Le virus de la variole ovine est omniprésent dans les élevages de petits ruminants dans les pays d’Afrique du Nord et particulièrement en Tunisie malgré les campagnes de vaccination annuelles mises en place par les autorités vétérinaires du pays. L’optimisation de la souche vaccinale utilisée passe par le développement de vaccins dits de nouvelle génération tels que les vaccins sous unitaires utilisant des protéines reconnues pour induire une réponse humorale protectrice chez l’animal immunisé. Ceci pourrait être une alternative aux stratégies de lutte actuelles permettant de limiter la dissémination du virus en Tunisie. Peu de données existent sur les antigènes protecteurs spécifiques des virus du genre Capripoxvirus. Ce travail de thèse a ciblé, par homologie aux protéines du virus de la vaccine, quatre protéines du genre Capripoxvirus appartenant au virus de la dermatose nodulaire contagieuse potentiellement immuno-dominantes nommées LSDV60, LSDV117, LSDV122 etLSDV141 respectivement homologues des protéines L1, A27, A33 et B5. En premier lieu, une analyse structurale in silico a permis d’identifier les domaines essentiels de chaque protéine et de vérifier le taux de conservation de ces protéines parmi différents virus appartenant à la famille des poxvirus. Une analyse structurale approfondie mettant en évidence la structure primaire, secondaire et tertiaire de la protéine A27 a été réalisée. Suite à cette étude structurale, les protéines ont été produites dans deux systèmes d’expression différents ; le système eucaryote et le système baculovirus-cellules d’insectes afin de caractériser leur antigénicité vis-à-vis de sérums provenant d’animaux immunisés ou éprouvés.La reconnaissance des protéines d’intérêt en vecteur d’expression eucaryote n’a pas été concluante. En revanche, le système d’expression BEVS a permis la production de la protéine A27 (L1, A33 et B5 encours) avec succès sous forme soluble qui a été correctement reconnue par des sérums provenant de caprins naïfs challengés. La mise en évidence de formes trimériques et hexamériques confirment sonantigénicité. Une immunodétection des peptides correspondants à la protéine A27 synthétisés surmembranes (PepScan) combinée à une analyse in silico ont permis d'identifier des zones susceptibles de constituer des régions épitopiques reconnues situés majoritairement en partie N terminale de la protéine. / The sheep pox virus is omnipresent in small ruminant farms in North African countries andparticularly in Tunisia despite the annual vaccination campaigns set up by the Tunisian veterinaryauthorities. The optimization of the used vaccine strain involves the development of the so-called newgeneration vaccines such as subunit vaccines and this, using proteins recognized to induce a protectivehumoral response in the immunized animal. This could be considered as an alternative to currentcontrol strategies limiting virus spread in Tunisia. Few data exist on protective antigens specific toviruses in the genus Capripoxvirus. By homology to vaccinia virus proteins, this thesis work hastargeted four proteins in the genus Capripoxvirus belonging to the potentially immuno-dominantcontagious nodular dermatosis virus named LSDV60, LSDV117, LSDV122 and LSDV141respectively homologues of proteins L1, A27, A33 and B5. First, an in silico structural analysis hasallowed to identify the essential domains of each protein and to check the conservation rate of theseproteins among different viruses belonging to the poxvirus family. A thorough structural analysisidentifying the primary, secondary and tertiary structure of the A27 protein was conducted. Followingthis structural study, the proteins were produced in two different expression systems, namely theeukaryotic system and the baculovirus-insect cell system, in order to characterize their antigenicity tosera from immunized or proven animals. The recognition of the proteins of interest in the eukaryoticexpression vector has not been conclusive. On the other hand, the BEVS expression systemsuccessfully allowed the production of the A27 protein (L1, A33 and B5 in progress) in a solubleform, which was correctly recognized by sera from challenged naïve goats. Identifying trimeric andhexameric forms confirms its antigenicity. An immunodetection of the peptides corresponding toprotein A27 synthesized on membranes (PepScan) combined with an in silico analysis led to identifyzones capable of constituting recognized epitopic regions located predominantly in part N-terminal ofthe protein.

