Latrophilin, alternatively named calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL), resembles a prototype of the adhesion class G-protein coupled receptors (GPCRs). Initially identified as a high-affinity receptor for α-latrotoxin, a component of the black widow spider, latrophilins are now associated with various distinct functions, such as synaptic exocytosis, tissue polarity and fertility (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Despite these exploratory efforts the precise subcellular localisation as well as the endogenous ligand of CIRL still remains elusive. In this work genetic experiments, imaging approaches and behavioural studies have been used to unravel the localisation and physiological function of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster. Containing only one latrophilin homolog together with its genetic accessibility and well-established transgenic approaches, Drosophila seemed an ideally suited model organism. The present study showed that dCirl is widely expressed in the larval central nervous system including moto- and sensory neurons. Further, this work revealed that removal of the latrophilin homolog does not greatly affect synaptic transmission but it seems that aspects of the postsynaptic structural layout are controlled by dCIRL in the fruit fly. Additionally, dCirl expression at the transcriptional level was confirmed in larval and adult chordotonal organs, specialised mechanosensors implicated in proprioception (Eberl, 1999). Expression of dCIRL at the protein level could not yet been confirmed in moto- and sensory neurons likely due to low endogenous expression. However, behavioural studies using dCirl knockout mutant larvae indicated a putative mechanosensory function of dCIRL regarding touch sensitivity and locomotion behaviour. The second part of this thesis presents a strategy to examine interactions between several presynaptic proteins in living cells. The attempt described in this work is based on the discovery that GFP when split into two non-fluorescent fragments can form a fluorescent complex. The association of the fragments can be facilitated by fusing them to two proteins that interact with each other. Therefore, the split GFP method enables direct visualization of synaptic protein interactions in living cells. In initial experiments I could show that full length reporter protein fusions with n-Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) and Syntaxin (Syx) allow expression in Drosophila and confirmed that fusion to either end of each synaptic protein did not impair expression or influence the viability of transgenic flies. Further, transgenes containing protein fusions of Syx, Syt, and n-Syb with split GFP fragments were established in previous studies (Gehring, 2010). The present work characterises the interaction of these protein fusions during different stages of synaptic vesicle turnover at active zones such as synaptic vesicle docking at the presynaptic membrane and vesicle fusion. These results suggest that the spGFP assay seems only partly suitable for resolving fast and transient protein-protein interactions at larval Drosophila active zones in vivo. / Latrophilin, auch als Calcium-unabhängiger Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL) bezeichnet, repräsentiert einen Prototyp der Adhäsions G-Protein gekoppelten Rezeptorklasse. Ursprünglich als hoch-affiner Rezeptor für α-Latrotoxin entdeckt, werden Latrophiline heute mit zahlreichen verschiedenen Funktionen, wie synaptischer Exozytose, Gewebepolarität und Fertilität assoziiert (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Trotz dieser Fortschritte sind die genaue subzelluläre Lokalisation sowie der endogene Ligand noch weitgehend unbekannt. Diese Studie verwendet genetische Ansätze, bildgebende Verfahren und Verhaltensstudien, um die Lokalisation und physiologische Funktion des Latrophilinhomologs dCirl in Drosophila melanogaster aufzuklären. Die Tatsache, dass Drosophila nur ein einziges Latrophilin Homolog besitzt, zusammen mit den genetischen Möglichkeiten und den sehr gut etablierten transgenen Methoden, machen die Fruchtfliege zu einem idealen Modellorganismus. Die erhobenen Daten belegen, dass dCirl verstärkt im larvalen Nervensystem, einschließlich motorischer und sensorischer Neurone, exprimiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in dCirl Knockout-Mutanten die basale synaptische Transmission unverändert ist, vermutlich