Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432438.pdf: 2038170 bytes, checksum: 505895940d1e38c8e3925441d22f197d (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / Vermes do g?nero Angiostrongylus s?o parasitos intra-arteriais em roedores. A. costaricensis vive no sistema mesent?rico, enquanto A. cantonensis habita as art?rias pulmonares de ratos. No homem, hospedeiro acidental destas parasitoses, elas causam a gastroenterite eosinof?lica e meningite devido ? migra??o de adultos jovens de A. cantonensis nos tecidos do sistema nervoso central. O exame parasitol?gico de fezes n?o pode ser utilizado para diagn?stico humano das angiostrongil?ases porque n?o s?o encontradas larvas nas fezes, o que torna importante o desenvolvimento de t?cnicas moleculares. Os m?todos de imunodiagn?stico empregando ant?genos brutos apresentam reatividade cruzada com outras parasitoses e tamb?m resultados falso-negativos. Com o objetivo de aprimorar o diagn?stico molecular das angiostrongil?ases, direcionamos os esfor?os na tentativa de reduzir a complexidade dos extratos de ant?genos a fim de encontrar prote?nas mais espec?ficas e sens?veis para o diagn?stico. Primeiramente foi testado o uso de ant?genos de A. cantonensis para o diagn?stico de A. costaricensis pela t?cnica de ELISA. A partir disso, ant?genos de tubo reprodutor (TR) de f?meas de A. cantonensis foram fracionados por diversas t?cnicas e sua reatividade a soros controle foi testada por Western blot (WB). Colunas de prote?na A foram incubadas com soro de pacientes infectados, por?m este fracionamento n?o teve sucesso. Foi realizado o fracionamento subcelular dos extratos TR e com a fra??o de ant?genos de membrana celular (F2) foi realizado o fracionamento por ponto isoel?trico. As fra??es de pH apresentaram reatividade espec?fica aos soros controle positivos quando submetidas ao WB, sugerindo que as prote?nas encontradas possam ser importantes alvos para o diagn?stico das angiostrongil?ases. A possibilidade de clonar as prote?nas de interesse para produ??o em grande escala, poder? constituir fonte permanente de ant?genos com redu??o do volume de trabalho e do emprego de animais no laborat?rio

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432505.pdf: 1390397 bytes, checksum: 39fab4614d11925a0667ad6e40789290 (MD5) Previous issue date: 2011-03-22 / Em focos de introdu??o recente da esquistossom?se, como Esteio na regi?o metropolitana de Porto Alegre, a parasitose ocorre com baixas preval?ncias e cargas parasit?rias, resultando em dificuldades para o diagn?stico parasitol?gico, em virtude da sensibilidade inadequada dos m?todos cl?ssicos. O principal objetivo deste trabalho foi otimizar o desempenho de m?todos de diagn?stico, em situa??es que os ovos nas fezes s?o um evento raro. A estrat?gia foi examinar grandes quantidades de fezes, o que resultou na descri??o e avalia??o de um novo m?todo de diagn?stico para detec??o de ovos de Schistosoma mansoni nas fezes denominado Helmintex. Este ? um m?todo de concentra??o, onde as fezes passam por uma sequ?ncia de sedimenta??o espont?nea, tamisagem, centrifuga??o com acetato de etila (Ritchie) e uma etapa final onde os ovos s?o isolados atrav?s de intera??o com part?culas paramagn?ticas em um campo magn?tico. Ap?s a concentra??o, na etapa de detec??o dos ovos todo o sedimento resultante ? analisado atrav?s de microscopia ?ptica. Na segunda etapa deste trabalho o objetivo foi avaliar o desempenho da PCR em tempo real (tecnologia Taqman) como alternativa de m?todo de detec??o no sedimento final do Helmintex, substituindo a an?lise microsc?pica. Para realiza??o da primeira etapa, ovos de S. mansoni foram adicionados em 30 g de fezes negativas para a infec??o, formando suspens?es de 0,1 a 1,34 ovos por grama de fezes (opg), e as fezes foram submetidas a todas as etapas de concentra??o do m?todo. Para cada suspens?o testada foi encontrado pelo menos 1 ovo em 20% (0.1 opg); 50% (0.24); 50% (0.34); 60% (0.67); 80% (1.0) e 100% (1.34) das tentativas testadas para cada suspens?o. Para a avalia??o do desempenho da PCR, "primers" e sonda para o gene da citocromo-C oxidase subunidade 1 foram desenhados para a amplifica??o do DNA de S. mansoni. Para a extra??o do DNA foram avaliados 4 protocolos diferentes. Foram preparadas suspens?es de ovos em ?gua destilada e fezes, contendo 1, 10, 20, 40 e 80 ovos. E amostras de 1000 ovos foram extra?das para a constru??o de uma curva padr?o da estimativa de concentra??o de DNA, para verifica??o do limite de detec??o da rea??o. A amplifica??o do DNA do parasito pode ser vista em todas as suspens?es testadas, inclusive a que continha 1 ovo. Dos 4 protocolos de extra??o avaliados, o Illustra Tissue and Cell GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), um kit de extra??o comercial, foi o que apresentou o melhor rendimento. A curva padr?o constru?da a partir de 1000 ovos apresentou um limite de detec??o de 1 pg com reprodutibilidade de 13,8%. Considerando 100% de reprodutibilidade, a rea??o apresentou limite de detec??o de 100 pg. O novo m?todo Helmintex descrito neste trabalho representa grande avan?o no diagn?stico da esquistossom?se em infec??es com baixas cargas parasit?rias, al?m disso, apresentam-se 2 op??es de m?todos de detec??o (visualiza??o microsc?pica e amplifica??o de DNA dos ovos pela PCR em tempo real). Estes avan?os contribuem para o esfor?o em curso de reduzir mundialmente a morbidade e a dissemina??o das ?reas de transmiss?o das esquistossom?ases