Les avancées des nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont permis dans le cadre des études en écologie microbienne de passer de l'analyse de quelques centaines de séquences par étude à des centaines de millions de séquences. Cette différence quantitative des données produites a induit des différences qualitatives quant aux études réalisées. En effet, avec le changement du type de données, les approches classiques d'analyse ne peuvent être appliquées et il est devenu nécessaire de définir de nouvelles stratégies en tenant compte des contraintes que posent ces données. Alors qu'il était possible d'insérer classiquement quelques dizaines de séquences issues des techniques de première génération dans des phylogénies expertisées, le nombre de séquences généré aujourd'hui par les NGS à chaque expérience rend cette tâche irréalisable et nécessite la mise en place de nouvelles stratégies et l'utilisation d'outils adaptés. Par ailleurs, les outils disponibles d'analyse de la diversité microbienne adaptés aux amplicons de nouvelle génération, implémentent des approches probabilistes et/ou de recherche de similitude pour l'identification des séquences environnementales. L'approche phylogénétique quant à elle, bien qu'elle soit la plus robuste, n'est pas utilisée pour l'annotation taxonomique de ce type de données du fait de ses besoins en temps et en ressources de calcul. Au-delà de l'approche d'annotation taxonomique, les nouvelles techniques de séquençage posent également le problème de la qualité des séquences produites et son impact sur l'estimation de la diversité. Ainsi, ce travail de thèse avait pour objectif la définition d'une stratégie d'analyse bioinformatique de données de séquençage massif dans le contexte de l'étude de la diversité microbienne, en tenant compte des limitations imposées par les ressources informatiques actuelles (matérielles et logicielles) d'un côté, et de l'avantage des méthodes phylogénétiques par rapport aux autres approches d'annotation taxonomique. Ce travail a donné lieu au développement d'une chaîne de traitement proposant une série d'analyses allant des séquences brutes jusqu'à la visualisation des résultats, tout en replaçant les séquences environnementales dans un contexte évolutif. L'approche développée a été optimisée pour la gestion de gros volumes de données, et a été comparée en terme de précision d'affiliation aux autres approches communément utilisées en écologie microbienne. Les tests et simulations ont montré qu'à partir d'une taille d'amplicons de 400 pb, l'affiliation phylogénétique avait les meilleurs résultats mais aussi, que la qualité de cette affiliation différait selon la région hypervariable ciblée. La chaîne de traitements mise en place a ensuite été par implémentée dans un contexte de calcul à haute performance, notamment sur un cluster de calcul, pour proposer un service web dédié à l'analyse de la diversité microbienne. / The characterization of microbial community structure via SSU rRNA gene profiling has been greatly advanced in recent years by the introduction of NGS amplicons, leading to a better representation of sample diversity at a lower cost. This progress in method development has provided a new window into the composition of microbial communities and sparked interest in the members of the rare biosphere. Concurrently, the processing of such amount of data has become an important bottleneck for the effectiveness of microbial ecology studies, and a multitude of analysis platforms have been developed for the handling of these data. As implemented, these tools have a steep learning curve for the biologist who is not computationally inclined, as they require extensive user intervention and consume many CPU hours due to dataset analysis and complexity, which can present a significant barrier to researchers. Moreover, although phylogenetic affiliation has been shown to be more accurate for the taxonomic assignment of NGS reads, the existing tools assign taxonomy by either a similarity search or a probabilistic approach, with the phylogenies being restricted to samples' comparison. Beyond the taxonomic assignment, the new sequencing technologies also arise the problem of the quality of the generated sequences and its impact on the richness estimation. In this work, we aimed to define a strategy for the bioinformatic analysis of high-throughput sequences in order to depict the microbial diversity, taking into account both the limitations imposed by current computer resources (hardware and software), and the advantage of the phylogenetic methods over the other taxonomic annotation approaches. This work has led to the development of a pipeline offering a set of analyzes ranging from raw sequences processing to the visualization of the results, while replacing the environmental sequences in an evolutionary framework. The developed approach was optimized for managing large volumes of data, and has been compared in term of the accuracy of taxonomic assignment to the approaches commonly used in the field of microbial ecology. This pipeline was then used to the developement of a dedicated web server for high-throughput sequencing analysis, that relies on a computing cluster and performs large-scale phylogeny-based analyses of rRNA genes with no need for specialized informatics expertise, and uses the phylogenies for both the taxonomy assessment and the delineation of monophyletic groups to highlight clades of interest.

