias de apoptose mais importantes, sendo essencial na regulação da proliferação celular e do crescimento tumoral. Polimorfismos funcionais nos promotores dos genes do receptor Fas (FAS 670A/G) e no seu ligando (FASL 844T/C) parecem alterar a transcrição destes genes. Ainda não foi estudado o papel dos polimorfismos FAS 670A/G e FASL 844T/C no cancro da próstata. Recorrendo à técnica de PCR RFLP foram analisadas amostras de DNA de 936 indivíduos do sexo masculino: 657 dos quais pacientes com carcinoma da próstata e 247 dadores sem doença oncológica. Os resultados deste estudo mostram um efeito protector nos portadores dos genótipos AG e GG do polimorfismo FAS 670 para invasão extra-capsular. Os indivíduos portadores do alelo G possuem uma protecção de 72% para doença avançada. Foi também demonstrada uma associação estatisticamente significativa entre o genótipo CC do polimorfismo FASL 844 e níveis de PSA elevados. Estes resultados sugerem que o alelo G do polimorfismo FAS 670 poderá reduzir os níveis de sFAS, que resulta de splicing alternativo do gene FAS, evitando assim o efeito inibidor da apoptose desta forma solúvel. Por outro lado, o genótipo CC do polimorfismo FASL 844 parece aumentar a apoptose das células tumorais de carcinoma da próstata, reduzindo os níveis de PSA. Assim, os polimorfismos dos genes FAS e FASL poderão estar envolvidos no desenvolvimento do carcinoma da próstata. / The Fas/FasL system is one of the major pathways in apoptosis and is important in the regulation of cell proliferation and tumor cell growth. Functional promoter polymorphisms on Fas receptor gene (FAS 670A/G) and in its ligand (FASL 844T/C) alter their transcriptional activity. The role of FAS and FASL polymorphisms in prostate cancer has not been studied. Using the PCR-based restriction fragment-length polymorphism methodology, FAS gene locus -670 and FASL gene locus -844 genotypes were evaluated in DNA samples from 936 men: 674 prostate cancer patients and 262 healthy controls. It was found that FAS 670 AG and GG genotypes represent a significantly protection for extra-capsular invasion. Taken together, these data show a significantly 72% protection was found for G allele carriers. A protective association between FASL 844 CC genotype for higher PSA levels was also found. It is well known that FAS 670 G allele reduces the transcriptional activity of FAS gene and FASL 844 CC genotype is associated with higher expression of FasL. It can be suggested that FAS 670 G allele may reduce sFas levels, which derive from FAS gene by alternative splicing, preventing the apoptotic inhibition caused by the soluble form. On the other hand, FASL 844 CC genotype appears to enhance apoptosis of prostate cancer cells reducing PSA levels. Therefore, FAS and FASL polymorphisms might be involved in prostate cancer development.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Os tumores mamários espontâneos são as neoplasias mais frequentes na cadela, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica. Aproximadamente metade de todos os tumores mamários em cães são malignos, apresentando um elevado potencial de metastização para nódulos linfáticos ou outros órgãos, como, por exemplo, o pulmão. A transformação maligna está associada a uma glicosilação anormal, o que resulta na síntese e expressão alterada de determinantes de carbohidratos. Grande parte da investigação em humanos sobre cancro da mama é efectuada em linhas celulares estabelecidas de carcinoma da mama, como modelos in vitro, uma vez que têm a capacidade de proliferar indefinidamente. Contudo, tendo em conta que a interacção entre o tumor e o organismo deve ser considerada, subsiste a necessidade de confirmação dos resultados em modelos animais. De forma a aprofundar o conhecimento da biologia dos tumores da mama de cadela, foram estabelecidos dois modelos experimentais, um in vitro e outro in vivo. Na primeira parte do trabalho, foram estabelecidas três linhas celulares de tumores mamários caninos um adenoma e dois carcinomas complexos partindo de fragmentos de tumores colhidos, no acto da cirurgia. Observou-se a presença de células do tipo epitelial e mioepitelial, após imunomarcação in vitro para os filamentos intermediários. Após a heterotransplantação destas linhas celulares em ratinhos nude, verificou-se que elas não eram tumorigénicas. Numa segunda parte do trabalho, foi feita a caracterização in vitro e in vivo de uma linha celular previamente estabelecida, derivada de um carcinoma ductal infiltrativo de mama de cadela. As células aderem ao fundo do frasco como uma fina monocamada, possuem um tempo de duplicação de 32,6±1,4 horas e, quando crescem em agar, formam um agregado único e volumoso. Os ensaios de mobilidade celular mostraram que estas células conservam a sua arquitectura tipo célula epitelial e têm a capacidade de se mover entre as duas margens de uma lesão artificial de forma compacta e unidireccional. Estas células apresentam imunoreactividade para a E-caderina e um índice de proliferação elevado. Um painel de anticorpos para os filamentos intermediários foi