Estudo dos efeitos da irradiação ultra-sônica pulsada de baixa intensidade sobre o desenvolvimento de segmentos da coluna vertebral implantados em camundongos isogênicos / The aim of the present research was evaluate the action of low-intensity pulsed ultrasonic irradiation on development and ossification of vertebral column blastemas, through mice new born tail segments implants in adult receptor isogenic mice lineages C57BL/6 and Balb/C. New born tail segments were implanted in subcutaneous tissues of adults isogenics mice C57BL/6 and intramuscularly in adults isogenics mice Balb/C. After 24 hours the implant, the animals in both groups, were stimulated with the low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), 10 minutes per day. After 5 days of stimulus, the receptors animals were death and had the implanted tails removed for histopathology, trhrough Periodic Acid Schiff plus Alcian Blue (PAS/AB), Masson's tricomico and hem lumen-eosin (HE). The group of animals stimulated which received subcutaneous implant presented the implant with accelerated in inter-vertebral diks, faces to chondrocytes organization and chondroblastes findings in cartilaginous matrix, showing maturity in fiber cartilages arrangements. It was observed too, a collagen fibers enlargement in the disks fibro cartilage which show more dense next the pulposo nucleus in the segments implanted and stimulated, compared with the controls segments. The areas of the segments were available by Fisher's test and Student's t. It didn't watch significant differences in the vertebral bodies' areas sizes in the animals which implant was subcutaneous (p'< OU = '0.05). In the intramuscular implants animals group, it was observed a major velocity in the hialuronic acid matrix formation in the intervertebral disks after LIPUS stimulus. Moreover, the fibrous ring fiber cartilages' were better organized with large number of cells inside the cartilaginous matrix compared with the controls segments. With regard to the vertebral bodies in the intramuscular implants, it's not verifies significant increases in the areas (p'< OU =' 0,05). The findings allow conclude that LIPUS should promote the ontogenetic differentation of the structural components of the mice vertebral column more quickly, trhough vertebras endochondral ossification microscopic evaluation and the inter-vertebral disks components differentiation, follow the methodology employed.

O período embrionário apresenta maior susceptibilidade a teratógenos, sendo a fase que as primitivas camadas germinativas e rudimento dos órgãos são formados. Cada órgão tem uma fase crítica de desenvolvimento e os processos bioquímicos envolvidos no crescimento e diferenciação tem uma seqüência ordenada, controlada por vários genes. A ossificação endocondral tem inicio sobre um molde de cartilagem hialina, com formato semelhante ao osso que irá se originar, sendo o principal responsável pela formação dos ossos curtos e longos. Assim, julgamos ser de grande valia um estudo embasado no desenvolvimento normal dos membros de embriões e fetos bovinos provenientes de vacas criadas em ambiente natural, através de estudos em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. No processo de formação, desenvolvimento e ossificação dos membros observamos a formação de tecido mesenquimal condensado em embriões por volta da quarta semana gestacional, passando pelo processo de diferenciação em células cartilaginosas. Ao redor da sétima semana gestacional inicia-se o processo de calcificação da cartilagem com depósitos de cálcio e fósforo para formação de tecido ósseo, seguido de morte dos condrócitos. / The embryonary period presents a bigger susceptibility to theratogens, being the phase in which the primitive germinative layers and rudiment of organs are been formed. Each organ has a critical phase of development and the biochemical processes involved in growing and differentiation have an ordered sequence, controlled by several genes. The endochondrial ossification has begun over a hyaline cartilage mould, having a shape similar to the bone that will be grow, being the principal responsible for the short and long bones formation. Thus, we think it is much valid a study based on normal development of bovine embryos and fetuses\' limbs coming from cows bred in a natural environment, through studies in light microscopy and transmission electronic microscopy. In the process of formation, development and ossification of limbs, we saw condensed mesenchymal tissue formation in the embryos at around the gestational fourth week, passing through differentiation process in cartilaginous cells. At around the gestational seventh week, it has begun the calcification process of cartilage with calcium and phosphorous deposits to the bone tissue formation, followed by chondrocites death.

