Les cellules BHK transformées par l'oncogène v-Src forment des invadopodia qui s'organisent successivement sous forme de paquets, anneaux et enfin ceintures d'invadopodia. L'expansion des anneaux d'invadopodia est due à la néoformation d'invadopodia à la périphérie de l'anneau et au désassemblage simultané des invadopodia situés au centre de l'anneau. L'orthovanadate, inhibiteur de tyrosine phosphatases, génère des expansions très rapides indiquant l'implication de phosphorylations sur tyrosine dans la formation des invadopodia à la périphérie et leur désassemblage au centre. La paxilline, une protéine hautement phosphorylée, responsable du désassemblage des adhérences focales, est également présente dans les invadopodia et induit le désassemblage des invadopodia au centre de l'anneau (processus indispensable à la formation et à l'expansion des anneaux), grace a un processus de phosphorylation de la paxilline sur les tyrosines 31 et 118, qui en retour active la MAP kinase Erk et la calpaine, responsable du clivage protéique des composants des invadopodia.

Rationnel : L’artérite à cellules géantes (ACG) est une vascularite primitive des gros vaisseaux dont le diagnostic repose sur la mise en évidence d’un infiltrat inflammatoire et de cellules géantes à la biopsie d’artère temporale (BAT). On note également un remodelage de la paroi vasculaire lié à une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvant aboutir à une occlusion artérielle. Objectif : Caractériser les auto-anticorps dirigés contre les cellules endothéliales (CE) et les CMLV au cours de l’ACG et préciser le rôle des CMLV dans le remodelage pariétal. Méthodes : La recherche d’auto-anticorps a reposé sur un immunoblot 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les protéomes des CMLV d’artère ombilicale, d’artère pulmonaire et d’aorte humaines normales a été comparés par protéomique différentielle (2D-DIGE). Nous avons utilisé la 2D-DIGE et des puces d’expression pan-génomiques pour comparer les CMLV issues de BAT de patients suspects d’ACG (avec un diagnostic final d’ACG ou non), afin d’identifier les mécanismes contribuant à la prolifération des CMLV. Résultats : Chez 15 patients atteints d’ACG, nous avons notamment identifié la lamine, la vinculine et l’annexine A5 comme cible des auto-anticorps anti-CMLV. Les antigènes cibles identifiés sont liés à Grb2, une protéine adaptatrice impliquée dans la prolifération des CMLV. Nous avons mis en évidence des protéomes différents au sein des CMLV humaines normales selon leur origine vasculaire et avons principalement identifié des protéines du cytosquelette et du métabolisme énergétique.A partir des CMLV isolées des BAT et à l’aide d’Ingenuity®, nous avons identifié l’endothéline 1 (ET-1) et la paxilline comme des molécules impliquées dans le remodelage vasculaire. En immunohistochimie et par qPCR, nous avons confirmé l’expression de l’ET-1 et de ses récepteurs ETAR et ETBR au sein des artères temporales de patients atteints d’ACG. Enfin, nous avons inhibé la prolifération des CMLV avec du macitentan, un inhibiteur d’ETAR et en particulier avec son métabolite actif, mais pas avec d’autres inhibiteurs des récepteurs de l’ET-1. Conclusion : Nous avons identifié chez les patients atteints d’ACG des anticorps anti-CMLV dont le rôle pathogéne potentiel reste à définir. Les différences protéiques observées à partir des CMLV humaines normales pourraient correspondre à des phénotypes différents. A partir d’un matériel biologique unique, nous avons pu montrer que la prolifération excessive des CMLV au cours de l’ACG pouvait être inhibée par le macitentan ce qui permet d’envisager un usage thérapeutique de cette molécule. / Background : Giant cell arteritis (GCA) is a large vessel vasculitis and its diagnosis usually relies on the identification of an inflammatory infiltrate made of mononuclear cells and giant cells upon temporal artery biopsy. There is also a remodeling process in the arterial wall due to an excessive proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) which can sometimes lead to arterial occlusion. Purpose: Identify auto-antibodies targeting either endothelial cells (EC) and/or VSMC during GCA and better understand the role of VSMC in the remodeling process. Methods : Auto-antibodies were detected by a 2-dimensionnal immunoblot and their target antigens were identified by mass spectrometry. Proteoms of umbilical artery, pulmonary artery and aorta VSMC were compared by 2 dimension differential in gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to identify mechanisms involved in VSMC proliferation in GCA, we used both 2D-DIGE and pan genomic chips in order to compare VSMC isolated at the time of temporal artery biopsy (TAB) from patients with a final diagnosis of GCA or another diagnosis. Results : In 15 patients with GCA, we identified lamin, vinculin and Annexin A5 as target antigens of anti-VSMC antibodies. Target antigens were linked with Grb2, an adaptator protein involved in VSMC proliferation. Normal VSMC originating from different vascular beds have differ in protein contents with differential expression of cytoskeleton and energy metabolism proteins. We compared VSMC from TAB with Ingenuity software and identified endothelin-1 (ET-1) and paxillin as proteins involved in vessel remodeling. We confirmed by immunohistichemistry and qPCR that ET-1 and its receptor ETAR and ETBR were expressed in temporal arteries from patients with GCA. Last, we reduced VSMC proliferation with Macitentan, an ETAR and ETBR antagonist and significantly inhibited VSMC proliferation with its active metabolite whereas other ET-1 inhibitors had no effect. Conclusion : We identified anti-VSMC auto-antibodies in patients with GCA. Their pathogenic role remains to be determined. Normal VSMC from different vascular locations differ in protein conten which might reflect different phenotypes and different properties. The escessive proliferation of VSMC from patients with GCA was inhibited by Macitentan. This drug might constitute a future therapeutic option.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont considérés comme des maladies clonales des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Le microenvironnement joue un rôle important par ses contacts direct avec les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH). Notre objectif était d'évaluer les défauts de croissance des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) dans les MDS, d’explorer les molécules d’adhérence impliquées, et d'effectuer des corrélations avec leurs dysfonctionnements de croissance et les anomalies des CPH. Les CSM de MDS sont intrinsèquement pathologiques, montrant une baisse continue de la prolifération pendant 14 jours de culture et une capacité clonogénique réduite. Ces anomalies sont corrélés à une diminution des molécules d'adhérence CD44 et CD49e. Par ailleurs, le potentiel clonogénique des CPH est contrôlé par des mécanismes d'adhérence dépendant du stroma, CD49e pouvant être une des molécules impliquées. L’analyse en immunofluorescence des protéines d'adhérence focale (FA), paxilline et pFAK [Y397], et des deux protéines régulatrices, HSP90αβ et p130CAS permet l'identification d’anomalies qualitatives et quantitatives. Une expression accrue de paxilline, pFAK et HSP90αβ et leur forte co-localisation nucléaire dans les CSM d'anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) sont corrélées avec un avantage prolifératif et un impact négatif sur la capacité clonogénique de CPH. Ces résultats ouvrent des possibilités intéressantes : la signalisation via les protéines FA pourrait être impliquée dans les interactions HPC-MSC ; par ailleurs, FAK étant une protéine cliente d’HSP90, les inhibiteurs d’HSP90 sont une potentielle thérapie adjuvante dans les myélodysplasies / Myelodysplastic syndromes (MDS) are regarded as clonal disorders of haematopoietic stem cells (HSC). Recent evidence demonstrates that stromal microenvironment, in addition to HSC defects, plays a particular role via its direct contact with haematopoietic precursor cells (HPC). This thesis aims at evaluating the putative growth deficiencies of mesenchymal stromal cells (MSC) from MDS individuals compared with normal controls, exploring their adhesion profile, assessing the adhesion process-involved molecular substrates, and establishing correlations with their growth patterns and HPC dysfunctions. Functional assays revealed that MSC from MDS are intrinsically pathological, show a continuous decline of proliferation over a 14-day culture and a reduced clonogenic capacity in the absence of signals from HPC. MSC growth defects significantly correlate with decreased CD44 and CD49e expression. Moreover, stroma-dependent adhesion mechanisms control HPC clonogenic potential and CD49e might be one of the molecules involved in this process. Qualitative and quantitative abnormalities of focal adhesion (FA) proteins paxillin and pFAK [Y397] and of two regulatory proteins, HSP90αβ and p130CAS were identified via immunofluorescence analysis. Paxillin, pFAK [Y397] and HSP90αβ increased expression, besides its stronger nuclear colocalization in MSC from RAEB correlates with a consistent proliferative advantage and has a negative impact on HPC clonogenic capacity. These results open interesting opportunities, e.g. HPC-to-MSC interactions involve FA proteins signalling, and, as FAK is an HSP90αβ-client protein, it may enhance the utility of HSP90αβ inhibitors as adjuvant therapy in MDS