aber Teile der postsynaptischen Struktur durch dCIRL in der Fruchtfliege kontrolliert werden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass dCirl auf Transkriptionsebene in den larvalen und adulten Chordotonalorganen exprimiert wird, spezifische Mechanosensoren, die an der Propriozeption beteiligt sind (Eberl, 1999). Die Expression von dCIRL auf Proteinebene in motorischen und sensorischen Neuronen konnte aufgrund niedriger endogener Expressionslevel noch nicht verifiziert werden. Allerdings deuten Verhaltensstudien, die Berührungsempfindlichkeit und Lokomotion untersuchen, auf eine mögliche mechanosensorische Funktion von dCIRL in den Larven von Drosophila hin. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt eine Strategie auf, die es ermöglicht, das Zusammenspiel verschiedener präsynaptischer Proteine in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Entdeckung, dass sich zwei nicht-fluoreszierende Fragmente des grün leuchtenden Proteins (GFP), zu einem fluoreszierenden Komplex zusammenlagern können. Diese geteilten GFP-Fragmente (split-GFPs) werden mit zwei unterschiedlichen Proteinen fusioniert, die miteinander interagieren. Die split-GFP Methode ermöglicht so eine direkte Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen. In ersten Experimenten konnte ich zeigen, dass Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) und Syntaxin (Syx), die mit vollständigen Fluorophoren markiert wurden, für die Expression in Drosophila geeignet sind und bestätigen, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale Proteinfusion möglich ist. Zudem konnte durch diese Versuche die Überlebensfähigkeit der transgenen Fliegen überprüft werden. In vorangegangenen Studien wurden Transgene hergestellt, die Proteinfusionen von n-Syb, Syt und Syx mit split-GFP Fragmenten enthalten (Gehring, 2010). Die vorliegende Arbeit charakterisiert die Wechselwirkung dieser Proteinfusionen während unterschiedlicher Stufen der synaptischen Vesikelfreisetzung an der aktiven Zone, wie beispielsweise dem Vesikel-docking an der präsynaptischen Membran und der Vesikelfusion. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die split-GFP Technik nur bedingt geeignet ist um schnelle und transiente Protein-Protein Interaktionen an der larvalen aktiven Zone von Drosophila in vivo darzustellen.

Nach der Präparation von gewaschenen Thrombozyten, einem wichtigen Ausgangsmaterial für die experimentelle Forschung oder für die Transfusionsmedizin, tritt bekannterweise ein zunehmender Verlust der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit ein. Die verminderte Funktionsfähigkeit von Thromboyzten nach dem Waschvorgang kann somit auch experimentelle Ergebnisse beeinflussten. Allerdings sind die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen bisher nicht aufgeklärt, sodass in dieser Dissertationsarbeit molekulare sowie auch funktionelle Vorgänge untersucht wurden, die zum bekannten Phänomen des raschen Verlustes der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit gewaschener Thrombozyten führen. Die Wirkung von ADP wird über die drei purinergen Rezeptoren P2Y1, P2X1 und P2Y12 vermittelt wird. Daher wurde zunächst die ADP-induzierte Aggregationsfähigkeit alleine bzw. unter Kostimulation mit Epinephrin oder Serotonin - zwei Induktoren, deren Rezeptoren mit analogen Signalwegen wie die ADP-Rezeptoren P2Y1 bzw. P2Y12 gekoppelt sind - bestimmt. Um Hinweise zu erhalten, wie die Abnahme der ADP-vermittelten Reaktivität von gewaschenen Thrombozyten mit der purinergen Rezeptorexpression und -distribution sowie mit der nachgeschalteten Signalweiterleitung im Zusammenhang steht, wurde zudem die Expression purinerger Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche bzw. die Konzentration von purinergen Rezeptoren im Zytosol gewaschener Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie bzw. ELISA gemessen. Es zeigte sich, dass die Funktion der den purinergen Rezeptoren nachgeschalteten Signalwege während der Lagerungszeit zunehmend beeinträchtigt wird, aber zumindest teilweise erhalten bleibt, wie anhand von Effekten durch Kostimulation mit den Induktoren Epinephrin und Serotonin gezeigt werden konnte. Die Distribution der Rezeptoren zwischen der Thrombozytenoberfläche und den intrazellulären Kompartimenten unterliegt komplexen Prozessen, die induktorabhängig reguliert sind. Eine initiale Zunahme der Expression von ADP-Rezeptoren während der Lagerung von gewaschenen Thrombozyten geht dabei