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Expressió de la 6-fosfofructo-2-cinasa / fructosa-2,6-bisfostafasa en el teixit testicular.Gómez Martínez, Marta 17 October 2008 (has links)
Els resultats que es presenten en aquesta memòria aporten informació que ens permet donar un pas més en el coneixement de la regulació transcripcional del gen Pfkfb4 i conseqüentment de la regulació de la via glucolítica en el testicle. En primer lloc, hem identificat el moment d'aparició dels gens Pfkfb3 i Pfkfb4 durant el desenvolupament del testicle de rata, tant en períodes prenatals com en períodes postnatals. Així mateix, vam aïllar fraccions cel·lulars del testicle de rata (Sertoli, Germinals i una fracció somàtica formada per una barreja de cèl·lules peritubulars i de Leydig), trobant que PFKFB4 només s'expressava en aquella fracció germinal, mentre que PFKFB3 ho feia tant a la fracció germinal com a les fraccions somàtiques (Sertoli, Leydig y Peritubulars). Pel que fa a l'expressió d'ambdues proteïnes en els espermatozoides, es va comprovar que PFKFB3 s'expressava en els espermatozoides més immadurs mentre que PFKFB4 ho feia en els madurs i que es localitzava, de forma principal, a la zona del cap de l'espermatozoide i, de forma secundària, al flagel. En segon lloc, hem identificat diferents seqüències consens en el promotor del gen Pfkfb4 on podrien unir-se factors de transcripció per regular el gen. També hem identificat el seu inici de transcripció. Entre les seqüències consens d'unió per factors de transcripció es destaquen els elements de resposta de HIF-1 (HRE), els elements de resposta de Sp-1 i els elements de resposta a c-Myc (E-box). Hem observat que el gen Pfkfb4 respon, incrementant la seva transcripció, a la hipòxia i que aquesta resposta seria depenent de la presència del factor HIF1-alfa actiu a la cèl·lula. A més, la presència de Sp-1 activa la transcripció basal del gen i en situacions d'hipòxia augmentaria la resposta a aquesta de Pfkfb4. Per la seva banda, c-Myc reduiria la resposta transcripcional de Pfkfb4 tant en normòxia com en hipòxia.En tercer lloc, hem estudiat la regulació hormonal del gen Pfkfb4, trobant que la testosterona per se no produeix cap efecte ni en el gen Pfkfb4 ni en la proteïna. Si no que la regulació hormonal ve regulada a través de les cèl·lules de Sertoli, les quals sota l'estimulació hormonal de la testosterona produeixen un factor soluble que seria el responsable de controlar l'expressió de Pfkfb4 i Pfkfb3 en les cèl·lules germinals. Aquests resultats obtinguts sobre l'expressió i regulació de dos isoenzims de la proteïna PFK-2 en el testicle, assenyalarien a la proteïna PFK-2 com a un dels punts claus en el control de la via glucolítica durant l'espermatogènesi dels mamífers.
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Untersuchung der Spleißvariante UBI2K4 des PFKFB3 Gens in humanen GlioblastomzellenHeydasch, Ulli 29 October 2018 (has links)
Glioblastome sind die aggressivsten und häufigsten Hirntumore beim Menschen und entziehen sich weiterhin einem kurativen Therapieansatz. Wie die meisten malignen Tumore zeigen Glioblastome den sogenannten Warburg Effekt, eine gesteigerte aerobe Glykolyse. Ein Schlüsselenzym der Glykolyse ist die 6-Phosphofrukto-1-kinase (PFK-1), deren stärkster allosterischer Aktivator Fruktose-2,6-bisphosphat (F2,6BP) ist. Die zelluläre Konzentration von F2,6BP wird von dem bifunktionalen Enzym 6-Phosphofrukto-2-kinase/Fruktose-2,6-bisphosphatase (PFK-2) reguliert. Im Menschen existieren vier PFK-2-Isoenzyme (PFKFB1-4), die gewebespezifisch exprimiert werden. Die PFKFB3 hat das höchste Kinase/Bisphosphatase- Aktivitätsverhältnis von 710:1 innerhalb der PFK-2-Familie und wird in Tumorzelllinien und verschiedenen malignen Tumoren