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E-selectin is an endothelial adhesion molecule important in the recruitment of leukocytes to the bone marrow and inflammatory tissues; moreover, it has also been implicated in cancer metastasis and as a critical mediator of chemoresistance. This study investigated the effects triggered by the binding of E-selectin on acute myeloid leukemia (AML) cell lines regarding the activation of significant signaling pathways and their impact on biological functions. We observed that upon treatment with a recombinant E-selectin construct on AML cells, there was an activation of the AKT/NF-κB pathways, which are known to be central regulators of many cellular processes, including survival and proliferation. We found that the E-selectin-mediated activation varied in rate and amplitude among AML cell lines spanning differentiation blockage at different stages. Furthermore, we found that E-selectin binding in HL-60 and KG1-a cells sensitized the cells to daunorubicin (DNR), a chemotherapy drug commonly used to treat AML. The observed chemosensitivity could be linked to the decrease of Aldo Keto Reductases (AKR) protein levels upon E-selectin treatment, which is known to metabolize DNR and reduce its cytotoxicity. Additionally, we explored the role of exosomes as a regulator of the generation of therapy resistance by examining the effects treatment with KG1-a derived exosomes, a cell line that exhibits higher chemoresistance compared to other AML cell lines, had on viability in HL-60 cells upon chemotherapy. We found that even in the absence of KG1-a cells, exosomes were sufficient to provide an increase in chemoresistance. Overall, these studies explore properties exerted by AML cells that could lead to further understanding of AML and thus the development of potential therapeutic targets to overcome challenges currently found in the treatment of this disease.

Protein phosphorylation is utilized universally as a mechanism of signal transduction. However, the use of tyrosine phosphorylation by bacteria has been a matter of dispute. Conventional wisdom dictated that "prokaryotic phosphorylation" was typified by phosphorylation of histidine and aspartate residues of proteins, while "eukaryotic phosphorylation" was characterized by modification of serine, threonine, or tyrosine residues. Increasing numbers of reports have emerged challenging the traditional view of "prokaryotic" and "eukaryotic" phosphorlyation. One of the strongest links unifying prokaryotic and eukaryotic protein phosphorylation to date is IphP, a genomically-encoded dual-specificity protein phosphatase from the cyanobacterium Nostoc commune UTEX 584 bearing the active-site signature sequence of eukaryotic tyrosine-specific and dual-specificity protein phosphatases. The catalytic properties and substrate specificity of IphP were examined in detail. The enzyme was able to discriminate among a variety of exogenous peptides and proteins. Kinetic studies revealed that IphP favors protein / peptide substrates over low molecular weight compounds. Heparin effected IphP activity in a substrate-dependent manner. Enzyme activity toward casein (P-Ser) and MAP kinase (P-Thr/P-Tyr) was stimulated in the presence of the polyanion, whereas activity was inhibited by heparin toward other protein substrates. Both stimulation and inhibition by heparin were dose-dependent. The ability to stimulate IphP activity toward select substrates was attributed to the ability of heparin to recruit the enzyme and substrate to the same microenvironment. To facilitate future genetic studies examining the role of tyrosine phosphorylation in cyanobacteria, we searched for evidence of protein tyrosine phosphorylation in Anabaena PCC 7120. In a collaborative effort with the laboratory of Dr. Potts, tyrosine phosphorylated proteins were identified in Anabaena utilizing several approaches, including comparative labelling with alpha- vs gamma-32P-ATP, phosphoamino acid analysis, and selective hydrolysis with a tyrosine specific protein phosphatase. Together, these data unequivocally demonstrate the presence of tyrosine-phosphorylated proteins in Anabaena PCC 7120. Extracts of Anabaena PCC 7120 were examined for protein tyrosine phosphatase activity. An apparent PTP activity was detected, partially purified, and characterized. The protein phosphatase was ~38kDa by SDS-PAGE and sucrose density gradient centrifugation and displayed dual-specificity protein phosphatase (DSP) activity in vitro. The enzyme was localized to the periplasm and was thus assigned the title PAD, for Periplasmic Anabaena DSP. Periplasmic phosphoproteins of ~120 and 55 kDa that had been radiolabelled in vitro were dephosphorylated by partially purified PAD. PAD activity varied in vivo ~5-fold in a rhthymic, seemingly diurnal manner. Periplasmic proteins, including the 55kDa protein, were labelled in vivo and the degree of radiolabel incorporated into these proteins varied inversely with PAD activity. / Ph. D.

