Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2013. / ENGLISH ABSTRACT: Chronic inflammation and immune activation are hallmarks of HIV infection, resulting in chronic oxidative stress with over-utilization of antioxidant defences, which may contribute to the loss of immune cells and faster disease progression. Low levels of antioxidants in HIV- infected individuals have been associated with frequent opportunistic infections and an increased risk of mortality. HIV infection is also associated with on-going and aberrant activation of both the innate and adaptive immune systems. An important aspect of innate immune stimulation is derived from the leakage of lipopolysaccharide (LPS) across the damaged mucosal lining of the gut in early HIV infection. The impact of this innate immune stimulation on the adaptive arm of the immune system, as represented in this study by levels of CD4+ T-cell activation and death, have not been explored previously in untreated HIV infection. Using an integrated approach of immune activation, inflammation, oxidative stress and ameliorating antioxidant intervention for the first time, this thesis reports the impact of inflammatory induced-oxidative stress on CD4+ T-cells in an in vitro HIV model. In a preliminary study, baseline levels of neutrophil respiratory burst as an in vitro indication of immune stimulation were investigated. The relationships between baseline total antioxidant status (TAS), Red blood cell (RBC) antioxidant enzyme activities (catalase, superoxide dismutase & glutathione peroxidase), lipid peroxidation and glutathione redox ratio and other markers of disease in asymptomatic, untreated HIV infection were also explored. The design and optimization of an assay that could determine the effects of LPS-induced oxidative stress on CD4+ T-cells, was a critical part of this study. The development of this assay enabled the measurement of the effects of selected antioxidant interventions N-acetyl cysteine (NAC) and vitamin C, on LPS-induced CD4+ T-cell activation and death. The results were also correlated with CD4 count, viral load and markers of inflammation (fibrinogen & D-dimers) in HIV-infected and uninfected groups. Neutrophils from HIV-infected persons at rest showed a ―primed‖ response to low stimulating agent, bacterial N-formyl peptides (fMLP), which was significantly (P = 0.04) higher than uninfected individuals. There was increased oxidative stress as evidenced by increased catalase activity, malondialdehyde (MDA) and conjugated dienes (CDs) with a corresponding decrease in antioxidant capacity in HIV-infected individuals with lower CD4 count. NAC in combination with vitamin C, significantly (P = 0.0018) reduced activation of CD4+ T-cells to a greater degree than with either antioxidant alone. NAC and vitamin C individually and in combination significantly (P = 0.05, P = 0.012 and P<0.0001) decreased the expression of the markers of apoptosis, Annexin V and 7-amino-actinomycin (7-AAD). Importantly, the antioxidant combination decreased MDA values and significantly (P = 0.01) increased the glutathione redox ratio in the HIV-infected group. Based on these results, the respiratory burst and LPS-induced activation may be important contributing factors in inflammatory-associated oxidative stress in HIV infection and contribute to the depletion of CD4+ T-cells in the asymptomatic stage of HIV infection. These results also indicate the potential inhibitory effects of NAC and vitamin C in combination as agents that may limit immune activation and inflammation-induced oxidative stress. Importantly, the study showed that at this asymptomatic stage, CD4+ T-cells of the HIV-infected group responded similarly to stimulation as the HIV negative group, indicating that antioxidant defences were still functional and that appropriate early intervention at this stage may be protective against oxidative damage to the immune cells. To the best of our knowledge, this study is the first to use an integrated approach involving not only plasma levels of antioxidant status, but also RBC antioxidant enzyme activities, oxidative damage (lipid peroxidation), inflammation, cellular levels of immune activation and potential ameliorating interventions in evaluating the problem of inflammation-induced oxidative stress in HIV infection. Based on the results of this study, it is envisaged that an insight into the immune activation, inflammatory and oxidative stress status of patients will enable long-term profiling of each patient with a view to individualized therapy. This approach may have a direct impact on patient care in resource-limited settings such as sub-Saharan Africa. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Chroniese inflammasie en immuunaktivering is kenmerke van MIV-infeksie. Dié twee prosesse lei tot chroniese oksidatiewe stres en oorbenutting van antioksidant verdedigingstelsels, wat lei tot die verlies van die immuun selle en vinniger siektevordering. Lae vlakke van antioksidante in MIV-positiewe individue stem ooreen met gereelde opportunistiese infeksies en 'n verhoogde risiko van mortaliteit. MIV-infeksie word ook geassosieer met langdurige en abnormale aktivering van beide die ingebore en aanpasbare immuunstelsels. 'n Belangrike aspek van ingebore immuun stimulasie in die raamwerk van vroeë MIV-infeksie, is die lekkasie van LPS oor die beskadigde slymvlies voering van die dunderm. Die impak van die ingebore immuun stimulasie op die aanpasbare arm van die immuunstelsel, soos aangetoon in hierdie studie deur die vlakke van CD4 T-sel aktivering en apoptose, is nog nie voorheen ondersoek in onbehandelde MIV-infeksie nie. Met behulp van 'n oorspronklike, geïntegreerde benadering van immuun aktivering, inflammasie, oksidatiewe stres en 'n lae vlak van antioksidant intervensie, lewer hierdie tesis verslag oor 'n in vitro model van inflammasie-geïnduseerde oksidatiewe stres op CD4 T-selle. In 'n voorlopige studie, is basislyn vlakke van die neutrofiel respiratoriese uitbarsting as 'n in vitro aanduiding van immuunstimulasie ondersoek. Die verhoudinge tussen basislyn totale antioksidant status (TAS), rooi bloed sel (RBC) antioksidant ensiemaktiwiteit (katalase, superoksied dismutase, en glutatioon peroksidase), lipied peroksidasie en glutatioon redoks-verhouding, asook ander merkers van siektevordering in asimptomatiese, onbehandelde MIV-infeksie is ook ondersoek. Die ontwerp en optimisering van 'n toets wat die effek van LPS-geïnduseerde oksidatiewe stres op CD4 T-selle kan bepaal, was 'n kritieke deel van hierdie studie. Die ontwikkeling van hierdie toets het ook die meting van die effek van toevoeging van twee geselekteerde anti-oksidante, N-asetiel sisteïen (NAC) en vitamien C, op LPS-geïnduseerde CD4 T-sel aktivering en apoptose ondersoek. Die resultate is ook gekorreleer met CD4-telling, virale lading en merkers van inflammasie (fibrinogeen en D-dimere) in groepe met en sonder MIV-infeksie. Neutrofiele van asimptomatiese persone met MIV infeksie, het 'n 'voorbereide' reaksie gehad teen ‗n lae stimulerende agent, bakteriële N-formiel peptied (fMLP), wat beduidend (P = 0,04) hoër was as in individue sonder MIV infeksie. Daar was verhoogde oksidatiewe stres soos bewys deur verhoogde katalase aktiwiteit, malondialdehied (MDA) en gekonjugeerde diëne (CDs), saam met 'n ooreenstemmende afname in anti-oksidant kapasiteit in MIV-positiewe individue met laer CD4-tellings. NAC in kombinasie met vitamien C, het die aktivering van CD4 T-selle beduidend verminder (P = 0,0018), 'n effek wat groter was in vergelyking met elke antioksidant alleen. NAC en vitamien C alleen, en in kombinasie het beduidend die uitdrukking van die merkers van apoptose, Annexin V en 7-AAD verminder (P = 0,05, P = 0.012 en P<0,0001). Wat belangrik is, is dat die afname in MDA waardes as gevolg van antioksidante in kombinasie, 'n beduidende styging in die glutatioon redoks verhouding in die MIV-positiewe groep tot gevolg gehad het. Hierdie resultate het aangetoon dat die respiratoriese uitbarsting en LPS-geïnduseerde aktivering belangrike bydraende faktore mag wees in inflammasie-verwante oksidatiewe stres in MIV-infeksie, wat kan bydra tot die uitputting van CD4 T-selle in die asimptomatiese stadium van MIV-infeksie. Hierdie resultate dui ook aan dat die moontlike inhiberende effekte van NAC en vitamien C in kombinasie, immuun aktivering en geïnduseerde oksidatiewe stres kan beperk. Van belang is die feit dat hierdie studie bewys het dat in die asimptomatiese stadium van MIV-infeksie, CD4 T-selle weens stimulasie dieselfde gereageer het as dié van mense sonder MIV infeksie. Dit het aangedui dat antioksidant verdediging in hierdie stadium nog funksioneel was, en dat 'n toepaslike vroeë intervensie op hierdie stadium beskermend teen immuun-sel oksidatiewe skade kan wees. Tot die beste van ons kennis, is hierdie studie die eerste om 'n geïntegreerde benadering te gebruik, waar plasma vlakke van antioksidant status saam met RBC antioksidant ensiemaktiwiteit, oksidatiewe skade (lipied peroksiidasie), inflammasie, sellulêre vlakke van immuunaktivering, en potensiële beskermende ingrypings ondersoek is in die evaluering van die probleem van oksidatiewe stres in MIV-infeksie wat tot inflammasie lei. Gebaseer op dié resultate, word dit in die vooruitsig gestel dat 'n insig in die status van immuunaktivering, inflammasie, en oksidatiewe stress van pasiënte, dit moontlik sal maak vir langtermyn- beplanning om vir elke pasiënt individuele terapie voor te skryf. Hierdie benadering kan 'n direkte impak op die sorg van pasiënte in hulpbron-beperkte gebiede soos sub-Sahara Afrika hê.

