京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23751号 / 医博第4797号 / 新制||医||1055(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 寺田 智祐, 教授 江藤 浩之, 教授 髙折 晃史 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Kardiovaskuläre Ereignisse bilden die Haupttodesursache in den westlichen Ländern. Mit der Einführung von Clopidogrel, welches am ADP-Rezeptor P2Y12 wirkt, konnte die Mortalität und Morbidität von kardiovaskulären Ereignissen signifikant gesenkt werden. Der P2Y12 gehört als G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) zur größten Gruppe membranständiger Rezeptoren, welche durch ihr ubiquitäres Vorkommen einen idealen Angriffspunkt in der Pharmakotherapie bilden. Zur intelligenten und gezielten Entwicklung von neuen Arzneimitteln bedarf es umfassender Kenntnisse der Struktur- und Wirkungsbeziehung von GPCR. Um den Modellrezeptor P2Y12 strukturell und funktionell zu charakterisieren, wurde eine sättigende Mutagenese in einem funktionell essentiellen Bereich des Rezeptors (Transmembranhelices 6 und 7 sowie 3. extrazellulärer Loop) durchgeführt. Hiermit sollten die Auswirkungen von Punktmutationen auf die Funktionsweise des Rezeptors untersucht werden. Hierfür wurden sättigende Mutantenbibliotheken für 66 Positionen erstellt, wobei jede Aminosäure (AS) durch jede nicht natürlicherweise im humanen P2Y12 vorkommende AS ersetzt wurde (1254 Mutanten). Diese wurden funktionell im Expressionssystem der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit steigenden Agonistenkonzentrationen charakterisiert und anhand ihrer Funktionalität klassifiziert. Dabei wiesen 90,8 ± 1,9 % der Rezeptormutanten keine Wildtypeigenschaften auf. Die Auswertung von 77 Wirbeltierorthologen zeigte ebenso eine hohe Konservierung von 90,7 ± 1,5 % pro Position. Im direkten positionalen Vergleich zwischen evolutionären und in vitro Daten konnte eine Übereinstimmung der in vitro und in vivo Daten von 90,2 % gefunden werden. Die funktionellen Daten wurden in eine Online-Mutantendatenbank eingearbeitet und wurden in einem 3D-Rezeptor-Homologiemodell visualisiert. Damit ist der Beweis geführt worden, dass es mit guter Vorhersagewahrscheinlichkeit möglich ist, von evolutionären Daten Rückschlüsse auf die Relevanz von Mutationen zu ziehen.

Les thrombopathies congénitales sont des pathologies au phénotype hémorragique hétérogène dues à des anomalies fonctionnelles des plaquettes sanguines parfois associées à des anomalies morphologiques et/ou à une thrombopénie. Les outils diagnostic disponibles permettent de corréler une anomalie fonctionnelle plaquettaire à un déficit protéique voire à une mutation d’un gène spécifique. Cependant, en 2015, au moins 50% des thrombopathies restent non étiquetées. Dans ce contexte, le laboratoire d’hémostase de l’EFS Alsace et l’unité INSERM UMR S949 travaillent de concert à l’identification et à la caractérisation de ces pathologies. Ainsi, nous avons mis en évidence trois nouvelles mutations du récepteur P2Y12 dans trois familles différentes. La mutation p.His187Gln a été entièrement caractérisée sur des plaquettes fraiches du patient et dans un modèle cellulaire adapté. La reproduction des deux autres mutations (p.Tyr259Cys et p.Phe95Ser) est en cours. Nous avons par ailleurs identifié une famille dont trois membres sont atteints d’une maladie du pool vide non syndromique et nous suspectons grâce au séquençage d’exome effectué que le transporteur de nucléotides VNUT est impliqué dans la pathologie. / Inherited platelets disorders (IPD) are pathologies associated with heterogeneous bleedingphenotypes. They are due to functional platelets deficiency that may come with morphological abnormalities and/or thrombocytopenia. Available diagnosis tools are used to link a functional deficiency to a protein defect and in some instances to a specific genetic mutation. However, in 2015 at least 50% of IPD are still not identified. In this context, the haemostasis laboratory of the EFS Alsace together with INSERM UMR S949 team are working to diagnose and characterize these pathologies. Thus, we found three new P2Y12 receptor variants in three different families. The mutation p.His187Gln has been fully characterized on blood fresh platelets coming from one patient and in an appropriate cellular model. The reproduction of the two other mutations (p.Tyr259Cys and p.Phe95Ser) is currently ongoing. We also studied a family in which three members are carrying a delta storage pool disease. The full exome sequencing analysis leads us to suspect the involvement of the nucleotides transporter VNUT in this pathology.

Kardiovaskuläre Ereignisse bilden die Haupttodesursache in den westlichen Ländern. Mit der Einführung von Clopidogrel, welches am ADP-Rezeptor P2Y12 wirkt, konnte die Mortalität und Morbidität von kardiovaskulären Ereignissen signifikant gesenkt werden. Der P2Y12 gehört als G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) zur größten Gruppe membranständiger Rezeptoren, welche durch ihr ubiquitäres Vorkommen einen idealen Angriffspunkt in der Pharmakotherapie bilden. Zur intelligenten und gezielten Entwicklung von neuen Arzneimitteln bedarf es umfassender Kenntnisse der Struktur- und Wirkungsbeziehung von GPCR. Um den Modellrezeptor P2Y12 strukturell und funktionell zu charakterisieren, wurde eine sättigende Mutagenese in einem funktionell essentiellen Bereich des Rezeptors (Transmembranhelices 6 und 7 sowie 3. extrazellulärer Loop) durchgeführt. Hiermit sollten die Auswirkungen von Punktmutationen auf die Funktionsweise des Rezeptors untersucht werden. Hierfür wurden sättigende Mutantenbibliotheken für 66 Positionen erstellt, wobei jede Aminosäure (AS) durch jede nicht natürlicherweise im humanen P2Y12 vorkommende AS ersetzt wurde (1254 Mutanten). Diese wurden funktionell im Expressionssystem der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit steigenden Agonistenkonzentrationen charakterisiert und anhand ihrer Funktionalität klassifiziert. Dabei wiesen 90,8 ± 1,9 % der Rezeptormutanten keine Wildtypeigenschaften auf. Die Auswertung von 77 Wirbeltierorthologen zeigte ebenso eine hohe Konservierung von 90,7 ± 1,5 % pro Position. Im direkten positionalen Vergleich zwischen evolutionären und in vitro Daten konnte eine Übereinstimmung der in vitro und in vivo Daten von 90,2 % gefunden werden. Die funktionellen Daten wurden in eine Online-Mutantendatenbank eingearbeitet und wurden in einem 3D-Rezeptor-Homologiemodell visualisiert. Damit ist der Beweis geführt worden, dass es mit guter Vorhersagewahrscheinlichkeit möglich ist, von evolutionären Daten Rückschlüsse auf die Relevanz von Mutationen zu ziehen.