NISHI, Beatriz Caroline. Osmotina de Plumeria rubra: identificação, clonagem molecular, modelamento tridimensional e possível efeito mimético da adiponectina. 2016. 111 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T17:46:05Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T17:50:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T17:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_bcnishi.pdf: 6198229 bytes, checksum: 907d1b766e98e2a4ef1484116216b945 (MD5) Previous issue date: 2016 / Pathogenesis-related proteins (PRs) are expressed in response to pathogenic infections and abiotic stresses. PR-5 family includes proteins related to thaumatin and osmotin. In this study, the presence of an ~22 kDa osmotin-like protein in Plumeria rubra latex was confirmed by western blot assay using anti-CpOsm antibodies, as described by Freitas et al., 2015. The cDNA fragment encoding this osmotin (PrOsm) was cloned, and then the predicted protein was characterized and modeled in silico. The amplification of the cDNA fragment encoding the PrOsm was carried out by RTPCR. The PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector and cloned in E. coli DH5α cells. Clones obtained were submitted to sequencing. The computational analysis of the deduced sequences of P. rubra osmotins (PrOsms) showed that the proteins have an apparent molecular weight about 22 kDa and contain 16 cysteine residues involved in 8 disulfide bonds, stabilizing the protein structure. The PrOsms structure exhibits a typical architecture of TLPs, composed by three domains. Mapping of the electrostatic potentials showed that PrOsms contain, on its surface, an acidic cleft, between domains I and II. The PrOsms were evaluated for their ability to interact with human adiponectin receptors (AdipoR1 and AdipoR2) in silico. Molecular docking suggests that PrOsms are able to interact with adiponectin receptors, similarly to AdipoQ, being potential therapeutic targets for the control of obesity-related diseases, including type 2 diabetes and metabolic syndrome. / Proteínas relacionadas à patogênese (PR proteínas) são expressas em resposta a infecções por patógenos e estresses abióticos. A família PR-5 inclui proteínas relacionadas à taumatina e a osmotina. Neste estudo, a presença de uma proteína do tipo osmotina de aproximadamente 22 kDa, no látex de Plumeria rubra, foi confirmada por meio de ensaios de western blot utilizando anticorpos anti-CpOsm (osmotina de C. procera), como descrito por Freitas e colaboradores (2015). O fragmento de cDNA codificando esta osmotina (PrOsm) foi clonado, a proteína predita foi caracterizada e sua estrutura foi modelada in silico. A amplificação do fragmento de cDNA codificante da PrOsm foi realizado por meio de RT-PCR. O fragmento amplificado, de aproximadamente 600 pb, foi ligado a um vetor de clonagem (pGEM-T Easy). Células de E. coli DH5α eletrocompetentes foram então transformadas com os plasmídeos recombinantes (pGEM-T Easy::PrOsm) e os insertos foram sequenciados. As sequências obtidas foram submetidas a análises in silico. As osmotinas de P. rubra (PrOsms) são proteínas de aproximadamente 22 kDa, apresentando 16 resíduos de cisteína, envolvidos na formação de 8 ligações dissulfeto. A estrutura das PrOsms exibe uma arquitetura típica de TLPs, composta por três domínios. O mapeamento dos potenciais eletrostáticos mostrou que as PrOsms apresentam, em sua superfície, uma fenda de natureza acídica, localizada entre os domínios I e II. A capacidade potencial das PrOsms de interagir com os receptores de adiponectina humana (AdipoR1 e AdipoR2) foi predita in silico. O docking molecular sugere que as PrOsms são capazes de interagir com os receptores de adiponectina, de forma similar a AdipoQ, sendo portanto potenciais alvos terapêuticos para o controle de doenças relacionadas à obesidade, incluindo diabetes tipo 2 e síndrome metabólica.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-25T19:31:51Z No. of bitstreams: 1 HUMBERTO.FREITAS2.pdf: 7925171 bytes, checksum: a90703d131530b19fcb2e6433ff99c07 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-05-29T17:25:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 HUMBERTO.FREITAS2.pdf: 7925171 bytes, checksum: a90703d131530b19fcb2e6433ff99c07 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-29T17:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HUMBERTO.FREITAS2.pdf: 7925171 bytes, checksum: a90703d131530b19fcb2e6433ff99c07 (MD5) / FAPESB / Apesar dos avanços no desenvolvimento de fármacos antifúngicos, observa-se um crescimento de cepas resistentes aos