O período embrionário apresenta maior susceptibilidade a teratógenos, sendo a fase que as primitivas camadas germinativas e rudimento dos órgãos são formados. Cada órgão tem uma fase crítica de desenvolvimento e os processos bioquímicos envolvidos no crescimento e diferenciação tem uma seqüência ordenada, controlada por vários genes. A ossificação endocondral tem inicio sobre um molde de cartilagem hialina, com formato semelhante ao osso que irá se originar, sendo o principal responsável pela formação dos ossos curtos e longos. Assim, julgamos ser de grande valia um estudo embasado no desenvolvimento normal dos membros de embriões e fetos bovinos provenientes de vacas criadas em ambiente natural, através de estudos em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. No processo de formação, desenvolvimento e ossificação dos membros observamos a formação de tecido mesenquimal condensado em embriões por volta da quarta semana gestacional, passando pelo processo de diferenciação em células cartilaginosas. Ao redor da sétima semana gestacional inicia-se o processo de calcificação da cartilagem com depósitos de cálcio e fósforo para formação de tecido ósseo, seguido de morte dos condrócitos. / The embryonary period presents a bigger susceptibility to theratogens, being the phase in which the primitive germinative layers and rudiment of organs are been formed. Each organ has a critical phase of development and the biochemical processes involved in growing and differentiation have an ordered sequence, controlled by several genes. The endochondrial ossification has begun over a hyaline cartilage mould, having a shape similar to the bone that will be grow, being the principal responsible for the short and long bones formation. Thus, we think it is much valid a study based on normal development of bovine embryos and fetuses\' limbs coming from cows bred in a natural environment, through studies in light microscopy and transmission electronic microscopy. In the process of formation, development and ossification of limbs, we saw condensed mesenchymal tissue formation in the embryos at around the gestational fourth week, passing through differentiation process in cartilaginous cells. At around the gestational seventh week, it has begun the calcification process of cartilage with calcium and phosphorous deposits to the bone tissue formation, followed by chondrocites death.

Estudo dos efeitos da irradiação ultra-sônica pulsada de baixa intensidade sobre o desenvolvimento de segmentos da coluna vertebral implantados em camundongos isogênicos / The aim of the present research was evaluate the action of low-intensity pulsed ultrasonic irradiation on development and ossification of vertebral column blastemas, through mice new born tail segments implants in adult receptor isogenic mice lineages C57BL/6 and Balb/C. New born tail segments were implanted in subcutaneous tissues of adults isogenics mice C57BL/6 and intramuscularly in adults isogenics mice Balb/C. After 24 hours the implant, the animals in both groups, were stimulated with the low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), 10 minutes per day. After 5 days of stimulus, the receptors animals were death and had the implanted tails removed for histopathology, trhrough Periodic Acid Schiff plus Alcian Blue (PAS/AB), Masson's tricomico and hem lumen-eosin (HE). The group of animals stimulated which received subcutaneous implant presented the implant with accelerated in inter-vertebral diks, faces to chondrocytes organization and chondroblastes findings in cartilaginous matrix, showing maturity in fiber cartilages arrangements. It was observed too, a collagen fibers enlargement in the disks fibro cartilage which show more dense next the pulposo nucleus in the segments implanted and stimulated, compared with the controls segments. The areas of the segments were available by Fisher's test and Student's t. It didn't watch significant differences in the vertebral bodies' areas sizes in the animals which implant was subcutaneous (p'< OU = '0.05). In the intramuscular implants animals group, it was observed a major velocity in the hialuronic acid matrix formation in the intervertebral disks after LIPUS stimulus. Moreover, the fibrous ring fiber cartilages' were better organized with large number of cells inside the cartilaginous matrix compared with the controls segments. With regard to the vertebral bodies in the intramuscular implants, it's not verifies significant increases in the areas (p'< OU =' 0,05). The findings allow conclude that LIPUS should promote the ontogenetic differentation of the structural components of the mice vertebral column more quickly, trhough vertebras endochondral ossification microscopic evaluation and the inter-vertebral disks components differentiation, follow the methodology employed.