Οι πολυαμίνες είναι μικρά κατιοντικά μόρια απαραίτητα για την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό κυτταρικών διεργασιών και παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική άμυνα έναντι του οξειδωτικού στρες. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να μελετηθεί η διακύμανση στην ενδοκυτταρική συγκέντρωση των πολυαμινών σε κατάσταση οξειδωτικού στρες που προέρχεται από έκθεση σε κάδμιο. / Polyamines, which are small poly-cation molecules, play an important role in cell defense against various kinds of environmental stress. The aim of this study was to investigate how cadmium-induced oxidative stress affects polyamine content in cells, in order to explore the possibility to be used as a biomarker of oxidative stress. To this end, experimental studies were carried out in mussel Mytilus galloprovincialis exposed in aquarium for 15 days to 100 μg/l Cd2+.

Inhibition of disulfide bond formation in Escherichia coli implicates an intricate collaboration of proteins which comprise the glutathione and thioredoxin reducing pathways. Bioengineers have successfully engineered E. coli possessing mutated reducing pathways that promote, rather than inhibit, disulfide bond formation in the cytoplasm. The transcriptome of six such mutant E. coli strains have been characterized using Microarray technology. We find that all mutant strains, exhibit a unique response to oxidative stress, not observed in wild type. Statistical analyses revealed the expression of more than 200 genes that are affected by mutations within the reducing pathways. Significantly up-regulated biological processes include cysteine biosynthesis, histidine biosynthesis, NADH Dehydrogenase I biosynthesis, sugar catabolic processes, and activation of stress responses . The second part of this work describes the construction of an E. coli strain that promotes the complete conversion of glutathione into its seemingly dormant derivative, glutathionylspermidine. This engineered strain can be used in assays designed to evaluate the effectiveness of glutathionylspermidine as a substitute for glutathione and, hopefully, allude to its true metabolic function. / text

Polyglutamine expansion disorders are progressive neurodegenerative diseasesthat are caused by the pathological expansion of polyglutamine repeats. Huntington'sdisease (HD) is a polyglutamine disorder caused by the expansion of an existingpolyglutamine tract in a novel protein, Huntingtin (Htt). Oxidative stress has beenimplicated in the neural dysfunction observed in multiple neurodegenerative conditionsincluding HD. The tumor suppressor p53 is a multifunctional protein that has roles inthe cell cycle, apoptosis and neurodevelopment. The role of p53 in HD-associatedneurodegeneration has been studied but not fully elucidated, nor has the role of p53 inoxidative stress toxicity been fully elucidated.Here I present work that demonstrates polyglutamine expansion inducedalterations to p53 stability, localization, and activity. The transcriptional activity of p53was found to have a role in oxidative stress mediated as well as polyglutaminemediated neurotoxicity in vitro. The expression of p53 was also altered in vivo in amouse model of HD as well as in HD brain.Taken together, these data demonstrate a role for p53 in polyglutamine and oxidativestress toxicity.