usado para determinar a origem da linha celular, observando-se uma intensa imunoreactividade para a citoqueratina AE1/AE3, característica das células epiteliais. A CK14 é expressa em 25-50% das células e a vimentina também apresenta um elevado nível de expressão, que se encontra descrito como normal em células em cultura. Estas células têm também imunomarcação para os carbohidratos sLex, Lex e Lea, podendo esta expressão aberrante ter um papel fundamental nos mecanismos de metastização à distância, facilitando a interacção positiva com o órgão alvo e mostrar-se relevante como marcador tumoral de prognóstico. Ensaios in vivo demonstraram que estas células cresciam quando inoculadas subcutaneamente no panículo da glândula mamária de ratinhos nude fêmeas. As massas tumorais eram histologicamente idênticas às lesões tumorais da mama de onde derivavam e, quando os tumores heterotransplantados foram colocados em cultura, a expressão dos filamentos intermediários e dos carbohidratos não se alteraram. De forma a identificar os tecidos metastáticos alvo, foi feita a injecção endovenosa na veia caudal dos ratinhos, observando-se metastização para os nódulos linfáticos, pulmão, coração, baço, rim e fígado. A tumorigenicidade e metastização observada nos ratinhos nude, bem como a mobilidade da linha celular in vitro, propõem um fenótipo agressivo para estas células. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os tumores mamários caninos constituem um excelente modelo para o estudo do cancro da mama humano. / Spontaneous mammary tumors are the most common neoplasia in the female dog and have a high biological and histomorphological heterogeneity. Approximately one-half of all mammary tumors in dogs are malignant and have a great potential to metastasize to the regional lymph nodes or other organs such as the lungs. Malignant transformation is associated with abnormal glycosylation, resulting in the synthesis and expression of altered carbohydrates determinants. In humans, the majority of breast cancer research is conducted using established breast cancer cell lines as in vitro models because they have the ability to proliferate indefinitely. However, the interaction between the tumor and the host organism must be taken into consideration, so the results need to be confirmed using animal models. In order to have an in depth view of the biology of canine mammary tumors, two experimental models, one in vitro and another in vivo, were established. In the first part of this work, three canine mammary carcinoma cell lines were established - one complex adenoma and two complex carcinomas - using fragments of tumors excised during a surgical procedure performed on a female dog. After the in vitro immunostaining for intermediate filaments, the presence of epithelial and mioepithelial cells was determined. When these cell lines were heterotlansplanted in nude mice it was noted that they were not tumorigenic. In the second part of the work an in vitro and in vivo characterization of a previously established cell line was made, derived from a canine mammary ductular carcinoma. These cells adhered to the bottom of the flask as a compact thin monolayer, had a doubling time of 32,6±1,4 hours and when they were grown in agar they formed a unique large aggregate. Cell motility assay showed that these cells conserved an epithelial-like architecture and had the ability to move between the edges of an artificial wound in a compact front of migration, with the cells moving unidirectionally. These cells had immunoreactivity for E-cadherin and showed a high proliferative index. A panel of antibodies for intermediate filaments was used to evaluate the origin of the cell line and it showed intense immunoreactivity for AE1/AE3 keratin which is a characteristic feature of epithelial cells. CK14 was expressed in 25-50% of the cells and vimentin also showed a high level of expression, which can be normal in culture tissues. These cells also immunostained for the carbohydrates sLex, Lex and Lea, and this aberrant expression may also play a fundamental role in the molecular mechanisms of metastization to distant organs, facilitate positive interactions within the target organ and could be useful as a prognostic tumour marker. In vivo assays showed that these cells grew when inoculated subcutaneously in the mammary fat pad of female nude mice. Tumour masses were histologically identical to the mammary tumour lesions they derived from, and when heterotransplanted tumours were cultured, the expression of intermediate filaments and carbohydrates was not altered. To look for metastatic target tissues we performed an intravenous injection in the tail vein of the mice. These cells metastasized to lymph nodes, lungs, heart, spleen, kidney and liver. The tumorigenicity and metastization observed in nude mice, as well as the motility of this cell line in vitro are suggestive of an aggressive phenotype for these cells. On the whole, the results obtained from this work suggest that canine mammary tumours are good models for the study of human breast cancer.

