NISHI, Beatriz Caroline. Osmotina de Plumeria rubra: identificação, clonagem molecular, modelamento tridimensional e possível efeito mimético da adiponectina. 2016. 111 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T17:46:05Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T17:50:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T17:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) Previous issue date: 2016 / Pathogenesis-related proteins (PRs) are expressed in response to pathogenic infections and abiotic stresses. PR-5 family includes proteins related to thaumatin and osmotin. In this study, the presence of an ~22 kDa osmotin-like protein in Plumeria rubra latex was confirmed by western blot assay using anti-CpOsm antibodies, as described by Freitas et al., 2015. The cDNA fragment encoding this osmotin (PrOsm) was cloned, and then the predicted protein was characterized and modeled in silico. The amplification of the cDNA fragment encoding the PrOsm was carried out by RTPCR. The PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector and cloned in E. coli DH5α cells. Clones obtained were submitted to sequencing. The computational analysis of the deduced sequences of P. rubra osmotins (PrOsms) showed that the proteins have an apparent molecular weight about 22 kDa and contain 16 cysteine residues involved in 8 disulfide bonds, stabilizing the protein structure. The PrOsms structure exhibits a typical architecture of TLPs, composed by three domains. Mapping of the electrostatic potentials showed that PrOsms contain, on its surface, an acidic cleft, between domains I and II. The PrOsms were evaluated for their ability to interact with human adiponectin receptors (AdipoR1 and AdipoR2) in silico. Molecular docking suggests that PrOsms are able to interact with adiponectin receptors, similarly to AdipoQ, being potential therapeutic targets for the control of obesity-related diseases, including type 2 diabetes and metabolic syndrome. / Proteínas relacionadas à patogênese (PR proteínas) são expressas em resposta a infecções por patógenos e estresses abióticos. A família PR-5 inclui proteínas relacionadas à taumatina e a osmotina. Neste estudo, a presença de uma proteína do tipo osmotina de aproximadamente 22 kDa, no látex de Plumeria rubra, foi confirmada por meio de ensaios de western blot utilizando anticorpos anti-CpOsm (osmotina de C. procera), como descrito por Freitas e colaboradores (2015). O fragmento de cDNA codificando esta osmotina (PrOsm) foi clonado, a proteína predita foi caracterizada e sua estrutura foi modelada in silico. A amplificação do fragmento de cDNA codificante da PrOsm foi realizado por meio de RT-PCR. O fragmento amplificado, de aproximadamente 600 pb, foi ligado a um vetor de clonagem (pGEM-T Easy). Células de E. coli DH5α eletrocompetentes foram então transformadas com os plasmídeos recombinantes (pGEM-T Easy::PrOsm) e os insertos foram sequenciados. As sequências obtidas foram submetidas a análises in silico. As osmotinas de P. rubra (PrOsms) são proteínas de aproximadamente 22 kDa, apresentando 16 resíduos de cisteína, envolvidos na formação de 8 ligações dissulfeto. A estrutura das PrOsms exibe uma arquitetura típica de TLPs, composta por três domínios. O mapeamento dos potenciais eletrostáticos mostrou que as PrOsms apresentam, em sua superfície, uma fenda de natureza acídica, localizada entre os domínios I e II. A capacidade potencial das PrOsms de interagir com os receptores de adiponectina humana (AdipoR1 e AdipoR2) foi predita in silico. O docking molecular sugere que as PrOsms são capazes de interagir com os receptores de adiponectina, de forma similar a AdipoQ, sendo portanto potenciais alvos terapêuticos para o controle de doenças relacionadas à obesidade, incluindo diabetes tipo 2 e síndrome metabólica.

SILVA, Maria Zelandia Rocha. Isolamento em cromatografia de imunoafinidade e atividade antifúngica de osmotinas de fluidos laticíferos. 2015. 85 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T19:36:22Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T20:25:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T20:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estão constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto bióticos como abióticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteínas denominadas de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteína). As Pr-proteínas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condições de estresse osmótico, frio e escassez de água. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticíferos e algumas delas estão relacionadas com a atividade antifúngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolá- las e avaliar suas atividades antifúngicas, nos fluidos laticíferos das seguintes espécies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos látex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas através de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do látex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. Análises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presença de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteínicas. A protease cisteínica co- purificada no látex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a análise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presença de uma sequência semelhante em ambas as proteínas, que pode ser um epítopo disponível ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra não apresentaram atividade antifúngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que não houve correlação entre a atividade antifúngica e à presença destas osmotinas, as atividades proteolíticas das frações proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifúngica. Nos fluidos laticíferos, as proteases cisteínicas estão mais frequentemente relacionadas à atividade antifúngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a função das osmotinas na fisiologia de plantas laticíferas são necessários.