Le contexte scientifique de cette thèse considère l’étude de la voie de signalisation Mos-MEK-MAPK dans l’ovocyte de Xenopus laevis au cours de la transition G2/M du cycle cellulaire. Une approche interdisciplinaire a conduit à l’élaboration d’une analyse, tant expérimentale que théorique de la voie Mos-MEK-MAPK. Une étude bibliographique du sujet a permis d’identifier des articles de référence dans ce domaine. Les articles de Huang, Ferrell (1998) et Angeli et al. (2004) ont procuré une base théorique pour la description des interactions au sein de la voie. Une approche critique du modèle proposé par Angeli et collaborateurs a été produite, au moyen d’une résolution analytique des équations différentielles qui le constitue. Ainsi, l’importance du choix du type de cinétique et des termes qui composent les équations a été démontrée, en particulier pour représenter l’évolution temporelle de Mos. De plus, nous avons démontré que le comportement de la cascade Mos-MEK-MAPK peut être interprété via une approche analytique dans un cadre particulier de valeurs de paramètres. En outre, des résultats inédits quant à l’évolution temporelle de Mos sur de longues périodes de culture après stimulation par la progestérone, ont été observés en présence d’un inhibiteur de MEK, l’U0126. Par ailleurs, la maturation des ovocytes de Xenopus laevis a été stimulée par injection de cytoplasme contenant du MPF en présence ou non de U0126. Des analyses par western blot ont permis d’évaluer l’accumulation au cours du temps de la protéine Mos, et des états de phosphorylation de MEK, MAPK, ainsi que de la cycline B2. Il a été mis en évidence l’importance de l’activation du MPF pour l’accumulation de Mos. Le MPF peut être activé en absence de MAPK et jouer un rôle prépondérant pour l’initiation de la voie de signalisation. Aussi, suite à ces observations expérimentales et l’analyse des modèles existants, un nouveau modèle de la cascade a été proposé, qui prend en compte trois formes différentes de la protéine kinase Mos : une forme inactive instable, une forme active instable et une forme active stable. Aux côtés de la boucle de rétro-contrôle de MAPK qui stabilise la forme active instable, l’interaction entre la forme active instable de Mos et le MPF, qui le stabilise, a été considérée. Cette dernière n’avait jamais pas été utilisée auparavant pour la modélisation de la cascade Mos-MEK-MAPK. Cette approche constitue la première proposition de modèle biologiquement et physiquement réaliste de ce réseau. La paramétrisation du modèle s’est fondée sur trois sources distinctes : (1) des mesures expérimentales trouvées dans la littérature, (2) un choix arbitré par la connaissance du comportement du modèle, (3) des estimations théoriques, à partir de plages fixées expérimentalement. Une analyse des équilibres du modèle par bifurcation a permis de discuter de l’influence des valeurs des paramètres sur le comportement de la cascade. Cette approche permet de produire une prédiction sur le comportement de la cascade en fonction de la variation de concentration de MPF ainsi que sur l’influence de l’intensité de l’interaction entre MAPK et la forme active instable de Mos. Les résultats de simulation obtenus avec le modèle ont été confrontés aux observations issues des expériences. Une bonne corrélation a été observée dans une optique qualitative. / The scientific context of this thesis is based on the study of the signaling pathway Mos-MEK-MAPK in Xenopus laevis ovocytes during the G2/M transition of the cell cycle. An interdisciplinary approach from the biological and physical sciences led us to an experimental and theoretical analysis of the pathway. A bibliographical study identified the key articles related to this field. The articles of Huang, Ferrell (1998) and Angeli et al. (2004) gave us a theoretical basis to describe the interactions within the pathway. A critical analysis of the latter paper has been performed by means of an analytical solution of the differential equations defining the model proposed by Angeli and colleagues. Thus, the importance of the kinetic formulation type and the choice of the mathematical terms of the equations has been underlined ; especially in regard to the time variation of the Mos protein. Moreover, we have proposed an interpretation of the Mos-MEK-MAPK cascade behavior via an analytical approach within the context of the experimental parameter values given by Angeli. In addition, new results regarding to the long time evolution of Mos protein have been recovered when the ovocytes are stimulated with progesterone in presence of MEK inhibitor U0126. Furthermore, ovocytes of Xenopus laevis were stimulated by MPF in presence or absence of U0126. Western blot analysis gave information about the time evolution of Mos accumulation and the states of MEK, MAPK and cyclin B2 phosphorylation. Data showed the importance of MPF in Mos accumulation. In absence of MAPK, MPF is produced and plays an important role in the initiation of the signaling pathway. In contrast to other models, our model has been proposed to take into account three forms of the Mos protein : an unstable inactive state, an unstable active state and a stable active state. The model considers the influence of either MPF and MAPK on the accumulation of the active stable of Mos. The influence of MPF has never been used in previous model of the Mos-MEK-MAPK signaling pathway. Our model is based on a biological and physical point of view. The parametrization of the model is based on : (1) experimental values found in literature, (2) arbitrary values constraints by the known system behavior, (3) theoretical estimations from interval of experimental values. Bifurcation analysis of the system indicated the influence of the parameters values on the system behavior and equilibrium states. This approach produces a prediction for the behavior of the cascade in function of the MPF concentration value. It produces also a discussion for the strength of the interactions between MAPK and the active non-stable form of Mos protein. Simulation results from our model were compared with the experimental observations from our experiments. A good qualitative agreement was found.