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Chronic hepatitis C (HC) is a major public health problem because of the number of infected persons (3% of the world population and about 150000 Portuguese individuals) and the potencial to cause cirrhosis, end-stage liver disease, and hepatocelular carcinoma in many of those infected. The most effective treatment (pegylated interferon and ribavirin) has variable response rates, between 45 e 80%, and major side effects. Treatment duration depends on viral genotype and virological response after the first 12 weeks on therapy. Genotype and viral load are independent factors of response. However, the question is why hosts infected with same genotype and similar viral loads have different treatment response rates. Genotype 1, high viral load, higher quasispecies diversity, NS5A interferon determining sensitivity domain variations was associated with lower responses. Others identified host factors for therapy response such as race, gene expression, HLA-DRB and class I alleles and cytokine gene polymorphisms as interferon- , TNF- , interferon response genes. Gene expression analysis by microarrays found 8 genes as response discriminants. Pre-treatment cytokine and supressors of cytokine levels may also correlate with treatment response. Our aim was to analyse if host genetic polymorphisms related to Th1 immune response polarization, hepatic lesion mechanisms and signaling after TCR activation or IFN signaling - OPN, TNF- , ACP1 respectivelly could explain different treatment responses. We also analysed healthy individuals and correlated OPN plasma levels and OPN genotypes. Patients with HCV genotype 1 and 4 were included. Matherial: 95 patients treated with pegylated interferon and ribavirin were selected. Control group included healthy blood donors. HC group was classified according to treatment response type: non responders (NR); end of treatment response and relapse (RR); Sustained response (SR). Absence of SR (NSR) = NR+RR. Methods: Blood was collected for DNA and plasma extraction. Genetic polymorphisms were performed by PCR-RFLP: 8090 OPN (C/T), -308 TNF- (A/G), ACP1 (A/B/C). Plasma OPN concentrations measured by ELISA commercial Kit. Statistical analysis: SPSS vs13. Results: OPN and ACP1 genotype distribution was signifficantly different in subjects with HC in comparison with those of control group. OPN TT genotype, TNF- GG, ACP1 AA and AB are more frequent in HC group. OR for HC was : 2,22 if OPN TT genotype, 1,57 if TNF- AA or AG, and 9,99 if ACP1 with lower phosphatasic activity. 87 CHC patients were infected by genotype 1 virus and 8 by genotype 4. According to treatment response HC subgroups are: 43 NR, 16 RR, 36 SR and 59 NSR. No significant differences were observed between those groups concerning age, sex, viral load, histological activity and fibrosis stages. OPN TT allele carriers predominate in NSR and CC predominate in SR. OR for SR versus NSR is 3,32 if one T allele is present and 0,29 if one C allele is present. TNF- and ACP1 genotypes were not significantly different is those treatment response subgroups. NSR has lower median plasma OPN levels. Also TT genotypes had lower levels. RR patients had the lowest levels plasma OPN levels. Conclusions: our results suggest that both OPN and ACP1 genotypes are related to HC susceptibility. OPN genotype is a host factor related to treatment response and that there is a trend toward higher median plasma OPN levels in responders.