La protéine multifonctionnelle p54nrb est impliquée dans le contrôle transcriptionnel couplée aux phénomènes de maturation des ARN messagers. La transcription et l'épissage sont inhibés en mitose et la phosphorylation de nombreux facteurs participe à ce phénomène. Dans le laboratoire, il a été montré que p54 est hyperphosphorylée en mitose et interagit de façon phosphodépendante avec le régulateur mitotique Pinl (enzyme qui isomérise un lien proline précédé d'un site phosphoryle Thréonine/Sérine). Le rôle de cette interaction est méconnu mais permet de dire que p54 est régulé par phosphorylation en entrée de mitose. La protéine p54 est diffuse dans le nucléoplasme et est également concentrée avec ses partenaires PSF et PSP1 dans les paraspeckles, des compartiments nucléaires à structure dépendante d'un ARN non codant NEAT1. Il a été récemment montré qu'une association entre l'ARN qui structure les paraspeckles et p54nrb permet de maintenir l'intégrité de ces compartiments. Étant donné l'implication de p54nrb dans de nombreux procédés majeurs, l'objectif de ma thèse a été de comprendre le rôle de la phosphorylation mitotique de p54nrb. La localisation, les interactions protéiques et les propriétés de liaison à l'ARN ont été étudiées. Ces expériences ont permis de conclure que p54nrb reste en complexe avec les protéines PSF et PSP1 mais perd son affinité de liaison à l'ARN en mitose via la phosphorylation d'un résidu en amino-terminal (T15). Par contre, la liaison aux homoribopolymères de Guanine (G) ainsi qu'avec l'ARN non codant NEAT1 (riche en G) ne sont pas compromises par la phosphorylation mitotique. Ces résultats ont permis d'établir de nouvelles propriétés fonctionnelles pour la protéine p54nrb. Par ailleurs, j'ai aussi voulu caractériser la phosphatase responsable de sa déphosphorylation en fin de mitose et les premiers résultats impliquent l'action de la phosphatase PPL De plus, le rôle de l'interaction entre Pinl et p54nrb a été étudié dans la possibilité que Pinl puisse être impliqué dans le processus de déphosphorylation de p54nrb. En conclusion, l'ensemble des travaux de cette thèse a permis de mieux caractériser les fonctions de la protéine multifonctionnelle p54nrb notamment dans le cadre de sa phosphorylation mitotique.

Purified S6/H4 kinase (Mr 60,000) requires autophosphorylation for activation. A rabbit anti-S6/H4 kinase peptide (SVIDPVPAPVGDSHVDGAAK) antibody recognized both the S6/H4 kinase holoenzyme and catalytic domain. Immunoreactivity with p60 kinase protein, and S6/H4 kinase activity were precisely correlated in fractions obtained from ion exchange chromatography of P1798 lymphosarcoma extracts. An enzyme which catalyzed the MgATP-dependent phosphorylation and activation of S6/H4 kinase coeluted with immunoreactivity from Mono 5, but not Mono Q chromatography. Since S6/H4 kinase is homologous with rac-activated PAK65, the observation that phosphorylation is also required for activation suggests a complex mechanism for in vivo activation of the S6/H4 kinase.