Résumé L’objectif de ce travail a été d’évaluer la toxicité du butyrate de sodium (NaBu), un inhibiteur des histones désacétylases (HDACs), et ses mécanismes d’action sur les cellules de cancer du sein humain, les cellules MCF-7 déficientes pour la caspase-3, et lignées dérivées : les cellules MCF- 7/caspase-3, et les cellules VCREMS résistantes à la vincristine, et dans une moindre mesure à la doxorubicine. La contribution de l’apoptose dans la létalité induite par le NaBu a été recherchée dans les cellules MCF-7wt en estimant l’exposition de la phosphatidylsérine ainsi que le clivage de la PARP. La présence de caspase-3, n’a ni amplifié ni accéléré l’apoptose qui a impliqué le rhéostat Bax/Bcl-2 en faveur d’une induction de Bax. La cytostasie du NaBu dans les cellules MCF-7 s’est manifestée par un blocage des cellules en phase G2/M. L’évaluation du niveau d’expression des régulateurs du cycle cellulaire dans les cellules MCF-7wt et MCF-7/caspase-3 a montré une surexpression de p21, de façon indépendante de p53. L’action cytostatique du NaBu a été associée à une accumulation légère et modeste des formes non-phosphorylées de pRB, un facteur dont la phosphorylation par les complexes cycline D/cdk4,6 et cycline E/cdk2 est nécessaire à la transition G1/S. Dans ces conditions, les niveaux de cdk2 et de Cdc25A, une oncoprotéine activatrice de cdk2, sont restés stables. Le NaBu est une molécule à effet pléïotropique, l’utilisation de la trichostatine A, inhibiteur par excellence des HDACs, a permis d’établir la relation de causalité entre l’inhibition des HDACs et la toxicité du NaBu. La plupart des inhibiteurs des HDACs induisent l’apoptose en perturbant le métabolisme oxydatif de la mitochondrie ce qui pourrait modifier le statut redox cellulaire. Nous avons cherché une implication du métabolisme du glutathion (GSH), le thiol anti-oxydant non-protéique majoritaire de la cellule, dans la toxicité induite par le NaBu. Les résultats montrent que le NaBu induit une déplétion du GSH dans les cellules MCF-7wt et dérivées de façon dose-dépendante, corrélée avec la mortalité cellulaire. Devant l’éventualité d’une consommation accrue de GSH par les enzymes associées à son métabolisme, nous avons évalué le niveau des activités des enzymes glutathion peroxydase, glutathion réductase et glutathion S-transférases. Dans les cellules MCF-7, le NaBu a induit de façon significative ces enzymes anti-oxydantes, à l’exception des GSTs, de même que la catalase, une enzyme indépendante de ce système. Les expériences visant à libérer le pool de GSH lié aux protéines ont montré que la déplétion du GSH intracellulaire est parallèle à celle du GSH lié aux protéines. Par conséquent, la consommation du GSH est réellement la cause de la chute du niveau de GSH générant un stress oxydant. La doxorubicine, un inhibiteur des topoisomérases, a une utilisation clinique limitée en raison de ses effets secondaires irréversibles (cardiotoxicité entre autres). Dans le but d’améliorer son efficacité, nous avons expérimenté des combinaisons NaBu/doxorubicine sur les cellules VCREMS et MCF-7, étant donné la capacité du NaBu à induire l’expression des topoisomérases et favoriser la conformation déployée de la chromatine. L’utilisation de la technique isobologramme nous a permis de déterminer les index de combinaison pour une application simultanée ou séquentielle des drogues. Les résultats indiquent que le NaBu sensibilise les cellules VCREMS et MCF-7 à l’action de la doxorubicine. Dans les cellules VCREMS, cet effet s’est produit en dépit de la stimulation des enzymes de détoxication, GSTs et GPX. L’ensemble de ces résultats indique que l’utilisation du NaBu en combinaison avec certains anticancéreux constitue une stratégie très intéressante en cancérothérapie.