Mestrado em Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular Oncology / O cancro da mama é a causa mais frequente de morte por cancro nas mulheres do mundo inteiro. O objectivo principal deste estudo consistiu na determinação dos níveis de DNA circulante e a avaliação do seu papel na discriminação entre pacientes com cancro e indivíduos saudáveis, e determinação dos níveis de DNA circulante em plasma de pacientes tratados cirurgicamente, através do método quantitativo de PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real. O protocolo standard para a quantificação do DNA livre circulante em plasma foi efectuado em amostras de 175 pacientes com cancro da mama e 80 indivíduos controlo saudáveis. A quantificação foi realizada através da amplificação do gene hTERT (telomerase reverse transcriptase gene) por PCR em tempo real. Foram encontrados níveis mais elevados de DNA circulante livre nos pacientes com cancro, comparando com os indivíduos controlo (105.2 vs 77.06 ng/ml, p<0.001 ). Foram também observadas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de DNA circulante em pacientes antes e após cirurgia (105.2 vs 59.0 ng/ml, p=0.001). A presença de concentrações elevadas de DNA livre em plasma pode constituir um forte factor de risco para presença de cancro da mama, conferindo um risco aumentado para o desenvolvimento da doença (OR, 12.32; 95% CI, 2.09 52.28; p<0.001). Níveis elevados de DNA circulante livre em plasma estão também correlacionados com um decréscimo na sobrevivência global dos pacientes. Não foi, contudo, encontrada nenhuma associação entre os parâmetros clínico-patológicos e as concentrações de DNA circulante livre. Em conclusão, o DNA circulante livre em plasma encontra-se significativamente aumentado em pacientes com cancro da mama, estando associado a um aumento do risco para desenvolver cancro da mama e a um decréscimo no tempo sobrevivência dos pacientes. Deste modo, a quantificação do DNA circulante em plasma através do PCR em tempo real poderá vir a ser uma opção com potencial de aplicabilidade clínica, para a detecção precoce do cancro da mama, complementando outros métodos já existentes na monitorização da doença. / Breast cancer is the leading cause of cancer death in women worldwide. The purpose of our study was to determine whether the amounts of circulating DNA could discriminate between breast cancer patients and healthy individuals by using real-time PCR based DNA quantification methodology and determine the kinetics of circulating plasma DNA in surgically treated patients. Our standard protocol for quantification of cell free plasma DNA involved 175 consecutive patients with breast cancer and 80 healthy controls. The quantification was perfomed by real-time PCR amplification of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT). We found increased levels of circulating DNA in breast cancer patients compared to control individuals (105.2 vs 77.06 ng/ml, p<0.001). We also found statistically significant differences in circulating DNA amounts in patients before and after breast surgery (105.2 vs 59.0 ng/ml, p=0.001). Increased plasma cell free DNA concentration was a strong risk factor for the presence of breast cancer, conferring an increased risk for the development of this disease (OR, 12.32; 95% CI, 2.09 52.28; p<0.001). High levels of plasma DNA were also correlated with a decrease in patients overall survival. There were no association between clinicopathological parameters and concentrations of cell free circulating DNA. In conclusion, cell-free DNA is significantly increased in plasma of breast cancer patients, which is associated with an increased risk for the presence of this disease and decrease of patient s survival. Therefore, quantification of circulating DNA by real-time PCR may be a good and simple tool for early detection of breast cancer with potential to clinical applicability together with other current methods used for monitoring the disease.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Introdução: A activação do sistema dos peptídeos natriuréticos (PN s) desempenha um papel importante nos mecanismos de adaptação renal à expansão de volume. Apesar de estar descrito um aumento da actividade do sistema dos PN s nas situações de redução da massa renal como a uninefrectomia e a insuficiência renal crónica (IRC), o papel deste sistema na progressão da doença renal e no aumento da pressão arterial permanece ainda por esclarecer. O objectivo do presente trabalho foi o de avaliar a modulação renal do sistema dos PN s em modelos experimentais de uninefrectomia e de insuficiência renal crónica. Material e Métodos: Ratos wistar machos (n=66) foram submetidos a uninefrectomia (Unx) ou nefrectomia de ( nx). Duas, 10 e 26 semanas após a cirurgia procedeu-se à avaliação da hemodinâmica cardíaca, dos níveis plasmáticos de BNP, da resposta natriurética à expansão de volume e da expressão renal do receptor efector (RPNA) e do receptor de clearance (RPN-C) dos PN s. Resultados: Os animais Unx e nx apresentaram ao longo do estudo um aumento progressivo da pressão arterial sistólica e diastólica e um aumento sustentado dos níveis plasmáticos de BNP. Verificou-se uma diminuição precoce e sustentada na expressão do RPN-A na medula renal dos animais nx enquanto que os níveis de ARNm do RPN-C aumentaram no córtex renal às 10 e 26 semanas após a cirurgia. Nos animais Unx os níveis de ARNm do RPN-A na medula renal apresentaram-se diminuídos às 10 semanas, mas aumentaram de forma marcada às 26 semanas após a cirurgia. No córtex renal dos animais Unx observou-se também um aumento da expressão do RPN-A às 26 semanas. Conclusões: No rim remanescente dos animais Unx e nx verifica-se uma modulação dependente do tempo do RPN-A e do RPN-C, que é distinta no córtex e na medula renal. A alteração da expressão renal dos receptores dos PN s depende do grau de ablação da massa renal e ocorre independentemente da activação sistémica do sistema dos PN s. Estes resultados poderão contribuir para o esclarecimento do papel desempenhado pelo sistema dos PN s nos mecanismos de adaptação à perda de massa renal.

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