Considerando que a obtenção de uma formulação farmacêutica pode ser melhor planejada se algumas condições biológicas inerentes à cavidade oral forem contempladas e que os sistemas de liberação modificada podem ser ferramentas para o controle de doenças orais, o objetivo do trabalho é obter uma formulação contendo clorexidina, avaliando seu efeito sobre os mesmos. Este trabalho foi dividido em duas etapas, sendo que a primeira envolveu a obtenção da formulação mais adequada aos experimentos biológicos e a segunda avaliou seus efeitos sobre biofilmes patogênicos orais. Assim, formulações com diferentes concentrações de clorexidina foram preparadas e avaliadas visualmente em relação à sua integridade física nas condições de crescimento dos biofilmes, seguido de ensaio de liberação em meio estático utilizando tampão como meio de dissolução (meio de dissolução convencional). A formulação selecionada foi submetida a ensaios de liberação em meio estático contendo os diferentes caldos de cultura bacterianos como meio de dissolução. Na segunda etapa do trabalho, o efeito da formulação selecionada foi avaliado em biofilmes cariogênicos de Streptococcus mutans ou biofilmes periodontopatogênicos de Porphyromonas gingivalis. Biofilmes de S. mutans (n=6) ou P. gingivalis (n=3) foram formados em caldos de cultura sob lâminas de vidro por 6 e 3 dias, respectivamente, sendo expostos a um dos seguintes tratamentos: 1) Formulação contendo 92% de quitosana e 8% de hidroxipropil metilcelulose (CV, como controle do veículo) ou 2) Formulação contendo 82% de quitosana, 8% de hidroxipropil metilcelulose e 10% de clorexidina (CHX, grupo experimental). Um grupo sem exposição à formulação foi incluído como controle negativo (CN). Após o período experimental, a viabilidade bacteriana, o pH dos biofilmes e a quantificação de clorexidina liberada para os caldos de cultura foram determinados. Os dados foram analisados estatisticamente por teste de Tukey-Kramer e Tukey, sendo o nível de significância estabelecido em 5%. Os resultados sugerem que ainda que a liberação de clorexidina da formulação nos caldos de cultura de S. mutans e P. gingivalis tenha sido menor se comparada ao meio de dissolução convencional (p<0,05), o efeito biológico promovido foi observado para ambos os biofilmes. Para o pH dos biofilmes de S. mutans, os grupos CN e CV não apresentaram diferença entre si (p>0,05), mas apresentaram quedas de pH maiores se comparados à CHX (p<0,05). CHX também resultou em menor viabilidade bacteriana dos biofilmes se comparada aos controles (p<0,05), que não apresentaram diferença entre si (p>0,05). Para P. gingivalis também houve mais morte celular nos biofilmes expostos à CHX (p<0,05) mas CV também apresentou perda de viabilidade em comparação à CN (p<0,05). Apesar da liberação de clorexidina da formulação ter sido dificultada pela presença dos microrganismos, os resultados sugerem que o sistema de liberação obtido foi capaz de diminuir a patogenicidade dos biofimes de Streptococcus mutans e de Porphyromonas gingivalis. Assim, o presente estudo sugere a importância de aliar os estudos de diferentes áreas de conhecimento de forma a contribuir no planejamento das formulações, vislumbrando futuros benefícios clínicos para o controle das doenças orais. / Considering that obtaining a pharmaceutical formulation can be better planned if some biological conditions inherent to the oral cavity are contemplated and that the modified release systems may be tools for the control of oral diseases, the aim of the work is to obtain a formulation containing chlorhexidine and evaluate its effect in pathogenic biofilms. This work was divided in two stages, the first involved obtaining the most appropriate formulation for biological experiments and the second evaluate its effect on oral pathogenic biofilms. Thus, formulations with different concentrations of chlorhexidine were prepared and evaluated visually for their physical integrity under the biofilm growth conditions, followed by the static media release assay using buffer as the dissolution medium (conventional dissolution medium). The selected formulation was subjected to static release tests containing the different bacterial culture broths as the dissolution medium. In the second stage of the work, the effect of the selected formulation was evaluated in cariogenic biofilms of Streptococcus mutans or periodontopathogenic biofilms of Porphyromonas gingivalis. Biofilms of S. mutans (n = 6) or P. gingivalis (n = 3) were formed in culture broths under glass slides for 6 and 3 days respectively, being exposed to one of the following treatments: 1) Formulation containing 92 % of chitosan and 8% of hydroxypropyl methylcellulose (CV, vehicle control) or 2) Formulation containing 82% of chitosan, 8% of hydroxypropyl methylcellulose and 10% of chlorhexidine (CHX, experimental group). A group without exposure to the formulation was included as negative control (CN). After the experimental period, bacterial viability, biofilms pH and quantification of chlorhexidine released into the culture broths were determined. Data were statistically analyzed by Tukey-Kramer and Tukey test with a level of significance of 5%. Results suggest that although chlorhexidine release from formulation in the culture broths of S. mutans and P. gingivalis was lower compared to the conventional dissolution medium (p <0.05), the treatment promoted biological effect for both biofilms. Regarding S. mutans biofilms pH, CN and CV groups showed no difference (p> 0.05), but showed higher pH drops when compared to CHX (p <0.05). CHX also resulted in lower bacterial viability of biofilms compared to controls (p <0.05), which did not show any difference (p> 0.05). For P. gingivalis, there was higher cell death in the biofilms exposed to CHX (p <0.05) and CV presented loss of viability compared to CN (p <0.05). Although the release of chlorhexidine from the formulation has been hampered by the presence of microorganisms, results suggest that the release system was able to reduce the pathogenicity of Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis biofilms. Thus, the present study suggests the importance of combining studies from different areas of knowledge in order to contribute to the design of formulations aiming future clinical benefits for the oral diseases control.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os estÃgios iniciais da formaÃÃo das lesÃes de cÃrie em humanos estÃo relacionados diretamente com a presenÃa de Streptococcus mutans no biofilme dental. O tratamento das doenÃas ocasionadas por biofilmes orais envolve basicamente a remoÃÃo mecÃnica e o uso de antibiÃticos e agentes anti-sÃpticos os quais podem originar cepas resistentes aos antimicrobianos tradicionais. A Terapia FotodinÃmica Antimicrobiana (TFDA) apresenta-se como uma opÃÃo alternativa ao tratamento clÃssico, promovendo a morte bacteriana por meio da fotossenssibilizaÃÃo dos componentes microbianos. O objetivo dessa dissertaÃÃo foi avaliar o potencial antimicrobiano da TFDA e sua capacidade de alterar o padrÃo de expressÃo gÃnica de Streptococcus mutans em biofilmes orais produzidos in vitro utilizando para tanto um diodo emissor de luz (LED) associado ao fotossenssibilizador azul de orto-toluidina (TBO). Para tanto biofilmes de .S. mutans UA159, foram formados sobre discos de hidroxiapatita utilizando um modelo de banhos de cultura e submetidos a TFDA apÃs 5 dias. O material coletado passou por um processo de disrrupÃÃo para a dispersÃo das cÃlulas e diluiÃÃo em sÃrie decimal, apÃs o que foi plaqueado em meio de cultura e incubado em condiÃÃes ideais de crescimento. Adicionalmente, e expressÃo dos genes de virulÃncia gtfB, gtfC e gbpB de S. mutans foram avaliados apÃs a extraÃÃo do RNA total, sÃntese de cDNA e realizaÃÃo da tÃcnica da reaÃÃo da polimerase em cadeia em tempo real utilizando primers especÃficos. O gene ribossomal 16S foi utilizado com gene de referÃncia.. ReduÃÃes significativas (p<0,05) foram observadas na viabilidade das colÃnias de S. mutans quanto exposto ao TBO e LED. A expressÃo gÃnica de gtfC em biofilme de S. mutans foi significantemente reduzida apÃs a realizaÃÃo da terapia fotodinÃmica antimicrobiana enquanto a expressÃo de gtfB parece ter sido menos influenciada pela terapia. NÃo houve alteraÃÃes na expressÃo de gbpB em funÃÃo da terapia fotodinÃmica antimicrobiana. Assim, outros estudos sÃo necessÃrios para avaliar aÃÃo da terapia fotodinÃmica antimicrobiana em condiÃÃes mais semelhantes daquelas encontradas no ambiente clÃnico, bem como para favorecer o entendimento de seus efeitos na expressÃo de importantes genes de virulÃncia de S. mutans. / The early stages of the formation of caries lesions in humans are directly related to the presence of Streptococcus mutans in biofilm. The treatment of diseases caused by oral biofilms basically involves mechanical removal and use of antibiotics and antiseptic agents which may lead to strains resistant to traditional antimicrobials. Antimicrobial Photodynamic Therapy (PACT) presents itself as an alternative option to conventional treatment, promoting bacterial killing by photosensitizing of microbial components. The objective of this study was to evaluate the antimicrobial potential of PACT and its ability to alter the pattern of gene expression of S. mutans in oral biofilms produced in vitro using both a LED light (LED) associated with the photosensitizer ortho-toluidine blue ( TBO). To this end, S. mutans UA159 biofilms were formed on hydroxyapatite discs using a model of bathing culture and were subjected to PACT after 5 days. The collected material has gone through sonication for dispersion and dilution of cells in decimal series. After that, material was plated in rich medium and incubated under optimum growth conditions. Additionally, expression of virulence gtfB, and gtfC gbpB genes of S. mutans were evaluated after extraction of total RNA, cDNA synthesis and realization of the technique of polymerase chain reaction in real time using specific primers. The 16S ribosomal gene was used as the reference gene. Significant reductions (p <0.05) were observed in the viability of colonies of S. mutans when exposed to TBO and LED at the same time. Gene expression of gtfC in S. mutans biofilm was significantly reduced after the completion of antimicrobial photodynamic therapy, whereas expression of gtfB seems to have been less influenced by therapy. No change in the expression of gbpB a function of antimicrobial photodynamic therapy was observed. Therefore, further studies are needed to evaluate the action of antimicrobial photodynamic therapy in conditions more like those found in the clinical environment and to encourage understanding of their effects on the expression of important virulence of S. mutans genes.