Lors de la transition G2/M des ovocytes de Xénope, la voie p39Mos-MEK1-MAPK présente des propriétés dynamiques et physiques particulières telles que l’ultrasensibilité, la bistabilité, l’irréversibilité et un caractère ‘tout-ou-rien’. Ces propriétés sont considérées dans le contexte de la boucle de rétroaction positive qui existe au sein de cette voie. L’objectif de cette thèse s’est focalisé sur le rôle de l’oncoprotéine p39Mos et le recrutement des motifs de régulation qui permettent l’apparition de ces propriétés. Des approches expérimentales et in silico ont été menées pour réaliser une modélisation physiquement et biologiquement réaliste de ce réseau. Le modèle développé tient compte de l’influence du MPF sur l’accumulation de p39Mos et ajuste le rôle de la boucle de rétrocontrôle positif. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence que p90Rsk, cible des MAPK, est dégradée. La voie MAPK a été activée en absence de p39Mos. Nos résultats montrent que la 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) active les MAPK suivant une réponse graduelle et ultrasensible. L’action de la 1,10-PA s’exerce en absence de synthèse protéique et de toute boucle de rétrocontrôle, et nous avons émis l’hypothèse que la 1,10 PA agit via l’inactivation d’une MEK-phosphatase. Dans ce contexte, un modèle de pro-action est discuté et des inhibiteurs de phosphatases ont été utilisés pour activer les MAPK en absence de p39Mos. Nos résultats discutent du rôle de la boucle de rétroaction positive dans l’activation des MAPK et montrent que l’ultrasensibilité de réponse des MAPK peut être générée par des motifs de régulation de type pro-action. / During G2/M transition in Xenopus oocyte, p39Mos-MEK1-MAPK cascacade harbors specific dynamic and physical properties, such as ultrasensitivity, bistability, irreversibility, and all-or-none responses. These properties are generally considered in the context of the positive feedback loop that embeds the p39Mos-MEK1-MAPK pathway architecture. The objective of this work was focused onto p39Mos oncoprotein and regulation motifs recruitment enabling together the generation of such properties. Both experimental and in silico approaches were undertaken in order to yield a realistic modelisation, physically and biologically relevant for this network. We developed a model that takes into account the influence of MPF onto p39Mos accumulation, and adjusts the role of the positive feedback loop. Also, we were able to show that p90Rsk, target of MAPK, was degraded. This signaling pathway was activated in the absence of p39Mos. Our results show that 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) is able to induce gradual and ultrasensitive MAPK activation. 1,10-PA action is then exerted in the absence of protein synthesis and positive feedback loop. In this context, a feed forward loop model can be considered, and phosphatase inhibitors were used for MAPK activation in the absence of p39Mos. Our results confront the role attributed to the positive feedback loop in MAPK activation, and show that this ultrasensitive response may be generated in vivo through feed forward regulation motifs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La mutation R249S (mutant p.R249S) du gène TP53, caractéristique de l'exposition à l'aflatoxine B1 (AFB1), est la plus fréquente dans les carcinomes hépatocellulaires (CHC) et est dans la plupart des cas associée à une infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB). En effet, il existe une synergie entre ces deux facteurs de risque, augmentant ainsi le risque de développer un CHC. Dans une première partie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de cette synergie dans différents modèles cellulaires puis dans une deuxième partie nous avons utilisé une approche épidémiologique pour étudier l'interaction entre la mutation R249S et le VHB. Nous avons tout d'abord montré que p.R249S avait perdu ses fonctions liées à p53wt. D'autre part, p.R249S était capable de former un complexe protéique avec l'oncoprotéine virale HBx dans les cellules de CHC PLC/PRF/5. Dans la deuxième partie de ce travail, nos résultats montrent que la mutation R249S est détectable dans l'ADN du sérum de sujets asymptomatiques de Gambie rurale (Afrique de l'Ouest). Notre travail met en évidence des variations temporelles quantitatives de la mutation R249S. Ces variations dépendent des niveaux d'exposition d'AFB1 mais également de la présence du VHB, suggérant une interaction entre l'AFB1 et le VHB. Enfin, dans une autre étude menée en Gambie et basée sur le recrutement de sujets ayant développés un CHC ou non (contrôles) nos résultats montrent que la mutation R249S est fortement associée au gène HBX complet dans les CHC. Cette association pourrait ainsi expliquer en partie l'effet synergique observé entre l'AFB1 et le VHB. A terme, une cible critique pourrait être identifiée pour des interventions préventives ou thérapeutiques précoces sur les CHC dans les régions de forte incidence / R249S mutation (mutant p.R249S) of TP53 gene, characteristic of the exposure to aflatoxin B1, is the most frequent TP53 mutation in hepatocellular carcinoma (HCC) and is highly associated with chronic hepatitis B virus infection (HBV). Indeed, a synergistic effect exists between these two main risk factors, thus increasing the risk to develop HCC. In a first part, we have studied the molecular mechanisms of this synergy in different cellular models and then, in a second part we have used an epidemiology-based approach to investigate the interaction between the R249S mutation and HBV. Firstly, we have shown that p.R249S has lost p53wt functions. Moreover, p.R249S formed a protein complex with the oncoprotein HBx from HBV in the HCC cell line PLC/PRF/5. In the second part, our results show that R249S mutation is detectable in plasma DNA of asymptomatic subjects from the rural Gambia (West Africa). Our work shows quantitative variations of R249S mutation that are dependent on the levels of exposition to AFB1 but also on the presence of HBV, suggesting an interaction between AFB1 and HBV. Finally, in another study performed in The Gambia and based on subjects with HCC or not (controls), our results show that R249S mutation is highly associated with HBX complete gene in HCC. Therefore this association could explain in part the synergistic effect observed between AFB1 and HBV. Eventually, a critical target may be identified for preventive or early therapeutic interventions on HCC of high-incidence regions

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un alphaherpesvirus à l’origine du développement de lymphomes chez les volailles. A ce jour, l’origine du développement des tumeurs induites par le MDV est encore peu connue malgré l’identification de plusieurs oncoprotéines virales. Au vu de l’implication des dommages à l’ADN dans la pathogenèse de plusieurs virus notamment les herpesvirus, mon projet de thèse avait pour objectif de déterminer l’impact de l’apparition de lésions d’ADN sur le cycle viral du MDV. Nous avons montré que l’infection cytolytique de MDV s’accompagne d’une accumulation de lésions dans l’ADN cellulaire de lymphocytes et cellules fibroblastiques de poulet. La phase de latente de l’infection MDV n’affecte pas l’intégrité de l’ADN des lymphocytes alors que la réactivation du virus conduit à l’apparition de lésions d’ADN. De plus, en utilisant une approche originale in vivo, nous avons confirmé le rôle essentiel de la protéine virale VP22 dans l’induction de ces dommages. Nous avons pu établir que l’induction des dommages à l’ADN au cours de l’infection et/ou la réponse cellulaire engendrée sont non seulement favorables à la réplication du virus mais également que l’apparition de ces lésions est étroitement liée au pouvoir oncogène du MDV. / Marek’s disease virus (MDV) is an alphaherpesvirus responsible of T lymphoma in chickens. Mechanisms leading to cellular transformation mediated by MDV are still incompletely understood. DNA damage and the associated cellular response participate actively in the life cycle of viruses, especially herpesviruses. Here, we aimed at deciphering the role of DNA damages in MDV pathogenesis. We show that MDV lytic infection leads to DNA lesions in lymphocytes and fibroblasts of chickens. Moreover, we demonstrated that MDV latently-infected lymphocytes exhibits undamaged DNA whereas MDV reactivation leads to an onset of DNA lesions. Also, using an original in vivo approach, we objectified the role of VP22 on DNA damages induction. Finally, we established that DNA damage and/or the associated DNA damage response are not only benefic to MDV replication but also that the DNA lesions onset might participate to MDV oncogenicity.

Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires. / Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes.

Le cancer du col de l'utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l'agent étiologique majeur est l'infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L'inducteur majeur du processus oncogène est le processus d'intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l'infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l'immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l'oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l'induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l'activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d'autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l'expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l'interaction des oncoprotéines telles qu'E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d'exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d'extinction fonctionnels d'E6 et permettant d'étudier les répercutions sur d'autres processus cellulaires.