La kinase Cdk8 est impliquée dans la régulation de la transcription. Pourtant, cette protéine est retrouvée sur la chromatine lors de la réplication dans le modèle d'extrait d'œufs de xénope, où la transcription n'est pas active. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de Cdk8 sur la chromatine en cours de réplication.Les résultats de ma thèse montrent que Cdk8 est impliquée dans la réplication de l'ADN. Le recrutement de Cdk8 sur la chromatine est concomitant avec le recrutement de certaines protéines du complexe de pré-réplication, bien qu'elle ne soit pas accumulée au niveau des foyers de réplication.Cependant, la déplétion de Cdk8 induit des défauts de réplication de l'ADN.Ces défauts ne sont pas induits par une collision entre le réplisome et la machinerie transcriptionnelle. En effet, l'ARN polymérase II, engagée sur la chromatine mais inactive en condition normale, est moins abondante sur la chromatine en absence de Cdk8.La déplétion de Cdk8 conduit à la diminution du recrutement des complexes de pré-réplication et des complexes de pré-initiation de la réplication. Cette diminution conduit à une baisse du taux de réplication sans activation du checkpoint intra-S. L'ensemble de mes résultats montrent que Cdk8 est nécessaire à une réplication normale de l'ADN. Plusieurs mécanismes semblent être mis en jeu, à savoir, un défaut de recrutement de la machinerie de réplication, l'accumulation de la protéine Adenomatous polyposis coli (APC) sur l'ADN ainsi que des modifications post-traductionnelles des histones. / The Cdk8 kinase is involved intranscriptional regulation.This protein is found on chromatin during DNA replication in xenopus egg extract model when transcription is not active. My PhD project was to characterize Cdk8 functions on chromatin during replication.My results show that Cdk8 is involved in DNA replication.Cdk8 is not found at replication foci , but its recruitment on chromatin occurs at the same time as several components of the pre-replication complex.Moreover, Cdk8 depletion leads to DNA replication defects.These defects are not induced by collision between the replisome and transcriptional regulators (RNA polymerase II and transcription factors). Indeed, RNA polymerase II, which is on chromatin in an inactive form under normal conditions, is less abundant on chromatin in absence of Cdk8.Cdk8 depletion leads to a decrease in pre-replication complexes and pre-initiation complexes recruitment. This decrease induces a reduction in DNA replication rate without activating the intra-S checkpoint.My data show that Cdk8 is necessary for proper DNA replication. It seems that Cdk8 depletion involves several mechanisms : altered replication machinery recruitment, presence of Adenomatous Polyposis Coli (APC) protein on DNA, and post-traductional modifications of histones.

Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation. / The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.

La protéine FADD (Fas associated death domain) est l’adaptateur clé de la voie de signalisation apoptotique dépendante des récepteurs de mort de la famille du TNF (tumor necrosis factor). Au cours des dix dernières années, il est apparu évident qu’au-delà de son rôle majeur dans la mort cellulaire, FADD est impliqué dans d’autres processus biologiques comme le développement embryonnaire, la réponse immunitaire innée ou encore la progression du cycle cellulaire. De même, il est devenu clair que la localisation subcellulaire de FADD est déterminante pour sa fonction. Identifier les voies de régulation de l’expression de la protéine est donc d’une importance capitale. En 2008, notre équipe a mis en évidence, dans un modèle murin de la thyroϊde, un nouveau mécanisme de régulation de l’expression de la protéine via la sécrétion. En parallèle, le laboratoire a rapporté que la présence de FADD dans le sérum de patients cancéreux était corrélée à l’agressivité des tumeurs et l’inflammation. (Tourneur et al, 2012). L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre le mécanisme par lequel FADD était sécrété, et de déterminer, le cas échéant, les modalités de sa régulation. Un troisième objectif est apparu au cours de la thèse : identifier de nouveaux modes de régulation de l’expression de FADD. Au moyen d’une lignée modèle humaine, nous avons montré que l’expression de la protéine humaine pouvait être régulée via une voie non-conventionnelle de sécrétion, tout comme dans le modèle murin. En parallèle de la caractérisation de cette sécrétion, nous avons montré que celle-ci pouvait être régulée par la kinase anti-apoptotique CK2 (casein kinase 2). Enfin, nous montrons que la CK2 régule la localisation nucléaire de FADD via une phosphorylation dépendante de la sous-unité régulatrice de la kinase et que la CK2 pourrait interagir directement avec FADD. Ces résultats constituent la première démonstration de la régulation de FADD par sécrétion par des cellules humaines et les premiers à rapporter un nouveau mode de régulation de la localisation subcellulaire de FADD par la CK2. Les conséquences de ces résultats en regard des fonctions connus de FADD sont discutées / The FADD protein (Fas associated death domain) is the key adaptor molecule of the apoptotic signaling pathway triggered by death receptors of the TNF (Tumor necrosis factor) superfamily. During the last decade, it became obvious that, in addition to its major role in cell death, the protein was also involved in other biological processes like the embryonic development, the immune response or even cell cycle progression. Evidence also showed that the protein sub-cellular localization was a key determinant to its functions. Therefore, the identification of underlying regulatory mechanisms dictating FADD expression was of significant importance. In 2008 our laboratory identified, in a thyroid murine model, a new mechanism controlling FADD expression, namely via secretion. We discovered that the loss of FADD expression from tumor cells, by secretion, could be correlated to cancer aggressiveness as well as inflammation (Tourneur 2012). The goal of this thesis work was to apprehend the mechanism by which FADD was secreted and determine, in that case, the modalities of this regulation. A third objective of this work was to identify new potential regulatory pathways of FADD expression. By means of a human cell line model, we showed that, similarly to the mouse model, the expression of human FADD could be regulated via unconventional secretion. In parallel to the characterization of the secretory process itself, we demonstrated that secretion could be negatively regulated by the anti-apoptotic kinase CK2 (casein kinase 2). Finally, we showed that CK2 could regulate FADD nuclear localization via a regulatory sub-unit-dependent phosphorylation and that FADD and CK2 could directly interact. These results are the first to demonstrate that human FADD expression could be regulated via secretion and that FADD sub-cellular localization could be modulated by CK2. The consequences of such regulation with regards to known FADD functions are discussed