Atherosclerosis is a complex inflammatory disease in which oxidative stress is a major protagonist in the development and progression of the atherosclerotic plaque. All biochemical analysis studies of plaque over the past fifteen years have been carried out on whole plaque with no attempt to localise sites of differing biochemical conditions. This study set out to identify in oxidation levels and inflammatory markers in relation to spatial localisation within the plaque. Advanced plaque samples removed during endarectomy were obtained from the Christchurch Hospital Department of surgery and were dissected into 3-5 mm sections along the longitudinal axis prior to analysis. Samples were analysed for vitamin E, neopterin, total cholesterol and markers of oxidative damage to protein and lipids. Neopterin is a marker of inflammation as it is released by activated macrophages yet it has never been measured in plaques. Initial analysis showed that the acid precipitation method for removing protein from samples prior to HPLC neopterin analysis was causing a significant loss in neopterin. A new acetonitrile based protein removal procedure was developed. Markers of oxidative stress and inflammation where shown to vary across the length of an atherosclerotic plaque. This variation allows for localized incidences of high and low radical flux and microenvironments of depleted antioxidants or areas in which the prooxidative actions of molecular components are favoured. Significant correlations were rarely seen in more then one plaque and trends found in the combined data set generally did not hold true in individual plaques. This reflects upon the complexity of the disease, especially at this advanced stage in which the biochemical morphology of individual plaques is extremely diverse. Separation of the plaques into pre-, post-, and bifurcation areas did produce some trends. These can be related to shear stress variations in the blood flow; further investigations into the biochemical differences between these areas may provide a better understanding of the growth and development of the atherosclerotic plaque.

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Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO), molécules dérivées de l’oxygène, sont capables d’oxyder et d’endommager les macromolécules biologiques. Au cours de son cycle de vie, Salmonella typhimurium est exposée à des FAO provenant de deux sources : soit de son métabolisme aérobie, soit du macrophage, sa cellule hôte au cours de l’infection. Parmi les FAO existantes, l’H2O2 est l’une des plus néfastes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la contribution des catalases et des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S.typhimurium. Cinq enzymes ont ainsi été identifiées pour leur capacité à éliminer l’H2O2 : les catalases KatG, KatE, KatN et les peroxyrédoxines AhpCF et TsaA. Des tests de virulence ont également permis de montrer que ces enzymes participaient à l’établissement de la virulence.A l’aide d’une sonde moléculaire capable de détecter et de signaler l’H2O2, nous avons montré que S. typhimurium percevait cette FAO au cours de l’infection dans des macrophages murins. Ces résultats ont souligné l’importance des catalases et des peroxyrédoxines au cours de la vie intracellulaire de S. typhimurium. L’analyse du mutant DahpCF DtsaA Dtpx a également révélé que les peroxyrédoxines AhpCF, TsaA et Tpx contribuaient à la capacité de prolifération de la bactérie dans le macrophage. Enfin, l’étude des méthionine sulfoxyderéductases a montré que les caractéristiques d’un mutant DmsrA DmsrB étaient proches de celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été inactivés dans une souche dépourvue de katG, katE et ahpCF. Dans cette souche accumulant de l’H2O2endogène, la contribution de MsrA et MsrB devient évidente pour lutter contre les effets liés au stress oxydant. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier et de caractériser l’implication de systèmes antioxydants dans la virulence et le métabolisme de S. typhimurium. / Reactive Oxygen Species (ROS), produced from molecular oxygen, can oxidize and damagebiological macromolecules. During its lifestyle, Salmonella typhimurium is submitted to ROScoming from two sources: its aerobic metabolism and its host cell upon infection, themacrophage. Among the ROS, H2O2 is one of the most toxic. In this work, the contribution ofcatalases and peroxiredoxins in the metabolism and the virulence of S. typhimurium wasstudied. Five enzymes are implied in H2O2 degradation, the catalases KatG, KatE, KatN andthe peroxiredoxins, AhpCF and TsaA. Virulence tests showed that these enzymes wereinvolved in virulence. Using a molecular probe able to detect and quantify H2O2, we showedthat S. typhimurium sensed H2O2 during infection in murine macrophages. These resultsunderlined the importance of catalases and peroxoxyredoxines for the intracellular life of S.typhimurium. Analysis of the mutant DahpCF DtsaA Dtpx revealed that the peroxiredoxinsAhpCF, TsaA and Tpx contributed to the bacterial proliferation inside macrophage. Finally,the study of the methionine sulfoxyde reductases showed that the phenotype of the mutantDmsrA DmsrB was related to the wild type strain. Then, msrA and msrB were inactivated in astrain deleted of katG, katE and ahpCF. In this strain impaired in H2O2 degradation, thecontribution of MsrA and MsrB to fight against oxidative stress effect is stronger. Altogether,these results allowed the identification and the contribution of antioxidant systems in S.typhimurium virulence and metabolism.