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Caracterização de culturas de células de hiperplasia macronodular adrenal primária (PMAH) como modelo biológico para estudo funcional do gene ARMC5. / Characterization of primary adrenal macronodular hyperplasia (PMAH) cell cultures as a biological model for the functional study of the ARMC5 gene

Cavalcante, Isadora Pontes 17 December 2018 (has links)
A PMAH é uma causa rara de síndrome de Cushing, cuja real prevalência parece subestimada. O processo fisiopatológico que culminaria com a PMAH ainda não foi totalmente elucidado. A produção de cortisol mediada por receptores acoplados a proteína G (ectópicos/tópicos da adrenal) geralmente hiperexpressos, bem como a regulação autócrina/parácrina do ACTH ectópico em clusters celulares dos macronódulos adrenais têm sido considerados como parte importante do processo fisiopatológico da PMAH. Além destes mecanismos, recentemente, foi demonstrado a associação de variantes patogênicas germinativas/somáticas no gene ARMC5 como uma causa frequente da PMAH. Os estudos funcionais que caracterizaram o ARMC5 como gene supressor de tumor e potencialmente envolvido na hiperplasia adrenal nodular e sua produção de cortisol foram realizados em células H295R, derivadas de carcinoma adrenocortical. Células estas que não representam em tese um modelo ideal para o estudo de uma doença absolutamente benigna. Objetivos: Obtenção e caracterização morfofuncional de culturas de células obtidas de nódulos adrenais de pacientes submetidos à adrenalectomia com diagnóstico histopatológico compatível com PMAH, como um modelo biológico para a análise funcional do gene ARMC5. Métodos: Foram utilizadas 13 culturas de células de PMAH caracterizadas do ponto de vista morfofuncional e molecular para as análises funcionais do gene ARMC5. Resultados: As culturas de PMAH apresentaram mutações germinativas no ARMC5 identificadas em 8 das 13 culturas analisadas, associadas ou não a segundos eventos moleculares. As culturas de células de PMAH apresentaram receptores eutópicos e ectópicos de uma maneira heterogênea e a presença de ACTH ectópico em clusters de células. O silenciamento do ARMC5 nas células de PMAH levou à diminuição da esteroidogênese, ao aumento de CCNE1 e ao número de células viáveis após 96h. Quando hiperexpresso, o gene ARMC5 induziu apoptose e necrose celular após 12h, diminuindo a viabilidade das células de células de PMAH. Conclusões: Legitimamos a importância do papel do ARMC5 na esteroidogênese relacionada à PMAH, bem como sua função favorecendo a apoptose celular; além disso, pela primeira vez, detectamos o envolvimento do ARMC5 na regulação do ciclo celular e proliferação, cuja importância será explorada em estudos futuros. / Background: PMAH is a rare cause of Cushings syndrome, with an apparent underestimated prevalence. The pathophysiology of PMAH is not yet fully understood, however the participation of aberrant receptors and intra-adrenal ACTH in the hyperplastic tissue are considered mechanisms that regulate hypercortisolism in PMAH. Additionally, germline ARMC5 mutations have been described as the most frequent genetic abnormality found in patients diagnosed with PMAH. Previous functional studies analyzed ARMC5 role using H295R cells, a cell line of adrenocortical carcinoma. Objectives: In this study we investigated the role of ARMC5 in cell cultures obtained from PMAH nodules. Results: We observed the presence of mutations in ARMC5 gene in 8 out of 13 PMAH cell cultures analyzed. We observed the presence of aberrant receptors and intra-adrenal ectopic ACTH, regardless the presence of mutations. ARMC5 silencing in non-mutated PMAH cell cultures decreased steroidogenesis-related genes and increased CCNE1 mRNA expression and the number of viable cells without affecting cell viability. Additionally, ARMC5 overexpression induced cell death in PMAH mutated cell cultures, thereby decreasing cell viability. Conclusions: We confirmed the role of ARMC5 as an important pro-apoptotic protein involved in PMAH-related steroidogenesis. We also report for the first time the possible involvement of ARMC5 in controlling proliferation and regulating cell cycle in PMAH cell cultures, which need to be further explored.
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Análise de variantes alélicas no gene Armadillo Repeat Containing 5 (ARMC5) em pacientes com incidentaloma da suprarrenal / Analysis of the allelic variants of the armadillo repeat containing 5 (ARMC5) gene in patients with adrenal incidentalomas

Mariani, Beatriz Marinho de Paula 05 July 2019 (has links)
Análise de variantes alélicas no gene Armadillo Repeat Containing 5 (ARMC5) em pacientes com incidentaloma da suprarrenal identificamos 16 pacientes carreadores da mutação, a partir de dois irmãos inicialmente investigados. Aproximadamente 30% dos membros afetados desta genealogia, apresentavam somente uma suprarrenal acometida e a suprarrenal contra-lateral absolutamente normal ou discretamente espessada. Esta observação nos infere que a hiperplasia macronodular da PMAH pode ocorrer de forma assincrônica e dificultar aprincipio o seu diagnostico. A incidência de nódulos unilaterais identificados em exame de imagens na pratica clinica é muito elevada (1,4 - 2,9%, podendo chegar a 10% em pacientes com idade a cima de 70 anos) os denominados incidentalomas suprarrenais. Além disso, a grande maioria dos pacientes com nódulos suprarrenais apresentam alguma autonomia da secreção do cortisol. Considerando estes aspectos, nos propomos a investigar se os incidentalomas suprarrenais unilaterais com alguma autonomia da secreção do cortisol poderiam fazer parte do espectro de apresentação da PMAH. Nosso trabalho tem como foco analisar a frequência das variantes alélicas do ARMC5 em uma coorte multicêntrica de pacientes com nódulos suprarrenais incidentais e autonomia da secreção do cortisol. O esclarecimento da frequência da PMAH pode nos direcionar a uma melhor pratica clinica e cuidados com os pacientes / Primary macronodular adrenal hyperplasia (PMAH) was described in 1964 by Kirschner et al, and is considered a rare cause of endogenous ACTH-independent Cushing\'s syndrome (CS), usually associated with bilateral adrenal nodules. The clinical presentation of the patients is heterogeneous, ranging from subclinical to overt Cushing\'s syndrome, with all its characteristics. The cortisol secretion pattern, after the 1 mg dexamethasone overnight suppression test, identifies the intensity of cortisol secretion autonomy, ie, serum cortisol concentrations above 1.8 ug / dL and up to 5 ug / dL , characterize a possible autonomous cortisol secretion and above this value (5 ug / dL) an autonomous cortisol secretion. Patients are generally diagnosed with PMAH when undergoing ACTH-independent endogenous hypercortisolism investigation or, more frequently, during the investigation of bilateral adrenal incidentalomas and less likely in patients with metabolic syndrome associated with meningiomas of the central nervous system, since these are very prevalence in patients with PMAH. Bilateral adrenal involvement, along with the description in the literature of several PMAH-affected family relatives, has already indicated a genetic cause involved in the pathophysiology of this intriguing disease. In 2013, two studies, one Brazilian and one Franch, using distinct methodologies, identified germline mutations in ARMC5 as the major genetic cause of PMAH. The largest genealogy published so far was that of a Brazilian family, with 5 generations in which we identified 16 patients, carriers of the mutation, from two siblings initially investigated. Approximately 30% of the affected members of this genealogy had only one adrenal afected with the contralateral gland absolutely normal or discretely thickened. This observation infers us that the macronodular hyperplasia of PMAH can occur in an asynchronous way and make it difficult to diagnose it. The incidence of unilateral nodules identified in clinical imaging is very high (1.4-2.9%, and may reach 10% in patients over the age of 70), the so-called adrenal incidentalomas. In addition, the vast majority of patients with adrenal nodules have some autonomy in cortisol secretion. Considering these aspects, we propose to investigate whether unilateral adrenal incidentalomas, with some autonomy of cortisol secretion, could be part of the presentation spectrum of PMAH. Our work focuses on the frequency of allelic variants of ARMC5 in a multicentric cohort of patients with incidental adrenal nodules and autonomy of cortisol secretion. Clarifying the frequency of PMAH may lead to better clinical practice and patient care

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