L’intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé du cycle viral du VIH-1 puisque celle-ci catalyse l’insertion stable du génome viral dans celui de la cellule infectée. D’autre part, l’IN participe également à de nombreuses étapes du cycle viral (transcription inverse, import du complexe de préintégration, bourgeonnement…). L’étape d’intégration elle-même fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et viraux interagissant avec l’IN. Certains sont connus et étudiés (LEDGF/P75, TNPO3…), mais il est très probable qu’un très grand nombre de ces partenaires soient encore méconnus malgré leur importance. Depuis quelque année, le rôle des modifications post-traductionnelles de l’IN a commencé à être étudié. En effet plusieurs études montrent que la régulation de l’activité de l’IN pourrait se faire via de telles modifications. Mon travail de thèse s’est orienté sur trois questions autour de ces deux aspects. -Nous avons identifié plusieurs phosphorylations de l’IN par spectrométrie de masse et mis en évidence le rôle essentiel de la phopshorylation de la sérine 24 pour l’infection virale. -Le rôle de la kinase cellulaire GCN2 a été étudié. Nous avons pu montrer un effet restrictif de la protéine sur le cycle viral amenant à un arrêt de la traduction à un temps court après l’infection au VIH-1. L’interaction entre GCN2 et l’IN a été mise en évidence. L’étude du domaine d’interaction entre l’IN et GCN2 a permis la caractérisation d’un résidu essentiel de l’IN, le E85. -L’impact du facteur de réparation RAD51 sur la réplication virale a été étudié. Nous avons montré un effet inhibiteur de cette protéine. Ce travail a permis l’identification d’une molécule chimique RS-1 capable d’inhiber l’intégration dans les cellules infectées via la stimulation de RAD51. / The integrase (IN) of HIV-1 is a key enzyme of the viral cycle of HIV-1 since it catalyzes the stable integration of the viral genome into that of the infected cell. Furthermore, the IN also participates in many steps of the viral cycle (reverse transcription, import of preintegration complex, budding ...). The integration step itself involves many cellular and viral partners interacting with IN. Some of them are studied (LEDGF/p75, TNPO3 ...) but it is very likely that many of these partners are still unknown despite their importance. Recently, the role of post-translational modifications of the IN began to be studied. In fact several studies show that the regulation of the activity of IN could be done through such modifications.My thesis work focused on three issues: -We identified several phosphorylations of IN by mass spectrometry and identified the crucial role of serine 24 to viral infection. -The role of GCN2 cellular kinase was studied. We have shown a restrictive effect of the protein on the viral cycle leading to a translation stop in first hours following infection with HIV-1. The study of the interaction domain between IN and GCN2 allowed the characterization of a critical residue of IN, the E85. -The impact of RAD51 repair factor on viral replication was investigated. We have shown an inhibitory effect of this protein. This work allowed the identification of a chemical molecule RS-1 able to inhibit integration in infected cells through RAD51 stimulation.