fármacos de escolha (derivados azólicos). Diante disso, torna-se imprescindível racionalizar as propriedades físico-químicas e estruturais que governam a atividade antifúngica de derivados azólicos, bem como investigar os mecanismos moleculares responsáveis pela resistência. Visando elucidar algumas dessas questões os objetivos desse trabalho são: 1) Determinar a atividade biológica de 33 derivados azólicos, frente á Cryptococcus gattii, a fim de utilizá-la como variável dependente na construção de modelos classificatórios (KNN e SIMCA) e quantitativos (HQSAR e QSAR 2D); 2) Investigar, do ponto de vista estrutural, mutações pontuais no gene ERG11 que conferem resistência a derivados azólicos. Os modelos classificatórios (KNN e SIMCA) mostram consistência interna razoável ao acertar a classificação de 60% dos compostos ativos e 75% dos compostos inativos do grupo teste. Adicionalmente, o modelo SIMCA sugere que a transferência de carga entre átomos distantes de 10 ligações (JGI10) é importante para diferenciar moléculas ativas das inativas contra C. gattii. Os modelos quantitativos baseados em fragmentos moleculares (hologramas QSAR) apresentam bom ajuste (r2=0,85), porém baixo poder preditivo (r2 pred=0,38), enquanto o melhor modelo de QSAR 2D baseado em descritores topológicos apresenta resultados estatísticos elevados (r2=0,95 e q2=0,86) com 3 PCs, além de bom poder preditivo (r2 pred=0,72). Este modelo indica ainda que o aumento da potência é influenciado pela menor distribuição de carga de uma molécula na distância de dois átomos (GGI1) e pela menor diferença de eletronegatividade dos átomos na distância topológica 1 e 2 (GATS1e e MATS2e). Os modelos comparativos de lanosterol 14α-desmetilase de C. gattii, nativa e com mutações pontuais (G484S, H488Y e K156R), mostram que alterações no posicionamento do grupo heme e redução do número de interações entre a enzima e o grupo prostético, desestabilizam a interação entre o ferro do grupo heme e o nitrogênio do anel imidazólico ou triazólico, e modificações na flexibilidade conformacional do alvo terapêutico, reduzindo assim o acesso do antifúngico ao sítio ativo da enzima, são os principais mecanismos pelos quais as mutações reduzem a afinidade dos derivados azólicos pelo alvo terapêutico. / Despite advances in the development of antifungal drugs, there is an upsurge of resistant strains against the drugs of choice (azole derivatives). Hence, it becomes essential to comprehend the physicochemical and structural properties that rule the antifungal activity of azole’s derivatives, as well as to investigate the molecular mechanisms responsible for fungal resistance. Aiming at elucidating some of these questions the objectives of this study are: 1) To determine the biological activity of 33 azole derivatives against Cryptococcus gattii, in order to use it as a dependent variable in the development of classification (KNN and SIMCA) and quantitative (HQSAR and 2D QSAR) models; 2) To investigate, from a structural stand-point of view, mutations in the ERG11 gene which render C. gattii resistant to azole’s derivatives. Classification models (KNN and SIMCA) show reasonable internal consistency, correctly classifying 60% of the active compounds and 75% of inactive compounds from the test group. Additionally, the SIMCA model suggests that the charge transfer between atoms 10 bonds apart (JGI10) is important to differentiate azole derivatives that are either active or inactive against C. gattii. The quantitative models based on molecular fragments (hologram QSAR) shows good fit (r2 = 0.85), but low predictive power (r2 pred = 0.38), whereas the best 2D QSAR model, built from topological descriptors, shows outstanding statistical results (r2 = 0.95 and q2 = 0.86) with 3 PCs, along with good predictive power (r2 pred = 0.72). This model also indicates that potency boost is influenced by reduced charge distribution between two atoms (GGI1) and by the lower electronegativity difference at the topological distance 1 and 2 (GATS1e and MATS2e). Comparative models of native and mutated (G484S, H488Y and K156R) lanosterol 14α- demethylases of C. gattii show that changes in the positioning of the heme group and reduced binding of the enzyme towards the prosthetic group, disrupt the interaction profile between the heme iron and the nitrogen of imidazole or triazole ring, as well as changes in the therapeutic target conformational flexibility, which reduces the access of the antifungal agente to the enzyme active site, are the main mechanisms by which affinity of azole derivatives is reduced.