nicht einher mit der Aufrechterhaltung der ADP-induzierten Aggregation. In der Schlussfolgerung ist die fortschreitende Degeneration der ADP-vermittelten Aggregation - neben einem Rückgang der Rezeptorexpression nach mehr als einer Stunde Lagerungszeit - vor allem auf einen funktionellen Verlust der purinergen Rezeptoren zurückzuführen. / Washing of platelets is an important procedure commonly used for experimental studies, e.g. in cardiovascular research, or transfusion medicine. As a well-known phenomenon, responsiveness to adenosine diphosphate (ADP) is reduced in washed platelets. Therefore, washing of platelets may affect experimental results. The underlying molecular mechanisms of the rapid loss of ADP-mediated aggregation of washed platelets have not been thoroughly studied. Aim of this dissertation was to elucidate the molecular and functional processes of this phenomenon. ADP mediates its action via three purinergic receptors P2Y1, P2X1 and P2Y12. At first the ADP-induced aggregation of washed platelets was determined by using ADP alone or ADP combined with the stimulators epinephrine or serotonin. Both mediate their effects via the same signaling pathways as ADP but use different receptors. To get information if the reduced responsiveness to ADP in washed platelets is linked with the receptor expression and distribution, the expression and concentration of purinergic receptors on the platelet surface and in the cytosol of washed platelets was measured by using flow cytometry and ELISA. It was shown that the function of the signaling pathways downstream of the purinergic receptors was increasingly impaired during storage of washed platelets. However, it could be at least partially retained by co-stimulation with epinephrine or serotonin. The distribution of receptors between the platelet surface and the intracellular compartments is based on complex processes which are regulated depending on the different stimulators. An initial increase in the expression of ADP receptors during storage of washed platelets was not associated with the maintenance of ADP-induced aggregation. In conclusion, the progressive decrease of ADP-mediated aggregation is - next to a decrease of expression - mainly caused by functional loss of the purinergic receptors.

Background: A large number of human inherited and acquired diseases and phenotypes are caused by mutations in G protein-coupled receptors (GPCR). Genome-wide association studies (GWAS) have shown that variations in the ADGRD1 (GPR133) locus are linked with differences in metabolism, human height and heart frequency. ADGRD1 is a Gs protein-coupled receptor belonging to the class of adhesion GPCRs. Results: Analysis of more than 1000 sequenced human genomes revealed approximately 9000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human ADGRD1 as listed in public data bases. Approximately 2.4 % of these SNPs are located in exons resulting in 129 non-synonymous SNPs (nsSNPs) at 119 positions of ADGRD1. However, the functional relevance of those variants is unknown. In-depth characterization of these amino acid changes revealed several nsSNPs (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) causing full or partial loss of receptor function, while one nsSNP (F383S) significantly increased basal activity of ADGRD1. Conclusion: Our results show that a broad spectrum of functionally relevant ADGRD1 variants is present in the human population which may cause clinically relevant phenotypes, while being compatible with life when heterozygous.

While life expectancy increases worldwide, treatment of neurodegenerative diseases such as AD becomes a major task for industrial and academic research. Currently, a treatment of AD is only symptomatical and limited to an early stage of the disease by inhibiting AChE. A cure for AD might even seem far away. A rethinking of other possible targets is therefore necessary. Addressing targets that can influence AD even at later stages might be the key. Even if it is not possible to find a cure for AD, it is of great value for AD patients by providing an effective medication. The suffering of patients and their families might be relieved and remaining years may be spent with less symptoms and restrictions. It was shown that a combination of hCB2R agonist and BChE inhibitor might exactly be a promising approach to combat AD. In the previous chapters, a first investigation of dual-acting compounds that address both hCB2R and