A brucelose é uma doença altamente contagiosa, responsável por grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. É causada por bactérias do gênero Brucella, cujas espécies e seus biovares costumam ser caracterizados pelo isolamento e identificação de características fenotípicas da colônia. Dificuldades como, o perigo na manipulação dos microrganismos, processos laboriosos de tipificação, demora na obtenção de resultados e a instabilidade de características fenotípicas ou isolamento de linhagens atípicas dificultam a tipificação e encorajaram a busca de técnicas mais sensíveis e específicas, como a PCR, que resolveria as dificuldades e facilitaria a investigação epidemiológica dos casos humanos e animais. Diversas análises e o sequenciamento de determinados genes e do genoma completo de algumas espécies, demonstraram a existência de polimorfismos únicos no DNA das brucelas, que podem ser utilizados na sua identificação. Baseado nas dificuldades de identificação e na descoberta de polimorfismos únicos no DNA bacteriano das espécies, nosso objetivo foi desenvolver primers específicos para identificação de seis espécies do gênero B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis e B. neotomae, e padronizar PCRs que permitissem identificá-las com maior sensibilidade e rapidez. Tentamos caracterizar marcadores moleculares para o desenho de primers espécie-específicos, através da amplificação randômica e clonagem dos fragmentos específicos, sem resultados satisfatórios. Apenas um primer para B. abortus foi conseguido quando foram analisados os polimorfismos já descritos na literatura. Assim, realizou-se o alinhamento múltiplo das sequências dos cromossomos I e II das espécies de Brucella, que permitiu a identificação de vários eventos polimórficos específicos para cada espécie, dos quais foram escolhidas regiões potenciais para o desenho de sete primers (dois para B. canis, B. melitensis e B. ovis, e outro para B. canis/B. suis) que tiveram sua especificidade analítica verificada com o programa Primer BLAST e testada nas 18 cepas de referência de Brucella, compreendendo a B. abortus, B. melitensis, B. suis e seus biovares, além da <iB. canis, B. ovis e B. neotomae, e em 231 isolados de campo, incluindo B. abortus, B. canis e B. suis. Os testes de especificidade dos primers resultaram na amplificação do fragmento esperado de quase todas as cepas de referência e de campo, exceto para o primer de B. canis e o de B. canis/B. suis. Estes resultados sugerem que os marcadores desenhados são promissores na diferenciação das espécies. / Brucellosis is responsible for great economic losses and serious impact on public health. This infectious disease is caused by bacteria of the genus Brucella, whose species and their respective biovars are often characterized by isolation and identification of differences in phenotypic tests. The complex and laborious process of Brucella typing, comprising the danger in handling of microorganisms, delay in obtaining results and instability of phenotypic characteristics or isolation of atypical strains, stimulated the search for more sensitive and specific techniques such as PCR. This technique would facilitate the epidemiological investigation of human and animal cases. Several analyses even as sequencing of certain genes and the complete genome of some species, demonstrated the existence of polymorphisms in the DNA of Brucella, which can be used to identify them. Due to typing difficulties and discovery of single polymorphisms in DNA bacterial species, our goals were to develop specific primers for identification of six species of the genus B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis and B. neotomae and standardize PCRs to identify them with greater sensitivity and speed. We tried to characterize species-specific molecular markers using random amplification and cloning of specific fragments to design primers, without satisfactory results. Only one primer based on polymorphisms already described in the literature was successful for B. abortus specie differentiation. Thus, we performed the multiple alignment of the complete sequences of chromosomes I and II of Brucella species. This approach allowed the identification of several specie-specific polymorphic events, from which potential regions were chosen for the design of seven primers (two for B. canis, B. melitensis and B. ovis, and one for B. canis / B. suis). The analytical specificity of all primers was verified with the Primer BLAST software. Tests with specific primers were performed on 18 reference strains of Brucella, including all the six species of the genus Brucella and 231 field strains of B. abortus, B. canis and B. suis. The PCRs showed the expected fragment amplification in almost all reference and field strains, except for the B. canis and the B. canis / B. suis primers. Ours results suggest that these PCRs are able for Brucella species differentiation.

A brucelose é uma doença altamente contagiosa, responsável por grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. É causada por bactérias do gênero Brucella, cujas espécies e seus biovares costumam ser caracterizados pelo isolamento e identificação de características fenotípicas da colônia. Dificuldades como, o perigo na manipulação dos microrganismos, processos laboriosos de tipificação, demora na obtenção de resultados e a instabilidade de características fenotípicas ou isolamento de linhagens atípicas dificultam a tipificação e encorajaram a busca de técnicas mais sensíveis e específicas, como a PCR, que resolveria as dificuldades e facilitaria a investigação epidemiológica dos casos humanos e animais. Diversas análises e o sequenciamento de determinados genes e do genoma completo de algumas espécies, demonstraram a existência de polimorfismos únicos no DNA das brucelas, que podem ser utilizados na sua identificação. Baseado nas dificuldades de identificação e na descoberta de polimorfismos únicos no DNA bacteriano das espécies, nosso objetivo foi desenvolver primers específicos para identificação de seis espécies do gênero B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis e B. neotomae, e padronizar PCRs que permitissem identificá-las com maior sensibilidade e rapidez. Tentamos caracterizar marcadores moleculares para o desenho de primers espécie-específicos, através da amplificação randômica e clonagem dos fragmentos específicos, sem resultados satisfatórios. Apenas um primer para B. abortus foi conseguido quando foram analisados os polimorfismos já descritos na literatura. Assim, realizou-se o alinhamento múltiplo das sequências dos cromossomos I e II das espécies de Brucella, que permitiu a identificação de vários eventos polimórficos específicos para cada espécie, dos quais foram escolhidas regiões potenciais para o desenho de sete primers (dois para B. canis, B. melitensis e B. ovis, e outro para B. canis/B. suis) que tiveram sua especificidade analítica verificada com o programa Primer BLAST e testada nas 18 cepas de referência de Brucella, compreendendo a B. abortus, B. melitensis, B. suis e seus biovares, além da <iB. canis, B. ovis e B. neotomae, e em 231 isolados de campo, incluindo B. abortus, B. canis e B. suis. Os testes de especificidade dos primers resultaram na amplificação do fragmento esperado de quase todas as cepas de referência e de campo, exceto para o primer de B. canis e o de B. canis/B. suis. Estes resultados sugerem que os marcadores desenhados são promissores na diferenciação das espécies. / Brucellosis is responsible for great economic losses and serious impact on public health. This infectious disease is caused by bacteria of the genus Brucella, whose species and their respective biovars are often characterized by isolation and identification of differences in phenotypic tests. The complex and laborious process of Brucella typing, comprising the danger in handling of microorganisms, delay in obtaining results and instability of phenotypic characteristics or isolation of atypical strains, stimulated the search for more sensitive and specific techniques such as PCR. This technique would facilitate the epidemiological investigation of human and animal cases. Several analyses even as sequencing of certain genes and the complete genome of some species, demonstrated the existence of polymorphisms in the DNA of Brucella, which can be used to identify them. Due to typing difficulties and discovery of single polymorphisms in DNA bacterial species, our goals were to develop specific primers for identification of six species of the genus B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis and B. neotomae and standardize PCRs to identify them with greater sensitivity and speed. We tried to characterize species-specific molecular markers using random amplification and cloning of specific fragments to design primers, without satisfactory results. Only one primer based on polymorphisms already described in the literature was successful for B. abortus specie differentiation. Thus, we performed the multiple alignment of the complete sequences of chromosomes I and II of Brucella species. This approach allowed the identification of several specie-specific polymorphic events, from which potential regions were chosen for the design of seven primers (two for B. canis, B. melitensis and B. ovis, and one for B. canis / B. suis). The analytical specificity of all primers was verified with the Primer BLAST software. Tests with specific primers were performed on 18 reference strains of Brucella, including all the six species of the genus Brucella and 231 field strains of B. abortus, B. canis and B. suis. The PCRs showed the expected fragment amplification in almost all reference and field strains, except for the B. canis and the B. canis / B. suis primers. Ours results suggest that these PCRs are able for Brucella species differentiation.

Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.

Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.