überexprimiert. In humanem Hirngewebe wurden sechs alternative Spleißvarianten der PFKFB3-mRNA (UBI2K1–6) beschrieben, welche sich in der C-terminalen Region unterscheiden. Neuere Untersuchungen im Verlauf dieser Arbeit ergaben, dass es auch Spleißvarianten gibt, die in der N-terminalen Region variieren, sodass insgesamt 10 Spleißvarianten der PFKFB3 bekannt sind. Die spezifischen Funktionen im Zellstoffwechsel wurden bisher nur für die Spleißvariante UBI2K5 untersucht, die der anderen Spleißvarianten sind weitestgehend unbekannt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Bedeutung der PFKFB3 Spleißvariante UBI2K4 in Glioblastomen für den Stoffwechsel und das Wachstum dieser Tumore am Modell der humanen U87-Glioblastomzelllinie aufzuklären und die These, dass die UBI2K4 eine proliferationshemmende Funktion hat, zu überprüfen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels stabiler Transfektion von HEK-293-Zelllen mit einem pTER-Vektor und gleichzeitiger transienter Transfektion bei U87- und HEK-293-Zellen mit synthetischer siRNA ein Knockdown der UBI2K4 mRNA und des Proteins erzielt. Es stellte sich heraus, dass der UBI2K4 Knockdown in beiden Zelllinien zu einer reduzierten Viabilität und Zellproliferation führte. Die Verdopplungszeiten waren prolongiert und auch das dreidimensionale Wachstum in Soft-Agar-Kulturen war reduziert. Bei HEK-293-Zellen wurde der UBI2K4 Knockdown durch einen signifikanten Anstieg der UBI2K5 mRNA Expression kompensiert. Die UBI2K6 Expression blieb unverändert. Bei U87-Zellen, deren native UBI2K4 mRNA Expression sehr gering ist, wurde eine UBI2K5 mRNA Reduktion bei gleichzeitiger Hemmung der UBI2K4 Expression festgestellt, während die UBI2K6 mRNA leicht zunahm. Weiterhin konnte im Western Blot gezeigt werden, dass in HEK-293-Zellen neben der Spleißvariante UBI2K4, auch als Variante 4 bezeichnet, auch die neu entdeckte Variante 5 exprimiert wird. In U87-Zellen konnte nur die Expression der Variante 4 nachgewiesen werden. In einem Antikörper-Mikroarray wurde gezeigt, dass die UBI2K4 die Expression insbesondere von Proteinen mit immunmodulatorischen Eigenschaften, apoptose-induzierenden Proteinen und Proteinen der Zellkommunikation und des Metabolittransports beeinflusst.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das native Protein der UBI2K4 in HEK-293- und U87-Zellen überexprimiert. Die Zellen mit einer gesteigerten UBI2K4 Proteinkonzentration konnten schneller proliferieren und zeigten eine gesteigerte Zellviabilität. DIese Ergebnisse korrelieren mit den bereits beschriebenen Ergebnissen des UBI2K4 Knockdowns im ersten Teil dieser Arbeit.
Die vermutete inverse Korrelation der UBI2K4 Konzentration und der Proliferationsrate konnte hier nicht bestätigt werden. Vielmehr scheint die UBI2K4 so wie die Spleißvariante UBI2K5 der PFKFB3 ebenfalls in höheren Konzentrationen proliferationsfördernd zu wirken. Dies scheint überaus wahrscheinlich, da die im Antikörper-Mikroarray beeinflussten Proteine auch darauf hindeuten.:1 EINFÜHRUNG UND AUFGABENSTELLUNG 8
1.1 GLIOBLASTOME 8
1.2 DIE GLYKOLYTISCHE AKTIVITÄT IN TUMORZELLEN – DER WARBURG-EFFEKT 12
1.2.1 REGULATION DER GLYKOLYSE IN TUMORZELLEN 16
1.2.2 DIE 6-PHOSPHOFRUKTO-2-KINASE/FRUKTOSE-2,6-BISPHOSPHATASE ISOENZYME 18
1.3 AUFGABENSTELLUNG 26
2 MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 LABORAUSSTATTUNG 27
2.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 27
2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 29
2.4 STANDARDS 29
2.5 ENZYME 29
2.6 ANTIKÖRPER 29
2.7 REAGENZIENSYSTEME 30
2.8 BAKTERIENSTÄMME 30
2.9 ZELLLINIEN 31
2.10 PLASMIDE 31
2.11 OLIGONUKLEOTIDE 31
2.12 RIBONUKLEINSÄUREN 34
2.13 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 34
2.13.1 KULTIVIERUNG UND PASSAGIEREN VON ZELLEN 34