BChE was illustrated (figure 6.1). A set of over 30 compounds was obtained by applying SARs from BChE inhibitors to a hCB2R selective agonist developed by AstraZeneca. In a first in vitro evaluation compounds showed selectivity over hCB1R and AChE. Further investigations could also prove agonism and showed that unwanted off-target affinity to hMOP receptor could be designed out. The development of a homology model for hCB2R (based on a novel hCB1R crystal) could further elucidate the mode of action of the ligand binding. Lastly, first in vivo studies showed a beneficial effect of selected dual-acting compounds regarding memory and cognition. Since these first in vivo studies mainly aim for an inhibition of the BChE, it should be the aim of upcoming projects to proof the relevance of hCB2R agonism in vivo as well. In addition, pharmacokinetic as well as solubility studies may help to complete the overall picture. Currently, hybrid-based dual-acting hCB2R agonists and selective BChE inhibitors are under investigation in our lab. First in vitro evaluations showed improved BChE inhibition and selectivity over AChE compared to tacrine.78 Future in vitro and in vivo studies will clarify their usage as drug molecules with regard to hepatotoxicity and blood-brain barrier penetration. Since the role of hCB2R is not yet completely elucidated, the use of photochromic toolcompounds becomes an area of interest. These tool-compounds (and their biological effect) can be triggered upon irradiation with light and thus help to investigate time scales and ligand binding. A set of 5-azobenzene benzimidazoles was developed and synthesized. In radioligand binding studies, affinity towards hCB2R could be increased upon irradiation with UV-light (figure 6.2). This makes the investigated compounds the first GPCR ligands that can be activated upon irradiation (not vice versa). The aim of upcoming research will be the triggering of a certain intrinsic activity by an “efficacy-switch”. For this purpose, several attempts are currently under investigation: an introduction of an azobenzene moiety at the 2-position of the benzimidazole core already led to a slight difference in efficacy upon irradiation with UV light. Another approach going on in our lab is the development of hCB1R switches based on the selective hCB1R inverse agonist rimonabant. First in vitro results are not yet available (figure 6.3). / Durch die weltweit steigende Lebenserwartung rückt die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer’schen Krankheit, immer mehr in den Fokus der industriellen und akademischen Forschung. Momentan erfolgt die Behandlung der Alzheimer’schen Krankheit durch die Blockade der AChE nur symptomatisch und in einem Frühstadium. Eine Heilung scheint dabei in weiter Ferne zu liegen, weshalb ein Umdenken nach neuen Ansätzen stattfinden sollte. Der Schlüssel könnte darin liegen, dass man biologischen Funktionen adressiert, die den Verlauf der Alzheimer’schen Krankheit auch in einem späteren Stadium beeinflussen. Selbst wenn eine Heilung in absehbarer Zeit unmöglich bleibt, ist es für die betroffenen Patienten eine erhebliche Erleichterung auf eine effektive Medikation zurückgreifen zu können. Das Leid der Patienten und ihrer Familien könnte dadurch gelindert und die verbleibenden Lebensjahre ohne Symptome und Einschränkungen genossen werden. In den vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass die Kombination aus einem hCB2R Agonisten und einem BChE Hemmer genau diesen vielversprechenden Ansatz verfolgt. Ein erster Entwicklungsansatz von dual-aktiven hCB2R Agonisten / BChE Hemmern wurde in den Kapiteln 3 und 4 ausführlich dargestellt (Abb. 7.1). Ein Set von 30 verschiedenen Verbindungen wurde synthetisiert, indem die Erkenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen von anderen BChE Hemmern auf einen von AstraZeneca entwickelten selektiven hCB2R Agonisten angewendet wurden. Erste in vitro Untersuchungen zeigten eine hohe Selektivität gegenüber hCB1R und AChE auf. Desweiteren verhielten sich alle getesteten Substanzen wie Agonisten. Nachdem ausgewählte Substanzen auf ihre „off-target“ Wechselwirkung mit dem hMOP Rezeptor untersucht wurden, konnten diese strukturellen Merkmale in nachfolgenden Entwicklungsbemühungen berücksichtigt werden. Die Entwicklung eines hCB2R Homologiemodells (basierend auf einer erst kürzlich veröffentlichten hCB1R Kristallstruktur) lieferte wertvolle Informationen zum Bindemodus und der