Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T20:14:15Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 9176452 bytes, checksum: 5f4f63aa09fa5845db797f2aa69a9236 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T20:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 9176452 bytes, checksum: 5f4f63aa09fa5845db797f2aa69a9236 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Asthma is a condition characterized by reversible chronic inflammation and hyper responsiveness of airways, with a pharmacotherapy well established. However, due to asthma heterogeneity, some patients did not respond to treatment. So, trying to contribute in the development of new candidates to antiasthmatic drugs, we decided to assess a possible relaxant action of PDE4 inhibitors N-sulfonilhidrazonic derivatives (LASSBio-448, -1624, -1832, -1846, -1847, -1848, -1849, -1850 and -1851) in functional model of trachea from non-asthmatic and asthmatic guinea pigs, as well as to characterize the action mechanism of the most promising derivative. All experimental protocols were approved by CEUA/UFPB (certificate 0610/11). Initially, we realize the implementation and standardization of a guinea pig asthma model using ovalbumin (OVA) as sensitizer agent, and it was histologically observed morphological changes associated to asthma, as hypertrophy of the smooth muscle layer, inflammatory cells infiltration and vascular abnormalities. Moreover, rings from sensitized guinea pig trachea showed to be responsive to OVA, differently to the non-sensitized animals. Functionally, the contractile agonist CCh presented efficacy and potency similar between non asthmatic and asthmatic animals, differently histamine demonstrated to be equipotent between the animals, but with a higher efficacy in the asthmatic guinea pigs. In turn, the relaxant agonist aminophylline and isoprenaline presented similar potency and efficacy in both non asthmatic and asthmatic animals. Generally, in the step of pharmacological screening of N-sulfonilhidrazonic derivatives, they presented a equipotent relaxant action and independent of relaxing factors derived from epithelium in both animals groups, with exception of LASSBio-1850 that presented a low efficacy (< 50%) and LASSBio-1847 with a 4 fold higher potency on asthmatic guinea pigs. Among the derivatives evaluated, LASSBio-1632, -1846 and -1847 were the one with higher pharmacological potency on asthmatic animals, and LASSBio-1847 was the most promising and selected to the step of characterization of action mechanism on non-asthmatic and asthmatic guinea pig. Such as LASSBio-1847 was synthetized as a PDE4 inhibitor, an enzyme that hydrolyze cAMP, and the β2 -adrenergic receptors are responsible to initiate the signaling involved to cAMP production on airway smooth muscle, we used propranolol, a β2-adrenergic non-selective blocker, to assess the participation of these receptors. So, we observed that the LASSBio-1847 relaxant curve was shifted showing the involvement of β2 -adrenergic receptors in both animal groups. Since these receptors lead to adenylyl cyclase (AC) activation, we decided to investigate its participation in the LASSBio-1847 relaxant effect. Therefore, we used forskolin, an AC activator, and evidenced that the relaxant curve was 54- and 4-fold shifted to the left in non-asthmatic and asthmatic animals, respectively, indicating that LASSBio-1847 could be acting in a synergic or facilitate the AC activation. β2-adrenergic receptors/AC activation lead to cAMP production that is regulated be its hydrolyzes by PDEs. To evaluate the contribution of these enzymes, we used aminophylline, a non-selective inhibitor of PDEs, and concentration-response curve to aminophylline was shifted to the left in the presence of LASSBio-1847 with gain in the potency around 147- and 4-fold in non-asthmatic and asthmatic animals, respectively, suggesting that the derivative acts by a possible PDE inhibition. The effector the β2-adrenergic receptors/AC/cAMP pathway is PKA, so to confirm its positive modulation by LASSbio-1847, we used H-89, a PKA inhibitor, observed a reduction in the relaxant potency of the derivative, confirming the modulation of this pathway. Until now, all finding have indicated a possible increase in [cAMP]c and to confirm this hypothesis it was carried out the measurement of tissue levels of cAMP by ELISA, that demonstrated that LASSBio-1847 indeed increase the [cAMP]c in a similar magnitude to rolipram, a selective PDE4 inhibitor, in both animals. Thus, it was established the implantation of the guinea pig asthma model, as well as the evaluated N-sulfonilhidrazonic derivatives presented relaxant activity on guinea pig trachea in both non asthmatic and asthmatic animals in an epithelium independent manner, and LASSBio-1847 showed to be one of the most promising compounds in relax this organ by activation of β2-adrenergic receptors/AC/cAMP pathway and inhibit the PDEs, culminating to elevation of [cAMP]c. / A asma é uma doença caracterizada por inflamação crônica e hiper-responsividade reversível das vias aéreas, apresentando uma farmacoterapia bem estabelecida. No entanto, devido a heterogeneidade dessa enfermidade, alguns pacientes não respondem apropriadamente ao tratamento. Assim, visando ajudar no processo de desenvolvimento de novos candidatos a fármacos antiasmáticos, decidiu-se avaliar a possível ação relaxante de uma série de derivados N-sulfonilidrazônicos inibidores de PDE4 (LASSBio-448, -1624, -1832, -1846, -1847, -1848, -1849, -1850 e -1851) em um modelo funcional de traqueia de cobaias não asmáticos e asmáticos, bem como elucidar o mecanismo de ação do derivado mais promissor. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo CEUA/UFPB (certidão 0610/11). Inicialmente, realizou-se a implantação e padronização de um modelo de asma em cobaias utilizando ovalbumina (OVA) como agente sensibilizador, onde se observou histologicamente, alterações morfológicas inerentes ao quadro asmático, como hipertrofia da camada muscular lisa, presença de infiltrado de células inflamatórias e anormalidades vasculares. Além disso, os anéis de traqueia de cobaias sensibilizados mostraram-se responsivos à OVA, diferente dos não sensibilizados. Funcionalmente, o agonista contrátil CCh apresentou potências e eficácias relativas similares entre os animais não asmáticos e asmáticos, diferentemente do que se observou para o agonista contrátil histamina, que demonstrou ser equipotente entre os dois grupos de animais, mas com uma maior eficácia nos animais asmáticos. Por sua vez, os agonistas relaxantes aminofilina e isoprenalina apresentaram potências e eficácias relativas similares entre os animais não asmáticos e asmáticos. De modo geral, na etapa de triagem farmacológica dos derivados N-sulfonilidrazônicos, estes apresentaram um efeito relaxante equipotente e independente dos fatores relaxantes derivados do epitélio tanto nos animais não asmáticos quanto nos asmáticos, com exceção do LASSBio-1850 que mostrou apenas uma eficácia moderada (< 50%) e o LASSBio-1847 que apresentou um incremento de potência de cerca de 4 vezes nos animais asmáticos. Dentre os derivados avaliados, o LASSBio-1632, -1846 e -1847 foram os de maior potência farmacológica nos animais asmáticos, sendo esse último o mais promissor e selecionado para a etapa de caracterização do mecanismo de ação nos cobaias não asmáticos e asmáticos. Como o LASSBio-1847 foi sintetizado como um inibidor das PDE4, uma enzima que hidrolisa o cAMP, e os receptores adrenérgicos-β2 são um dos principais responsáveis pela sinalização que leva a produção desse segundo mensageiro no músculo liso das vias aéreas, utilizou-se o propranolol, um bloqueador adrenérgico-β não seletivo, para avaliar a participação desses receptores. Observou-se que houve desvio da curva de relaxamento do LASSBio-1847 para a direita evidenciando a participação dos receptores adrenérgico-β em ambos os grupos de animais. Como esses receptores levam a ativação da adenilil ciclase (AC), decidiu-se investigar o envolvimento da mesma no efeito relaxante do LASSBio-1847. Para tanto, utilizou-se a forscolina, um ativador de AC, e evidenciou-se que a curva de relaxamento da forscolina na presença do derivado foi deslocada para a esquerda em cerca de 54 e 4 vezes nos animais não asmáticos e asmáticos, respectivamente, mostrando que o LASSBio-1847 poderia agir sinergicamente ou favorecer a ativação da AC. A ativação do receptor adrenérgico-β2/AC leva a produção de cAMP que é contrabalanceada por sua hidrólise via PDEs. Para avaliar o envolvimento dessas enzimas, utilizou-se a aminofilina, um inibidor não seletivo de PDEs. A curva-concentração resposta à aminofilina foi desviada para a esquerda na presença do LASSBio-1847 com potencialização do efeito em torno de 147 e 4 vezes, nos animais não asmáticos e asmáticos, respectivamente, sugerindo que o efeito do derivado ocorre por uma possível inibição de PDEs. O efetor da via receptor adrenérgico-β2/AC/cAMP é a PKA, assim para confirmar a modulação positiva dessa via utilizou-se o H-89, um inibidor da PKA, e observou-se que houve uma atenuação na resposta relaxante do derivado, confirmando a modulação dessa via. Até o momento, todos os achados nos indicaram um possível aumento na [cAMP]c e para confirmar essa hipótese foi realizado a medida dos níveis teciduais de cAMP por ELISA, que demonstrou que o LASSBio-1847 realmente eleva a [cAMP]c, numa magnitude similar ao rolipram, em ambos os grupos de animais. Assim, ficou estabelecido a implantação do modelo de asma em cobaias, além de se evidenciar que os derivados N-sulfonilidrazônicos avaliados possuem atividade relaxante em traqueia de cobaias não asmáticos e asmáticos de forma independente de epitélio, sendo o LASSBio-1847 um dos mais promissores em relaxar esse órgão por ativar a via de transdução do receptor β2/AC/cAMP/PKA e inibir as PDEs, que culmina com a elevação da [cAMP]c.