2.13.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 35
2.13.3 KONSERVIERUNG VON ZELLEN 35
2.13.4 TRANSFEKTION UND SELEKTION 35
2.13.5 PROLIFERATIONSTESTS 38
2.14 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 40
2.14.1 ARBEITEN MIT BAKTERIENKULTUREN 40
2.14.2 PRÄPARATION VON NUKLEINSÄUREN 42
2.14.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSÄUREN 43
2.14.4 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 43
2.14.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 44
2.14.6 REVERSE TRANSKRIPTION 45
2.14.7 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 45
2.14.8 DNA-SEQUENZIERUNG 47
2.14.9 GEN-SILENCING DURCH SIRNA 48
2.14.10 ÜBEREXPRESSION DER SPLEIßVARIANTE UBI2K4 51
2.14.11 MYCOPLASMENTEST 52
2.15 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 53
2.15.1 ZELLLYSE UND BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 53
2.15.2 SDS-PAGE 53
2.15.3 WESTERNBLOT-ANALYSE 54
2.16 ANTIKÖRPER MIKROARRAY 55
2.17 STATISTISCHE ANALYSEN 55
2.18 SOFTWARE 56
3 ERGEBNISSE 57
3.1 AUSWAHL DER ZELLLINIE 57
3.2 KNOCKDOWN DER UBI2K4 DURCH STABILE UND TRANSIENTE TRANSFEKTION 59
3.2.1 KLONIERUNG DER PTER-EXPRESSIONSPLASMIDE FÜR DIE STABILE TRANSFEKTION 59
3.2.2 STABILE TRANSFEKTION MITTELS PTER-PLASMIDEN 62
3.3 NACHWEIS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DIE MRNA EXPRESSION 64
3.3.1 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN STABIL TRANSFIZIERTEN HEK-293-ZELLEN 64
3.3.2 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN STABIL TRANSFIZIERTEN HEK-293-ZELLEN MIT ZUSÄTZLICHER TRANSIENTER TRANSFEKTION MITTELS SIRNA 65
3.3.3 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN TRANSIENT TRANSFIZIERTEN U87-ZELLEN 67
3.4 EXPERIMENTE MIT ZELLEN BEI KNOCKDOWN DER UBI2K4 70
3.4.1 EINFLUSS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DAS WACHSTUM VON HEK-293-ZELLEN 70
3.4.2 EINFLUSS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DIE KOLONIEBILDUNG VON HEK-293-ZELLEN IN SOFT-AGAR-KULTUREN 71
3.5 KOLORIMETRISCHE TESTS BEI KNOCKDOWN DER UBI2K4 73
3.5.1 EINFLUSS DES UBI2K4 KNOCKDOWN AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON HEK-293-ZELLEN 73
3.5.2 EINFLUSS DES UBI2K4 KNOCKDOWN AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON U87-ZELLEN 74
3.6 ERGEBNISSE DES ANTIKÖRPER MIKROARRAY 75
3.7 ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 DURCH STABILE / TRANSIENTE TRANSFEKTION 78
3.7.1 KLONIERUNG DER PCDNA3.1-EXPRESSIONSPLASMIDE 78
3.8 NACHWEIS DER ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 AUF DIE MRNA EXPRESSION 79
3.9 KOLORIMETRISCHE TESTS BEI ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 81
3.9.1 EINFLUSS DER UBI2K4 ÜBEREXPRESSION AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON HEK-293-ZELLEN 81
3.9.2 EINFLUSS DER UBI2K4 ÜBEREXPRESSION AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON U87-ZELLEN 82
4 DISKUSSION 85
4.1 AUSWAHL DER ZELLLINIEN 85
4.2 GENERIERUNG STABILER ZELLLINIEN MIT UBI2K4-, UBI2K5- UND UBI2K6-KNOCKDOWN 87
4.2.1 KNOCKDOWN DER PFKFB3 SPLEIßVARIANTEN DURCH STABILE TRANSFEKTION IN HEK-293- UND U87-ZELLEN 89
4.3 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN HEK-293- UND U87-ZELLEN MITTELS TRANSIENTER TRANSFEKTION 90
4.4 ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 IN HEK-293 UND U87-ZELLEN 95
4.5 MIKROARRAY 97
4.5.1 PROTEINE MIT EINER SIGNIFIKANTEN KONZENTRATIONSERHÖHUNG 98
4.5.2 PROTEINE MIT EINER SIGNIFIKANTEN KONZENTRATIONSERNIEDRIGUNG 100
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 104
6 LITERATURVERZEICHNIS 107
7 ANLAGEN 129
7.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 129
7.2 TABELLENVERZEICHNIS 131
8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 132
9 LEBENSLAUF 133
10 DANKSAGUNG 134
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