Wirkweise der Liganden am Rezeptor. Schlussendlich konnte in einer ersten in vivo Studie bewiesen werden, dass ausgewählte dual-aktive Substanzen eine positive Auswirkung auf das Gedächtnis und die kognitiven Eigenschaften haben. Da diese in vivo Untersuchungen hauptsächlich die Hemmung der BChE berücksichtigen, wäre es sinnvoll, in zukünftigen Studien den Einfluss der hCB2R Agonisten zu untersuchen. Pharmakokinetik- und Löslichkeitsstudien könnten zudem helfen, das Gesamtbild zu komplettieren. Im Moment befinden sich auch dual-aktive hCB2R Agonisten / BChE Hemmer in der Entwicklung, die den Hybrid-Ansatz verfolgen. Erste in vitro Untersuchungen dazu ergaben vielversprechende Ergebnisse mit einer guten Selektivität gegenüber AChE und einer erhöhten Hemmung der BChE verglichen mit Tacrin.78 Es wird Gegenstand zukünftiger in vitro und in vivo Untersuchungen sein, herauszufinden, ob sich diese Hybride mit Hinblick auf Hepatotoxizität und Blut-Hirnschrankengängigkeit als Wirkstoffe eignen. Da die Rolle des hCB2R noch nicht komplett erforscht ist, erfreut sich die Entwicklung von sog. „tool-compounds“ großen wissenschaftlichen Interesses. Durch die Bestrahlung mit Licht können diese „tool-compounds“ (und ihr nachgeschalteter biologischer Effekt) gesteuert werden. Eine genauere Untersuchung von Zeitskalen und Ligandbindung an den Rezeptor wird dadurch ermöglicht. Ein Set von 5-Azobenzolbenzimidazolen wurde zu diesem Zwecke entwickelt und synthetisiert. In Radioligandbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Affinität gegenüber dem hCB2R durch die Bestrahlung mit UV-Licht erhöhen lässt (Abb. 7.2). Diese Eigenschaft macht die entwickelten Substanzen zu den ersten GPCR-Liganden, die durch Licht aktiviert werden können (nicht umgekehrt wie bei den bisher beschriebenen photochromen GPCR-Liganden). Ziel zukünftiger Forschungsbemühungen wird die Steuerung einer bestimmten intrinsischen Aktivität / Effekts durch die Bestrahlung mit Licht sein. Zu diesem Zwecke werden aktuell mehrere Herangehensweisen untersucht: die Einführung eines Azobenzol-Strukturelements an Position 2 des Benzimidazol-Grundgerüsts zeigte in ersten in vitro Untersuchungen bereits Unterschiede bei Bestrahlung mit UV-Licht. Eine weitere Herangehensweise ist die Entwicklung von „Photo-Schaltern“ auf Basis von Rimonabant, einem selektiven hCB1R inversen Agonisten. Hier stehen erste in vitro Ergebnisse jedoch noch aus (Abb. 7.3).

Kardiovaskuläre Ereignisse bilden die Haupttodesursache in den westlichen Ländern. Mit der Einführung von Clopidogrel, welches am ADP-Rezeptor P2Y12 wirkt, konnte die Mortalität und Morbidität von kardiovaskulären Ereignissen signifikant gesenkt werden. Der P2Y12 gehört als G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) zur größten Gruppe membranständiger Rezeptoren, welche durch ihr ubiquitäres Vorkommen einen idealen Angriffspunkt in der Pharmakotherapie bilden. Zur intelligenten und gezielten Entwicklung von neuen Arzneimitteln bedarf es umfassender Kenntnisse der Struktur- und Wirkungsbeziehung von GPCR. Um den Modellrezeptor P2Y12 strukturell und funktionell zu charakterisieren, wurde eine sättigende Mutagenese in einem funktionell essentiellen Bereich des Rezeptors (Transmembranhelices 6 und 7 sowie 3. extrazellulärer Loop) durchgeführt. Hiermit sollten die Auswirkungen von Punktmutationen auf die Funktionsweise des Rezeptors untersucht werden. Hierfür wurden sättigende Mutantenbibliotheken für 66 Positionen erstellt, wobei jede Aminosäure (AS) durch jede nicht natürlicherweise im humanen P2Y12 vorkommende AS ersetzt wurde (1254 Mutanten). Diese wurden funktionell im Expressionssystem der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit steigenden Agonistenkonzentrationen charakterisiert und anhand ihrer Funktionalität klassifiziert. Dabei wiesen 90,8 ± 1,9 % der Rezeptormutanten keine Wildtypeigenschaften auf. Die Auswertung von 77 Wirbeltierorthologen zeigte ebenso eine hohe Konservierung von 90,7 ± 1,5 % pro Position. Im direkten positionalen Vergleich zwischen evolutionären und in vitro Daten konnte eine Übereinstimmung der in vitro und in vivo Daten von 90,2 % gefunden werden. Die funktionellen Daten wurden in eine Online-Mutantendatenbank eingearbeitet und wurden in einem 3D-Rezeptor-Homologiemodell visualisiert. Damit ist der Beweis geführt worden, dass es mit guter Vorhersagewahrscheinlichkeit möglich ist, von evolutionären Daten Rückschlüsse auf die Relevanz von Mutationen zu ziehen.

Background: A large number of human inherited and acquired diseases and phenotypes are caused by mutations in G protein-coupled receptors (GPCR). Genome-wide association studies (GWAS) have shown that variations in the ADGRD1 (GPR133) locus are linked with differences in metabolism, human height and heart frequency. ADGRD1 is a Gs protein-coupled receptor belonging to the class of adhesion GPCRs. Results: Analysis of more than 1000 sequenced human genomes revealed approximately 9000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human ADGRD1 as listed in public data bases. Approximately 2.4 % of these SNPs are located in exons resulting in 129 non-synonymous SNPs (nsSNPs) at 119 positions of ADGRD1. However, the functional relevance of those variants is unknown. In-depth characterization of these amino acid changes revealed several nsSNPs (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) causing full or partial loss of receptor function, while one nsSNP (F383S) significantly increased basal activity of ADGRD1. Conclusion: Our results show that a broad spectrum of functionally relevant ADGRD1 variants is present in the human population which may cause clinically relevant phenotypes, while being compatible with life when heterozygous.

Kardiovaskuläre Ereignisse bilden die Haupttodesursache in den westlichen Ländern. Mit der Einführung von Clopidogrel, welches am ADP-Rezeptor P2Y12 wirkt, konnte die Mortalität und Morbidität von kardiovaskulären Ereignissen signifikant gesenkt werden. Der P2Y12 gehört als G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) zur größten Gruppe membranständiger Rezeptoren, welche durch ihr ubiquitäres Vorkommen einen idealen Angriffspunkt in der Pharmakotherapie bilden. Zur intelligenten und gezielten Entwicklung von neuen Arzneimitteln bedarf es umfassender Kenntnisse der Struktur- und Wirkungsbeziehung von GPCR. Um den Modellrezeptor P2Y12 strukturell und funktionell zu charakterisieren, wurde eine sättigende Mutagenese in einem funktionell essentiellen Bereich des Rezeptors (Transmembranhelices 6 und 7 sowie 3. extrazellulärer Loop) durchgeführt. Hiermit sollten die Auswirkungen von Punktmutationen auf die Funktionsweise des Rezeptors untersucht werden. Hierfür wurden sättigende Mutantenbibliotheken für 66 Positionen erstellt, wobei jede Aminosäure (AS) durch jede nicht natürlicherweise im humanen P2Y12 vorkommende AS ersetzt wurde (1254 Mutanten). Diese wurden funktionell im Expressionssystem der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit steigenden Agonistenkonzentrationen charakterisiert und anhand ihrer Funktionalität klassifiziert. Dabei wiesen 90,8 ± 1,9 % der Rezeptormutanten keine Wildtypeigenschaften auf. Die Auswertung von 77 Wirbeltierorthologen zeigte ebenso eine hohe Konservierung von 90,7 ± 1,5 % pro Position. Im direkten positionalen Vergleich zwischen evolutionären und in vitro Daten konnte eine Übereinstimmung der in vitro und in vivo Daten von 90,2 % gefunden werden. Die funktionellen Daten wurden in eine Online-Mutantendatenbank eingearbeitet und wurden in einem 3D-Rezeptor-Homologiemodell visualisiert. Damit ist der Beweis geführt worden, dass es mit guter Vorhersagewahrscheinlichkeit möglich ist, von evolutionären Daten Rückschlüsse auf die Relevanz von Mutationen zu ziehen.