Ischemic injury in the heart is followed by an increase in SNS activity and the higher this activity, the poorer patient outcomes. An index of SNS activity in models of ischemia can be achieved by measuring NE, β-AR, and perhaps indirectly PDE4 to give an intracellular aspect on SNS signaling. A 20 minute ischemia-reperfusion was induced in a rat model with physiological measurements at 2-5 weeks post IR. At 3 weeks post IR, rats displayed increased PDE4 expression, decreased β 1-AR expression, increased plasma NE, decreased tissue NE storage, increased Doppler E/A ratio and unchanged LV ejection fraction. PET analysis with FDG revealed no infarct at 2 weeks, while analysis with [13N]NH3 displayed no resting flow defect but revealed trends in flow reserve impairment as early as 2.5 weeks with recovery at 5 weeks post-surgery. Applications of this model could be non-invasive imaging of PDE4 with (R)-[11C]Rolipram PET at early time points for development towards prognostic and therapy guidance in humans.

Die Herzinsuffizienz ist trotz zahlreicher Therapiemöglichkeiten immer noch eine der häufigsten chronischen Erkrankung und Todesursachen in westlichen Industrienationen. Eine zentrale Rolle in der Regulation der effizienten Herzkontraktion nimmt die zyklisches Adenosin-3’,5’-monophophat(cAMP)-Signalkaskade ein, wobei Veränderungen in der Kompartimentierung des sekundären Botenstoffes bisher nicht vollständig verstanden sind. Ziel dieser Studie war es deshalb Regulationsmechanismen des lokalen cAMP-Pools der Mikrodomäne der ATP-abhängigen Calciumpumpe 2a des sarkoplasmatischen und endoplasmatischen Retikulums (SERCA2a) in kardialen Mausmyozyten unter den pathologischen Rahmenbedingungen der Herzinsuffizienz zu untersuchen. Hierfür wurde ein post-Myokardinfarkt Mausmodell an einer transgene Mauslinie verwendet, die einen cAMP-abhängigen auf Förster-Resonanz-Energietransfer(FRET)-basierenden Biosensor, lokalisiert in der SERCA2a-Mikrodomäne, in vivo exprimiert. Mit Hilfe von Echtzeit-FRET-Messungen an frisch isolierten, lebenden Kardiomyozyten wurden die Beiträge der am Herzen relevanten Phosphodiesterase(PDE)-Familien zur Begrenzung des lokalen cAMP-Pools in der SERCA2a-Domäne 12 Wochen nach Myokardinfarkt gemessen und mit einer Kontrollgruppe (Sham) verglichen. Hierbei zeigte sich, dass in der Mikrodomäne sowohl unter Ruhebedingungen, als auch nach β-adrenerger Vorstimulation, eine signifikante Aktivitätsminderung der PDE4, verglichen mit der Sham-Gruppe, nachweisbar ist. Da dies mit Veränderungen im lokalen cAMP-Pool der die SERCA2a reguliert einhergeht, bietet diese Studie also eine interessante Grundlage für die weitere Untersuchung der im Krankheitsfall auftretenden Funktionsabweichungen.

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