Les avancées des nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont permis dans le cadre des études en écologie microbienne de passer de l'analyse de quelques centaines de séquences par étude à des centaines de millions de séquences. Cette différence quantitative des données produites a induit des différences qualitatives quant aux études réalisées. En effet, avec le changement du type de données, les approches classiques d'analyse ne peuvent être appliquées et il est devenu nécessaire de définir de nouvelles stratégies en tenant compte des contraintes que posent ces données. Alors qu'il était possible d'insérer classiquement quelques dizaines de séquences issues des techniques de première génération dans des phylogénies expertisées, le nombre de séquences généré aujourd'hui par les NGS à chaque expérience rend cette tâche irréalisable et nécessite la mise en place de nouvelles stratégies et l'utilisation d'outils adaptés. Par ailleurs, les outils disponibles d'analyse de la diversité microbienne adaptés aux amplicons de nouvelle génération, implémentent des approches probabilistes et/ou de recherche de similitude pour l'identification des séquences environnementales. L'approche phylogénétique quant à elle, bien qu'elle soit la plus robuste, n'est pas utilisée pour l'annotation taxonomique de ce type de données du fait de ses besoins en temps et en ressources de calcul. Au-delà de l'approche d'annotation taxonomique, les nouvelles techniques de séquençage posent également le problème de la qualité des séquences produites et son impact sur l'estimation de la diversité. Ainsi, ce travail de thèse avait pour objectif la définition d'une stratégie d'analyse bioinformatique de données de séquençage massif dans le contexte de l'étude de la diversité microbienne, en tenant compte des limitations imposées par les ressources informatiques actuelles (matérielles et logicielles) d'un côté, et de l'avantage des méthodes phylogénétiques par rapport aux autres approches d'annotation taxonomique. Ce travail a donné lieu au développement d'une chaîne de traitement proposant une série d'analyses allant des séquences brutes jusqu'à la visualisation des résultats, tout en replaçant les séquences environnementales dans un contexte évolutif. L'approche développée a été optimisée pour la gestion de gros volumes de données, et a été comparée en terme de précision d'affiliation aux autres approches communément utilisées en écologie microbienne. Les tests et simulations ont montré qu'à partir d'une taille d'amplicons de 400 pb, l'affiliation phylogénétique avait les meilleurs résultats mais aussi, que la qualité de cette affiliation différait selon la région hypervariable ciblée. La chaîne de traitements mise en place a ensuite été par implémentée dans un contexte de calcul à haute performance, notamment sur un cluster de calcul, pour proposer un service web dédié à l'analyse de la diversité microbienne.

Le cytomégalovirus humain (CMV) appartient à la sous-famille des Betaherpès virus. L’homme est son seul réservoir et il infecte 40 à 90% de la population mondiale. Ce virus, rarement dangereux pour le sujet immunocompétent, représente une réelle menace chez le patient immunodéprimé comme le transplanté d’organe. Après la primo-infection, le CMV diffuse dans tout l’organisme et alterne des phases de latence et de réactivation. Il consacre 20% de son génome à diverses stratégies d’échappement immunitaire.Les objectifs de notre travail sont de décrire dans une première partie 1- la variabilité de six gènes, codant quatre protéines immunomodulatrices (UL18, UL40, UL111a et US3) et deux protéines immunodominantes (IE1 et pp65), dans des souches de CMV directement séquencées à partir de sang total ou du LBA de patients infectés et immunodéprimés, 2- le mécanisme conduisant à cette variabilité 3- la répartition des souches virales dans le sang total et le LBA (compartimentation).La deuxième partie est consacrée à l’expression de la protéine immunomodulatrice pUL40.Nos travaux ont permis de confirmer l’existence d’un polymorphisme notable, supérieur à ce qui est déjà décrit. Des conséquences fonctionnelles pourraient en découler dans les protéines correspondantes. L’étude in silico de la variabilité du CMV met en lumière le rôle clé de la recombinaison comme mécanisme évolutif majeur. Nous n’avons pas mis en évidence de compartimentation des souches virales dans les échantillons analysés.Nos résultats préliminaires indiquent la faisabilité de la sur-expression de la protéine pUL40, permettant ultérieurement de mieux comprendre ses fonctions. / Human Cytomegalovirus (CMV) belongs to the Betaherpesviruses sub-family. Human beings are its sole reservoir and it infects 40 to 90% of the world population. This virus is rarely dangerous for the immunocompetent host, but represents a problematic opportunistic agent in immunocompromised patients, such as transplant recipients. After primary infection, CMV spreads widely in the organism and alternates latency and reactivation phases. CMV dedicates 20% of its genome to various immune escape strategies.Our aims were to describe, in a first part, 1- the variability of six CMV genes, which encode 4 immunomodulatory proteins (UL18, UL40, UL111a and US3) and two immunodominant proteins (IE1 and pp65), after direct amplification and sequencing from whole blood and bronchoalveolar lavages (BAL) taken from infected immune compromised patients, 2- the mechanism responsible for this variability 3- the distribution of CMV strains in whole blood and BAL (compartmentalization).In a second part, we attempted pUL40 expression.Our results confirmed the existence of a noticeable polymorphism, superior to what was previously described. Functional consequences could arise for the corresponding proteins. Our in silico study of CMV variation indicated a key role for recombination as a major evolutionary mechanism. We have observed little CMV compartmentalization among the investigated samples. Our preliminary results indicated pUL40 may be over-expressed, which could allow a better understanding of its functions in a near future.