[ES] Las biopelículas bacterianas y fúngicas contribuyen enormemente a la persistencia de muchas infecciones graves y potencialmente mortales, las cuales anualmente provocan millones de defunciones. Además, estas bacterias y hongos que crecen adheridas formando biopelículas son hasta 1.000 veces más resistentes a los tratamientos antimicrobianos convencionales, generando una carga económica significativa y dificultando su diagnóstico y tratamiento. Por tanto, es necesario buscar nuevas herramientas fiables para estudiar la dinámica de formación de biopelículas con el fin de mejorar las estrategias de tratamiento.El objetivo general de la tesis doctoral es la puesta a punto de un sistema basado en medidas de impedancia eléctrica para el estudio de la formación y dinámica de crecimiento de las biopelículas bacterianas (gram-positivas y gram-negativas) y fúngicas, así como de biopelículas complejas multi-especie como las de la placa dental subgingival de muestras periodontales humanas. Tras la puesta a punto del sistema, los objetivos específicos de la tesis doctoral son su aplicación como herramienta en la identificación de tratamientos efectivos contra biopelículas persistentes, la búsqueda de nuevos compuestos antimicrobianos con actividad anti-biofilm, así como la evaluación de novedosas nanopartículas autopropulsadas para la erradicación de biofilms multirresistentes. Finalmente, se ha evaluado su aplicación clínica directa en la selección de la terapia antibiótica para el tratamiento personalizado de pacientes con enfermedad periodontal. / [CA] Les biopelícules bacterianes i fúngiques contribueixen en gran manera a la persistència de moltes infecciones greus i potencialment mortals les quals provoquen anualment milions de morts. A més, estes bactèries i fongs que creixen adherides en forma de biopelícules son fins a 1000 vegades més resistents als tractaments antimicrobians convencionals, generant una càrrega econòmica significativa i dificultant el diagnòstic i tractament. Per això, es necessari trobar noves eines fiables per a estudiar la dinàmica de formació de biopelícules amb l'objectiu de millorar les estratègies de tractament. El objectiu general de la tesis doctoral es la posta a punt de un sistema basat en mesures d'impedància elèctrica per al estudi de la formació i dinàmica de creixement de les biopelícules bacterianes (gram-positives i gram-negatives) i fúngiques, així com de biopelícules complexes mutiespècie com les de la placa dental subgingival de mostres periodontals humanes. Una vegada posat a punt el sistema, els objectius específics de la tesis doctoral son la aplicació com a eina de la identificació de tractaments efectius contra biopelícules persistents, la recerca de nous compostos antimicrobians amb activitat antibiopelícula, així com la avaluació de noves nanopartícules autopropulsades per a l'eliminació de biofilms multiresistents. Finalment, s'ha avaluat l'aplicació clínica directa en la selecció de la teràpia antibiòtica per al tractament personalitzat de pacients amb periodontitis. / [EN] Bacterial and fungal biofilms contribute enormously to the persistence of many life-threatening infections, causing millions of deaths annually. In addition, bacteria and fungi growing as biofilms are up to 1.000 times more resistant to conventional antimicrobial treatments, resulting in a significant economic burden and challenging diagnosis and treatment. Therefore, there is a need to search for new reliable tools to study biofilm formation dynamics to improve treatment strategies. This doctoral thesis aims to set up an impedance-based system to study biofilm formation and dynamics of bacterial (gram-positive and gram-negative) and fungal species, as well as complex multi-species biofilms such as subgingival plaque collected from patients with chronic periodontitis. After the impedance system is set up, the specific objectives of the doctoral thesis are its application as a tool in the identification of effective treatment against persistent biofilms, testing new antimicrobial and anti-biofilm compounds, and the evaluation of novel self-propelled nanoparticles on the eradication of multi-resistant S. aureus biofilms. Finally, a clinical application of the impedance system is proposed, aiming at determining the best individual antibiotic therapy in dental clinics (personalized use of antibiotics). / Work performed at Genomics & Health Department at FISABIO Foundation and described in this doctoral thesis was supported by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities scholarship FPU17/01302 to Miglė Žiemytė and a grant RTI2018-102032-B-I00 to Alex Mira Obrador. / Ziemyte, M. (2023). Towards Personalized Medicine in Antibiotic Treatment: Development of a Real-Time Cell Analysis System for Biofilm Studies [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195434