A osteoaderina (OSAD) tem sido identificada nos tecidos mineralizados, porém, seu papel na mineralização óssea não está claro. Foi feita uma comparação do momento em que a OSAD aparece na ossificação intramembranosa e endocondral, em relação aos estágios iniciais de mineralização. O osso parietal de fetos de ratos Wistar com 17, 18 e 21 dias e o côndilo mandibular de ratos com 30 dias foram removidos. A expressão de OSAD foi analisada por imunocitoquímica e Western blotting. Nos dois tipos de ossificação, a imunomarcação foi detectada nos osteoblastos; porém, na matriz extracelular a OSAD apareceu somente na fase fibrilar de mineralização, mantendo-se constante posteriormente. A análise por Western blotting revelou que os fetos com 17 dias continham pouco menos OSAD que os de 18 dias, enquanto a imunorreatividade diminuía nos fetos com 21 dias. Os resultados sugerem que a OSAD tem um papel na mineralização da matriz, atuando, provavelmente como organizadora de seu arcabouço ou retendo o mineral, além de exercer atividades de adesão entre os componentes da matriz. / Osteoadherin (OSAD) had been identified in mineralized tissues, but its specific role in mineralization remains unclear. The present study compared the appearance of OSAD at early stages of mineralization during both intramembranous and endochondral ossification. Parietal bone of 17, 18 and 21 days-old fetus and mandibular condyle of 30 days-old Wistar rats were removed. The expression of OSAD was analyzed by immunocytochemistry and Western blotting. In both types of ossification the labeling was uniformly distributed in the cytoplasm of osteoblasts but it only appeared in the mineralizing matrix when the fibrilar stage was taking place, remaining as a component of the mineralized bone matrix. Western blots revealed that 17-days-old embryos contained slightly less OSAD than 18- days-old fetus, while immunoreactivity was weak in 21 days-old fetus. The results suggest that OSAD plays a role in collagen fibril mineralization maybe by organizing the matrix assembly or by retaining the mineral into the matrix, besides exerting binding activities among its components.

A osteoaderina (OSAD) tem sido identificada nos tecidos mineralizados, porém, seu papel na mineralização óssea não está claro. Foi feita uma comparação do momento em que a OSAD aparece na ossificação intramembranosa e endocondral, em relação aos estágios iniciais de mineralização. O osso parietal de fetos de ratos Wistar com 17, 18 e 21 dias e o côndilo mandibular de ratos com 30 dias foram removidos. A expressão de OSAD foi analisada por imunocitoquímica e Western blotting. Nos dois tipos de ossificação, a imunomarcação foi detectada nos osteoblastos; porém, na matriz extracelular a OSAD apareceu somente na fase fibrilar de mineralização, mantendo-se constante posteriormente. A análise por Western blotting revelou que os fetos com 17 dias continham pouco menos OSAD que os de 18 dias, enquanto a imunorreatividade diminuía nos fetos com 21 dias. Os resultados sugerem que a OSAD tem um papel na mineralização da matriz, atuando, provavelmente como organizadora de seu arcabouço ou retendo o mineral, além de exercer atividades de adesão entre os componentes da matriz. / Osteoadherin (OSAD) had been identified in mineralized tissues, but its specific role in mineralization remains unclear. The present study compared the appearance of OSAD at early stages of mineralization during both intramembranous and endochondral ossification. Parietal bone of 17, 18 and 21 days-old fetus and mandibular condyle of 30 days-old Wistar rats were removed. The expression of OSAD was analyzed by immunocytochemistry and Western blotting. In both types of ossification the labeling was uniformly distributed in the cytoplasm of osteoblasts but it only appeared in the mineralizing matrix when the fibrilar stage was taking place, remaining as a component of the mineralized bone matrix. Western blots revealed that 17-days-old embryos contained slightly less OSAD than 18- days-old fetus, while immunoreactivity was weak in 21 days-old fetus. The results suggest that OSAD plays a role in collagen fibril mineralization maybe by organizing the matrix assembly or by retaining the mineral into the matrix, besides exerting binding activities among its components.

As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento. Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea. / MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14). During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation.

As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento. Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea. / MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14). During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation.