Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2017-11-27T16:45:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE JOSÉ ERITON GOMES DA CUNHA.pdf: 4938507 bytes, checksum: 52c4bcd6499bc3e95e89199f5fbad7a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-27T16:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE JOSÉ ERITON GOMES DA CUNHA.pdf: 4938507 bytes, checksum: 52c4bcd6499bc3e95e89199f5fbad7a0 (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / FACEPE / As Doencas Prionicas, tambem conhecidas como Encefalopatias Espongiformes Transmissiveis (EET), fazem parte de um grupo de doencas raras e invariavelmente fatais e incidem em diversos animais, incluindo o homem, e sao ocasionadas pelo acumulo de uma proteina insoluvel denominada PríonScrapie (PrPsc). Fazem parte deste grupo a Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB), CronicWastingDisease (CWD) nos cervideos, Scrapie em ovinos e nos humanos Doenca de Creutzfeldt-Jakob(DCJ), Kuru, Gerstmann-Straussler-ScheinkerDisease (GSS) e Insonia Familiar Fatal. Uma forte caracteristica das EET e a altaheterogeneidade clinica e histopatologica, tendo como o codon 129 da proteina príon o maior fator para esta variabilidade. Por conta desta variabilidade e a falta de biomarcadores determinantes para as Doencas Prionicas, o estudo clinico dos casos se torna crucial para o diagnostico diferencial. Nesta tese, criamos um banco de dados online, o epiCJD, para centralizar informacoes epidemiologicas a fim de orientar medicos e servir como apoio aos gestores de saude. Utilizamos os registros dos casos ate entao coletados pelo Centro de Doencas Prionicas da Alemanha. Alem disso, foram analisados Aβ42 e a proteina Tau atraves de eletroquimioluminiescencia (MSD) como possiveis biomarcadores para diagnostico diferencial. Apos a analise dos dados, observamos que a distribuicao geografica dos registros nao indicam clusters ou hotspots, obedecendo basicamente o tamanho populacional. A distribuicao de acordo com o genero nao difere de outras populacoes descritas na literatura e os primeiros sintomas sao compativeis com os descritos previamente, bem como a idade media do inicio da doenca. A distribuicao genotipica do codon 129 esta de acordo com a literatura. Quanto ao MSD, observamos que a quantificacao foi ligeiramente superior nos niveis de TAU e significativamente superior Aβ42 em relacao aos controles, DA e DCJ. Baixos niveis de Aβ42 e alto nivel de TAU se mostraram caracteristicas em DA e DCJ, comparado aos controles. Como perspectivas futuras, o banco de dados sera alimentado por outros dados, alem dos provenientes da Alemanha, a fim de observar se ha ou nao variacoes entre outras populacoes. A tecnica MSD se mostrou promissora podendo, depois de melhoramentos, ser uma ferramenta de diagnostico molecular. / Prion diseases, or Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), are part of a group of rare diseases and invariably fatal and focus on various animals, including humans, and are caused by the accumulation of insoluble protein called Prion Scrapie (PrPsc). Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE), CronicWastingDisease (CWD) in deer, scrapie in sheep and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Kuru, Gerstmann-Straussler-ScheinkerDisease (GSS) and Fatal Familial Insomnia, in humans, are example of TSEs. A strong feature of the TSE is the high heterogeneity clinical and histopathological, with the codon 129 of the prion protein the biggest factor for this variability. Because of this variability and lack of biomarkers to determine the prion diseases, the clinical study of cases becomes crucial for the differential diagnosis. In this thesis, we have created an online database, epiCJD, to centralize epidemiological information in order to guide physicians and serve as support for public health managers. We use records from German Prion Disease Center. Furthermore, Ab42 were analyzed and Tau protein by electrochemiluminescence-based detection system (MSD) as biomarkers for the differential diagnosis. The distribution according to gender does not differ from other populations described in the literature and the first symptoms are consistent with those described previously, as well as the average age of onset of the disease. The genotype distribution of the 129 codon is in agreement with the literature. As for the MSD,we noted that the quantification was slightly higher levels of TAU and Ab42 significantly higher compared to controls, AD and CJD. Low levels of Ab42 and high TAU proved characteristics in AD and CJD, compared to controls. As future prospects, the database will be fed by other data, in addition to from Germany, in order to observe whether there are variations among other populations. MSD technique proved promising and may, afterimprovements, to be a molecular diagnostic tool.

Submitted by Nayara Passos (nayara.passos@ufpe.br) on 2015-03-04T12:17:40Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Caio Falcão.pdf: 2133861 bytes, checksum: 5da89e55512d8d24eb3ab088f5e47c12 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T12:17:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Caio Falcão.pdf: 2133861 bytes, checksum: 5da89e55512d8d24eb3ab088f5e47c12 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE , CNPQ. / As doenças priônicas são um grupo de doenças neurodegenerativas e irremediavelmente fatais que afetam humanos e algumas outras espécies de mamíferos. Entre estas, as mais conhecidas são a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) que acomete humanos, o scrapie em ovinos e a encefalopatia espongiforme bovina (BSE). A Chronic Wasting Disease (CWD) é a forma priônica que acomete os cervídeos e tem sido considerada como problema de saúde pública nos EUA e Canadá. Pesquisas recentes têm mostrado que alguns animais apresentam maior resistência à infecção da doença. Esta resistência tem sido comumente associada com alterações na sequência de nucleotídeos do gene que codifica a proteína priônica (PRNP). Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em códons específicos alteram a susceptibilidade ao desenvolvimento da CWD na família Cervidae. Objetivando identificar a presença/ausência dos polimorfismos, e consequentemente a potencial susceptibilidade ao desenvolvimento da doença em cervídeos neotropicais, no presente trabalho foram analisadas 60 amostras de três espécies: Veado catingueiro (Mazama gouazoubira, n:11), Veado campeiro (Ozotoceros bezoarticus, n:18) e Cervo do Pantanal (Blastocerus dichotomus, n:31). Um fragmento de aproximadamente 800pb do exon 3 do gene PRNP foi amplificado por PCR e posteriormente sequenciado. As sequências foram alinhadas e os resultados mostraram que a sequência nucleotídica dos animais neotropicais é altamente conservada. Todos os animais apresentaram os polimorfismos associados à susceptibilidade nos códons de interesse (Q95, G96, M132 e S225). Apesar disto, a CWD nunca foi notificada em espécies neotropicais.

Submitted by Israel Vieira Neto (israel.vieiraneto@ufpe.br) on 2015-03-05T18:18:45Z No. of bitstreams: 2 Jose_Eriton_Gomes_da_Cunha.pdf: 1528213 bytes, checksum: 7808fa0521f72c6aa79a728ea24ae0b4 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T18:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Jose_Eriton_Gomes_da_Cunha.pdf: 1528213 bytes, checksum: 7808fa0521f72c6aa79a728ea24ae0b4 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES, CNPq / A Doença de Alzheimer (DA) e a Doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) apresentam caráter neurodegenerativo, ocasionadas pelo acúmulo extracelular de proteínas insolúveis. Dentre alguns fatores de risco, as mutações nos códons M129V e E200K do gene PRNP são os mais importantes na DCJ. Alguns estudos foram realizados com o códon 129, sendo bastante controversos. Este trabalho teve como objetivo verificar a influência dos códons 129 e 200 e a presença da mutação E200K na DA. 145 amostras de DNA de pacientes com DA e 198 controles foram genotipadas para os códons 129 e 200 através da técnica da PCR e digestão enzimática com as enzimas NspI para o códon M129V e BsmAI, para o códon 200. Onze pacientes e oito controles foram sequenciados com o MegaBace1000. Quarenta e dois pacientes e quarenta e dois controles foram genotipados para o códon 129 sendo 16 MM, 20 MV e 6 VV nos pacientes e 24 MM, 15 MV e 3 VV nos controles. Não foram encontradas diferenças estatísticas significativas. Para a mutação E200K, 61 pacientes e 75 controles foram genotipados, não ocorrendo mutação em nenhuma amostra. Nossos dados corroboram com outros grupos mostrando que o códon 129 parece não estar associado a DA. A baixa frequência da mutação E200K pode justificar a ausência desta na nossa amostragem, o que precisa ser confirmado com maior número de amostras, com devida atenção pela possível estratificação associada a grupos étnicos e outros fatores como cosegregação de outros genes associados ao PRNP. Este trabalho contribuiu para um melhor conhecimento do perfil neuroepidemiológico da população local.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-08-10T15:32:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_EnriquecimentoAmbientalReduz.pdf: 4278120 bytes, checksum: 2b30b38fb3239c124174a04c617d742f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-08-13T15:05:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_EnriquecimentoAmbientalReduz.pdf: 4278120 bytes, checksum: 2b30b38fb3239c124174a04c617d742f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-13T15:05:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_EnriquecimentoAmbientalReduz.pdf: 4278120 bytes, checksum: 2b30b38fb3239c124174a04c617d742f (MD5) Previous issue date: 2014 / Já está bem estabelecido que um estilo de vida sedentário é fator de risco para uma série de doenças crônicas, dentre elas a doença de Alzheimer. A neuropatologia da doença de Alzheimer é caracterizada por depósitos amilóides, perda neuronal, gliose reativa e vacuolização da neurópila. A doença príon tem sido amplamente utilizada como modelo experimental para estudar aspectos celulares e moleculares da neurodegeneração crônica em muito semelhante àquela descrita na doença de Alzheimer. O ambiente empobrecido das gaiolas padrão de laboratório tem sido usado para mimetizar um estilo de vida sedentário enquanto que o ambiente enriquecido tem sido empregado para mimetizar um estilo de vida ativo. Para testar a hipótese de que o ambiente enriquecido pode contribuir para desacelerar o curso temporal da neurodegeneração crônica associada à doença príon em modelo murino induzimos a doença príon em vinte camundongos fêmeas da variedade suíça albina que tinham sido alojadas aos seis meses de idade em ambiente enriquecido (EE) ou em ambiente padrão (SE) durante cinco meses. Após esse peródo foram realizadas cirurgias para injeção estereotáxica intracerebral bilateral de homogendao de cérebro de camundongo normal (NBH, n=10) ou de camundongo com sinais clínicos de doença príon terminal (ME7, n=10). Os animais foram devolvidos as suas gaiolas e condições de alojamento originais formando os seguintes grupos experimentais: NBH SE=5, NBH EE=5, ME7 SE=5, ME7 EE=5. Após três semanas foi iniciado teste semanal empregando o burrowing, uma tarefa sensível ao dano hipocampal e 18 semanas após as inoculações realizou-se os testes de memória de reconhecimento de objetos. Encerrados os testes sacrificou-se os animais realizando-se o processamento histológico do tecido nervoso visando a imunomarcação astrocítica das áreas de interesse. A redução progressiva da atividade de burrowing teve início na décima terceira semana pós injeção no grupo ME7 SE e somente na décima quinta semana no grupo ME7 EE. A habilidade de reconhecer o objeto deslocado no teste de memória espacial foi comprometida no grupo ME7 SE, mas se manteve normal nos demais grupos experimentais. O teste de discriminação entre o objeto novo e o familiar não revelou alterações. As análises quantitativas sem viés dos astrócitos imunomarcados para proteína fibrilar ácida (GFAP) foram realizadas no stratum radiatum de CA3 e na camada polimórfica do giro denteado dorsal. As estimativas estereológicas do número total de astrócitos e do volume do corpo celular revelaram que em CA3 somente ocorre hipertrofia dos corpos celulares em animais dos grupos ME7 SE e ME7 EE em relação aos respectivos controles, sendo o volume médio dos corpos celulares do grupo ME7 EE menor que aquele do grupo ME7 SE. Na camada polimórfica houve significativo aumento do número de astrócitos no grupo ME7 SE em relação ao NBH SE e do grupo NBH EE em relação ao NBH SE. O volume do corpo celular também foi significativamente maior nos grupos ME7 em relação aos respectivos controles dos grupos NBH. As análises morfométricas tridimensionais revelaram importante aumento de volume e área de superfície dos segmentos das árvores astrocíticas nos grupos doentes em comparação aos controles. O enriquecimento ambiental reduziu o aumento de volume dos ramos observado no grupo ME7 e aumentou o número de intersecções dos ramos distais no grupo NBH EE em relação ao NBH SE e nos ramos proximais no grupo ME7 EE em relação ao ME7 SE. O emprego da análise de cluster e discriminante permitiu a identificação dos parâmetros morfométricos que mais contribuíram para a distinção entre os grupos. Para testar a hipótese de existirem subfamílias de astrócitos morfologicamente distintos dentro de cada grupo experimental, foi realizada análise de conglomerados que resultou na formação de duas famílias distintas no grupo NBH SE, três famílias nos grupos NBH EE e ME7 EE e quatro famílias no grupo ME7 SE. As bases celulares e moleculares que conduzem a formação de novas famílias de astrócitos e a neuroproteção associada ao ambiente enriquecido que diminui a velocidade de progressão da doença permanecem por serem investigadas. / It is well established that a sedentary lifestyle is a risk factor for a number of chronic diseases, including Alzheimer's disease. The neuropathology of Alzheimer's disease is characterized by amyloid deposits, neuronal loss, reactive gliosis, and vacuolization of the neuropil. Prion disease has been widely used as an experimental model for studying cellular and molecular aspects of chronic neurodegeneration much similar to that described in Alzheimer's disease. The impoverished environment of standard laboratory cages have been used to mimic a sedentary life whereas enriched environment has been used to mimic an active lifestyle. To test the hypothesis that an enriched environment can help to slow down the time course of chronic neurodegeneration associated with prion disease we induced prion disease in twenty Swiss albino female mice which had been housed at six months of age in an enriched environment (EE) or in a standard (SE) environment for five months. After this period bilateral stereotactic intracerebral injection of normal (NBH, n = 10) or infected brain homogenate (ME7, n = 10) were done. Infected brain homogenate was obtained from mice with clinical signs of terminal prion disease. The injected animals returned to their cages and housing conditions and grouped as follow: SE = NBH 5, EE = NBH 5, ME7 SE = 5, ME7 EE = 5. After three weeks post-injections the burrowing test was initiated. Burrowing is a sensitive task to hippocampal damage. 18 weeks after inoculation memory tests of object recognition was carried out. After behavioral tests animals were euthanized and their brains were histologically processed targeting astrocytic immunostaining of areas of interest. The progressive reduction of the activity of burrowing began in the thirteenth week after injection in group ME7 SE but only in the fifteenth week in ME7 EE group. The ability to recognize the displaced object in spatial memory test was impaired in ME7 SE group but remained normal in the other experimental groups. The test of discrimination between the new object and the family revealed no abnormalities. Quantitative analysis of GFAP immunostained cells were performed in the dorsal stratum radiatum of CA3 and in the polymorphic layer of the dorsal dentate gyrus. The stereological estimates of the total number of astrocytes and the volume of the cell body revealed that the number of astrocytes did not change but a significant hypertrophy occurs in CA3 cell bodies of ME7 SE and ME7 EE groups as compared to their respective controls. The average volume of the cell bodies of the ME7 EE group was smaller than that of the group ME7 SE. However similar analysis applied to the polymorphic layer revealed a significant increase in the number of astrocytes in the ME7 SE group in relation to NBH SE group and in ME7 EE compared to NBH EE. The volume of the cell body was also significantly higher in ME7 groups compared to their respective control groups. The three-dimensional morphometric analysis revealed significant increase in volume and surface area of the segments of astrocytic trees in diseased groups compared to controls. Environmental enrichment reduced swelling observed in the branches of ME7 group and increased the number of intersections of the distal branches in NBH EE group relative to NBH SE and the proximal branches in the group ME7 EE compared with ME7 SE. The use of cluster analysis and discriminant allowed the identification of morphometric parameters that contributed most to the distinction between the groups. To test the hypothesis that there are subfamilies of morphologically distinct astrocytes within each experimental group, we applied cluster and discriminant analysis to each experimental group and these analysis resulted in the formation of two distinct families in NBH SE group, three families in NBH EE and ME7 EE groups and four families in the ME7 SE group. The molecular and cellular changes, which lead to the formation of new families of astrocytes, and to the neuroprotection associated with an enriched environment slowing down the progression of the prion disease, remain to be investigated.

Orientador: Prof. Dr. Luis Paulo Barbour Scott / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Mecanismos biologicos envolvidos nas fibras amiloides e sua agregacao ainda sao um dos topicos mais investigados cientificamente. As prions estao entre estas proteinas que agregam-se sob certas condicoes. Estas proteinas adotam duas diferentes formas: i) a forma celular (PrPC) e ii) a forma infecciosa denominada scrapie (PrPSc) que possui propensao a agregacao. Na forma infecciosa, essa proteina pode causar diversas doencas tais como a encefalopatia espongi-forme bovina, doenca de Creutzfeldt-Jakob e doenca de Gerstmann-Straussler-Scheinker. As PrPC e PrPSc sao diferentes com relacao as estruturas secundarias e terciarias. A PrPC contem um numero menor de folha-¿À quando comparada a PrPSc. Nenhuma estrutura da PrPSc foi resolvida ate o presente momento e, alem disso, o mecanismo molecular da transicao entre a PrPC e PrPSc e o processo de agregacao da forma scrapie nao sao bem compreendidos apesar dos numerosos estudos realizados nesta area. Neste trabalho, foi aplicada uma nova metodologia de simulacao recentemente desenvolvida que permite promover grandes mudancas estruturais, nomeada como MDeNM (Molecular Dynamics with excited Normal Modes), com o objetivo de investigar e compreender a transicao conformacional entre a PrPC e PrPSc. Este metodo combina modos normais e dinamica molecular, a partir de movimentos coletivos ativados cineticamente que devem contribuir para um novo rearranjo estrutural dificilmente alcancado por simulacoes de dinamica molecular tradicional. Alem disso, estudos termodinamicos foram realizados com o modelo baseado em estrutura (SBM), que caracteriza as transicoes energeticas. Os resultados do SBM mostraram que as estruturas geradas por MDeNM podem corresponder a via de transicao entre a conformacao nao-infecciosa e a desnovelada. A combinacao de MDeNM e SBM mostrou-se util para extrair informacoes estruturais e energeticas relacionadas a conversao da prion para as formas infecciosas. Os resultados mostraram um aumento significativo na formacao da folha-¿À sob condicoes de baixo pH e considerando a PrP na forma trimerica e tambem em agregados. Estas simulacoes permitiram a caracterizacao de estados intermediarios na transicao da PrPC para a PrPSc, e a proposicao um mecanismo de conversao da PrPC para PrPSc. Estudos iniciais relacionados aos mutantes da prion e o modelo Coarse-Grained tambem foram realizados neste trabalho. / Biological mechanisms involved in the amyloid fibrils and aggregation belong yet to very hot topics of scientific investigation. Prions are among proteins that aggregate under certain conditions. They adopt two different forms: i) the cellular form (PrPC) and ii) infectious form called scrapie (PrPSc) having the propensity to aggregate. In the infectious form, the prion may cause many diseases such as bovine spongiform encephalopathy (commonly known as mad cow disease), Creutzfeldt-Jakob disease and Gerstmann-Straussler-Scheinker disease. The PrPSc and PrPC are widely different regarding secondary and tertiary structures. PrPC contains a much smaller number of ¿À-strands compared to PrPSc. No structures of PrPSc have been solved until nowadays, and furthermore the molecular mechanism of the transition between PrPC and PrPSc, and the aggregation process of the scrapie form are not well understood besides numerous studies achieved in this field. In this work, we applied a recently developed simulation method allowing to promote large structural changes, namely the MDeNM (Molecular Dynamics with excited Normal Modes) in order to better investigate and understand the conformational transition between PrPC and PrPSc. This method makes a combined use of normal modes and molecular dynamics, consisting to kinetically activate collective motions that might contribute to new structural rearrangements difficult to achieve by simple standard MD simulations. Furthermore, a thermodynamical study was achieved with the well know ¿¿-carbon structure-based model (SBM), which characterizes the energetic transitions. SBM results showed that the PrPSc structures that were generated with MDeNM must correspond to the transition pathways between the non-infectious native PrPC and the fully unfolded conformations. The combination of MDeNM and SBM was useful to extract structural to energetical information related to the prion conversion to the frustrated infections forms. The results showed a significant increase in ¿À-sheet formation under low pH condition and when PrPC was in trimeric form, and also when larger assemblies. These simulations allowed us to characterize intermediate states in the transition from the cellular prion to PrPSc, and a model of conversion from PrPC to PrPSc. Also, studies with mutants of prion and Coarse-Grained were performed in this work.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo. Apesar dos avanços nos tratamentos convencionais, aproximadamente dois terços dos pacientes com CCR são submetidos à cirurgia potencialmente curativa. Entretanto, grande parte desses pacientes evolui mal, apresentando recidivas e/ou metástases. A busca de novos alvos moleculares para a terapia do CCR revelou a proteína celular Prion (PrPC) como um possível candidato. Trabalhos recentes sugerem participação direta ou indireta de PrPC no crescimento de tumores, na formação de metástases, na composição de complexos multiproteicos e na indução de vias de sinalização envolvidas em diversos processos biológicos, como proliferação. Além disso, PrPC foi descrito como um importante modulador do crescimento de tumor colorretal. Resultados prévios mostraram que a interação da proteína PrPC com a proteína HSP70/HSP90 Organizing Protein (HOP) induz proliferação em glioblastomas. HOP é uma proteína predominantemente citoplasmática, podendo também ser secretada associada às vesículas extracelulares. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o papel do complexo PrPC-HOP e das vesículas extracelulares no desenvolvimento e progressão dos tumores colorretais. Os nossos resultados mostram que HOP induziu migração e invasão em linhagens de CCR de maneira dependente de PrPC, uma vez que o uso do peptídeo sem atividade que compete pelo sítio ligação de HOP a PrPC inibiu estes processos. Além disso, nossos dados apontaram que o aumento de migração e invasão das células de CCR induzida pela interação PrPC-HOP é mediada pela ativação da via ERK1/2. Os achados in vitro estimularam a avaliação do perfil de expressão de PrPC e HOP por imuno-histoquímica em tecidos de pacientes com diferentes tipos de tumores colorretais. Nossos resultados sugeriram que essas proteínas são importantes no início do desenvolvimento tumoral e na transição de adenomas para adenocarcinomas, não havendo correlação entre a presença de HOP e/ou PrPC com metástase, linfonodos acometidos, estadiamento, sobrevida ou região tumoral versus tecido normal. Em relação ao papel das vesículas extracelulares na progressão dos tumores colorretais, nossos resultados mostraram que linhagens celulares que apresentam padrões parecidos de agressividade tumoral podem ter perfis de secreção de proteínas e vesículas extracelulares bastante diferentes, induzindo, portanto, processos biológicos com intensidades distintas. O meio condicionado e as vesículas extracelulares da linhagem WiDr apresentaram maior potencial de indução de migração quando comparado com a linhagem HCT8. Além disso, a modulação negativa da proteína VPS4, uma das responsáveis pela formação dos corpos multivesiculares, mostrou-se uma abordagem interessante no estudo da secreção de vesículas por células de CCR, uma vez que o dominante negativo de VPS4 promoveu diminuição do cargo proteico e da secreção de vesículas extracelulares, redução da proliferação celular e do efeito indutor do processo de migração na linhagem WiDr. Assim, em conjunto, o presente trabalho indicou que o complexo PrPC-HOP pode ser um bom alvo terapêutico nos processos de migração e invasão em CCR. Ainda, essas proteínas se mostraram importantes nos estágios iniciais da formação dos tumores. A modulação da secreção de vesículas extracelulares pode contribuir para retardar a progressão dos tumores colorretais. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer in the world. Despite improvements in conventional treatments, approximately two-thirds of CRC patients undergo potentially curative surgery. However, most of these patients evolve poorly, showing recurrence and/or metastasis. Search of new molecular targets for CRC therapy revealed the cellular protein Prion (PrPC) as a putative candidate. Recent studies have shown that PrPC exhibit direct or indirect participation in tumor growth, formation of metastasis, composition of multiprotein complexes and induction of signaling pathways involved in many biological processes such as proliferation. Moreover, PrPC has been described as an important modulator of colorectal tumor growth. Previous findings showed that the interaction between PrPC and its ligand HSP70/90 heat shock organizing protein (HOP) induces gliobastoma proliferation. It is well known that HOP localizes mainly in the cytoplasm but HOP is also secreted associated with extracellular vesicles. In this way, the present study sought to evaluate the role of PrPC-HOP complex and extracellular vesicles in the development and progression of CRC. We demonstrate that HOP induces the migration and invasion of CRC cell lines in a PrPC-dependent manner because the use of HOP peptide, which is able to bind to PrPC, blocking PrPC-HOP complex formation, inhibited the migration and invasion processes. In addition, our data showed that the enhancement of migration and invasion induced by PrPC-HOP interaction is mediated by ERK1/2 pathway activation. These in vitro results lead us to evaluate the PrPC and HOP expression by immunohistochemistry in tissues from patients with different tumor types. Our data showed that these proteins could be important for the initial steps of tumor development, represented by the transition from adenoma to adenocarcinoma. No correlation was found among HOP and/or PrPC expression and metastasis, lymph node involvement, staging, survival or tumor area versus normal tissue. Regarding the role of extracellular vesicles in the progression of colorectal tumors, our results showed that cell lines exhibiting similar aggressive tumor behavior can have a different protein secretion pattern and a distinct profile of extracellular vesicles release, which could induce biological process with different intensities. The conditioned medium and the extracellular vesicles derived from WiDr cell line showed a higher potential to induce migration than HCT8 cell line. Moreover, the negative modulation of VPS4, one of the proteins responsible for multivesicular body formation, showed to be an interesting approach in the study of extracellular vesicles secretion secreted by CRC cells; the negative dominant of VPS4 promoted in the WiDr cell line a reduction in the protein cargo and secretion of the extracellular vesicles, a decrease of cell proliferation and induction of migration process. Therefore, taken together, our data highlights that PrPC-HOP complex can be considered a new therapeutic target in migration and invasion processes of CRC. Moreover, these proteins appeared to be important at onset of tumor formation. The modulation of extracellular vesicles secretion may contribute for delaying the progression of colorectal tumors.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo. Apesar dos avanços nos tratamentos convencionais, aproximadamente dois terços dos pacientes com CCR são submetidos à cirurgia potencialmente curativa. Entretanto, grande parte desses pacientes evolui mal, apresentando recidivas e/ou metástases. A busca de novos alvos moleculares para a terapia do CCR revelou a proteína celular Prion (PrPC) como um possível candidato. Trabalhos recentes sugerem participação direta ou indireta de PrPC no crescimento de tumores, na formação de metástases, na composição de complexos multiproteicos e na indução de vias de sinalização envolvidas em diversos processos biológicos, como proliferação. Além disso, PrPC foi descrito como um importante modulador do crescimento de tumor colorretal. Resultados prévios mostraram que a interação da proteína PrPC com a proteína HSP70/HSP90 Organizing Protein (HOP) induz proliferação em glioblastomas. HOP é uma proteína predominantemente citoplasmática, podendo também ser secretada associada às vesículas extracelulares. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o papel do complexo PrPC-HOP e das vesículas extracelulares no desenvolvimento e progressão dos tumores colorretais. Os nossos resultados mostram que HOP induziu migração e invasão em linhagens de CCR de maneira dependente de PrPC, uma vez que o uso do peptídeo sem atividade que compete pelo sítio ligação de HOP a PrPC inibiu estes processos. Além disso, nossos dados apontaram que o aumento de migração e invasão das células de CCR induzida pela interação PrPC-HOP é mediada pela ativação da via ERK1/2. Os achados in vitro estimularam a avaliação do perfil de expressão de PrPC e HOP por imuno-histoquímica em tecidos de pacientes com diferentes tipos de tumores colorretais. Nossos resultados sugeriram que essas proteínas são importantes no início do desenvolvimento tumoral e na transição de adenomas para adenocarcinomas, não havendo correlação entre a presença de HOP e/ou PrPC com metástase, linfonodos acometidos, estadiamento, sobrevida ou região tumoral versus tecido normal. Em relação ao papel das vesículas extracelulares na progressão dos tumores colorretais, nossos resultados mostraram que linhagens celulares que apresentam padrões parecidos de agressividade tumoral podem ter perfis de secreção de proteínas e vesículas extracelulares bastante diferentes, induzindo, portanto, processos biológicos com intensidades distintas. O meio condicionado e as vesículas extracelulares da linhagem WiDr apresentaram maior potencial de indução de migração quando comparado com a linhagem HCT8. Além disso, a modulação negativa da proteína VPS4, uma das responsáveis pela formação dos corpos multivesiculares, mostrou-se uma abordagem interessante no estudo da secreção de vesículas por células de CCR, uma vez que o dominante negativo de VPS4 promoveu diminuição do cargo proteico e da secreção de vesículas extracelulares, redução da proliferação celular e do efeito indutor do processo de migração na linhagem WiDr. Assim, em conjunto, o presente trabalho indicou que o complexo PrPC-HOP pode ser um bom alvo terapêutico nos processos de migração e invasão em CCR. Ainda, essas proteínas se mostraram importantes nos estágios iniciais da formação dos tumores. A modulação da secreção de vesículas extracelulares pode contribuir para retardar a progressão dos tumores colorretais. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer in the world. Despite improvements in conventional treatments, approximately two-thirds of CRC patients undergo potentially curative surgery. However, most of these patients evolve poorly, showing recurrence and/or metastasis. Search of new molecular targets for CRC therapy revealed the cellular protein Prion (PrPC) as a putative candidate. Recent studies have shown that PrPC exhibit direct or indirect participation in tumor growth, formation of metastasis, composition of multiprotein complexes and induction of signaling pathways involved in many biological processes such as proliferation. Moreover, PrPC has been described as an important modulator of colorectal tumor growth. Previous findings showed that the interaction between PrPC and its ligand HSP70/90 heat shock organizing protein (HOP) induces gliobastoma proliferation. It is well known that HOP localizes mainly in the cytoplasm but HOP is also secreted associated with extracellular vesicles. In this way, the present study sought to evaluate the role of PrPC-HOP complex and extracellular vesicles in the development and progression of CRC. We demonstrate that HOP induces the migration and invasion of CRC cell lines in a PrPC-dependent manner because the use of HOP peptide, which is able to bind to PrPC, blocking PrPC-HOP complex formation, inhibited the migration and invasion processes. In addition, our data showed that the enhancement of migration and invasion induced by PrPC-HOP interaction is mediated by ERK1/2 pathway activation. These in vitro results lead us to evaluate the PrPC and HOP expression by immunohistochemistry in tissues from patients with different tumor types. Our data showed that these proteins could be important for the initial steps of tumor development, represented by the transition from adenoma to adenocarcinoma. No correlation was found among HOP and/or PrPC expression and metastasis, lymph node involvement, staging, survival or tumor area versus normal tissue. Regarding the role of extracellular vesicles in the progression of colorectal tumors, our results showed that cell lines exhibiting similar aggressive tumor behavior can have a different protein secretion pattern and a distinct profile of extracellular vesicles release, which could induce biological process with different intensities. The conditioned medium and the extracellular vesicles derived from WiDr cell line showed a higher potential to induce migration than HCT8 cell line. Moreover, the negative modulation of VPS4, one of the proteins responsible for multivesicular body formation, showed to be an interesting approach in the study of extracellular vesicles secretion secreted by CRC cells; the negative dominant of VPS4 promoted in the WiDr cell line a reduction in the protein cargo and secretion of the extracellular vesicles, a decrease of cell proliferation and induction of migration process. Therefore, taken together, our data highlights that PrPC-HOP complex can be considered a new therapeutic target in migration and invasion processes of CRC. Moreover, these proteins appeared to be important at onset of tumor formation. The modulation of extracellular vesicles secretion may contribute for delaying the progression of colorectal tumors.

Orientador: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2014. / A proteina prion celular (PrPC) e expressa em varios tipos celulares, especialmente no tecido nervoso. Sua funcao fisiologica completa ainda nao e bem conhecida, no entanto,sua influencia no desenvolvimento de doencas neurodegenerativas foi bem descrito. Essas doencas, mais tarde denominadas encefalopatias espongiformes, resultam de uma mudanca conformacional da PrPC (rica em ¿¿ helices) para a forma Scrapie (PrPSC, rica em folhas ¿À). Diversos estudos mostraram a associacao da PrPC, o metabolismo do cobre e a atividade antioxidante da superoxido dismutase (SOD). Contudo, mecanismos de atuacao da PrPC, neste contexto, permanecem indefinidos. Considerando o papel protetor da PrPC amplamente reportado na literatura, foram comparados os comportamentos de celulas de astrocitos de camundongo do tipo selvagem (WWT), e nocaute para a PrPC (WKO), sob condicoes de estresse oxidativo induzido por peroxido de hidrogenio. A ativacao de caspases 3 e 8 foi avaliada, observando-se que a linhagem WKO sofre apoptose de maneira mais lenta que a linhagem WWT; e que a ativacao da apoptose na linhagem nocaute ocorre pela via extrinseca, enquanto que na linhagem selvagem ocorre pela via intrinseca. Os niveis de atividade e expressao da enzima SOD1 tambem foram acompanhados, mostrando que a PrPC modula a ativacao de SOD1 a curto prazo, mas tambem induz o aumento da expressao a medio prazo. No caso da WKO, os niveis de atividade e expressao de SOD1 se mantiveram constantes. Testes de viabilidade celular confirmaram que a linhagem WKO morre mais lentamente, e os parametros bioquimicos de oxidacao (TBARS e carbonilacao de proteinas) elevados mostraram que o delay observado e potencialmente prejudicial a cultura. Os niveis de expressao de APP bem como de GFAP foram monitorados, mostrando que a linhagem selvagem possui menor pre-disposicao a formacao de agregados proteicos e maior capacidade de recuperacao pos-estresse. / The cellular prion protein (PrPC) is expressed in many cell types, especially in nervous tissue. Its physiological function is still unclear, however, his influence on the development of neurodegenerative diseases has been well described. These diseases, later called spongiform encephalopathies, are the result of a conformational change of PrPC (rich in á-helix) to the scrapie form (PrPSC rich in â-sheet). Several studies have demonstrated the association between PrPC, copper metabolism and antioxidant activity of Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD1). However, action mechanisms of PrPC in this context remain undefined. Considering the protective role of the PrPC widely reported in the literature, the behavior of mouse astrocytes cells were compared to wild type (WWT), and knockout to PrPC (WKO), under conditions of oxidative stress induced by hydrogen peroxide. The activation of caspase 3 and 8 and has been evaluated, and it was observed that the knockout strain undergoes apoptosis more slowly than the wild type strain. The activation of apoptosis in the knockout strain occurs by the extrinsic route, whereas the wild type strain occurs by the intrinsic pathway. Activity levels and expression of SOD1 were also followed, showing that PrPC modulates short-term activation SOD1, and also induces increased expression in the medium term. The WKO cell type, keep activity levels and SOD1 expression constant. Cell viability tests confirmed that the strain WKO die more slowly, and biochemical parameters oxidation (TBARS and protein carbonylation) showed that the higher observed delay is potentially harmful to the cell culture. APP and GFAP expression levels were monitored, showing that the wild type has a lower predisposition to the formation of protein aggregates and higher capacity to post-stress recovery.