Quase 100 anos após a descoberta do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, não existem tratamentos efetivos para esta doença tanto em sua fase aguda quanto crônica. Neste trabalho é apresentado um estudo em grande escala das proteínas preditas a partir de seqüências genômicas de T. cruzi, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, visando investigar e discutir os seguintes aspectos: (i) quais seqüências podem ter suas estruturas tridimensionais (3D) geradas e qualificadas por técnicas de modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline; (ii) associar a estes modelos protéicos uma classificação enzimática (EC), através da ferramenta ECNGet (desenvolvida neste trabalho); (iii) através desta associação enzimática aos modelos, usá-los para inferir possíveis funções biológicas às suas seqüências alvos originalmente anotadas como hipotéticas, e/ou sugerir uma possível reanotação de seqüências; (iv) investigar dentre as enzimas com estruturas 3D geradas quais possuem similaridades (ortologias) com enzimas humanas (genoma de Homo sapiens); (v) determinar quais das enzimas identificadas fazem parte de alguma via metabólica representativa depositada em bancos de dados específicos. Dentre as enzimas de T. cruzi consideradas como alvos moleculares para o tratamento da doença de Chagas, as cisteíno proteases têm sido extensivamente estudadas experimentalmente. Neste presente estudo, as isoformas 1 e 2 da cruzipaína foram investigadas por simulações de dinâmica molecular (DM), nas temperaturas de 25C e 37C, tendo como controle a papaína, enzima representativa da família C1 de cisteíno proteases. Analisando 20.679 seqüências protéicas preditas a partir de CDS (Seqüência Codificante) não redundantes do genoma de T. cruzi (cepa CL Brener), 4.719 seqüências foram associadas a proteínas de membrana e foram gerados 2.786 modelos estruturais protéicos. Destes modelos, 1.888 foram associados a um EC, dos quais aproximadamente 79,5% foram classificados como tendo uma qualidade suficientemente boa para serem usados em estudos de desenho racional de fármacos baseado em estrutura, através de métodos de modelagem molecular. Dos 1.876 modelos enzimáticos com, pelo menos, uma sub-subclasse enzimática, foram identificadas 99 seqüências possivelmente análogas a enzimas humanas, 1.776 como similares e 1 bifuncional como análoga/similar. Também foi possível detectar um subgrupo de 10 modelos considerados como prováveis enzimas específicas de T. cruzi em relação a H. sapiens, não descartando possíveis relações destas seqüências com outros organismos. Nos estudos de DM realizados, o principal resultado obtido indica que a presença de resíduos ácidos na posição 158 (numeração da papaína) no sítio catalítico, pode induzir uma reorganização estrutural, suscetível a variações de temperatura, dos resíduos catalíticos em cisteíno proteases da família da papaína. Esta reorganização estrutural gera uma conformação semelhante à apresentada pela tríade catalítica (ASP/HIS/SER) em serino proteases.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-02-14T00:41:33Z No. of bitstreams: 1 PPGBiotec - Disserta??o corrigida - Isis Bugia.pdf: 6811384 bytes, checksum: 2380cbb790d35324858de90e106415fc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T00:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PPGBiotec - Disserta??o corrigida - Isis Bugia.pdf: 6811384 bytes, checksum: 2380cbb790d35324858de90e106415fc (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / The Visceral Leishmaniasis (VL) is the second most important vector-borne disease in the world, transmitted in the Americas by Lutzomyia longipalpis, vector control is essential for the prevention of the disease. But since it is not possible to identify the oviposition sites, the fight is directed to adult insects, using traps impregnated with chemical attractants. Whereas the Odorant Binding Proteins (OBPs) act in the first level of odor selection, this work used in silico methodology to identify putative vector olfactory chemical modulators based on the structure of OBPs and known ligands. For this, tridimensional (3D) structure of L. longipalpis OBPs were predicted by three comparative modeling methods. The best model, predicted by I-Tasser, was refined by Molecular Dynamics on Gromacs. Then, in a hierarchical virtual screening approach, natural compounds of ZINC12 closer to the typical OBP ligands in global chemical space, provided by ChemGPS-NP, were evaluated and staggered concerning affinity with the orthosteric site from the OBP, by molecular docking on DOCK6. The compounds were scored by GRIDSCORE, then the 100 best classified were submitted to AMBERSCORE, which took into account the flexibility from both OBP and the docked ligands. The lowest energy conformations interacted with a hydrophobic pocket through residues Met6, Gly10, Glu11, Ala9 Arg14, Leu74, Met53, Phe118, Phe119, Pro120, amino groups and formed ionic interaction with carboxyl of Glu11, Furthermore, Phe119, Asn29 and Gln69 formed hydrogen bonds, this last formed donor and acceptor H-bonds. / A Leishmaniose Visceral (LV) ? a segunda doen?a vetorial mais importante do mundo, transmitida nas Am?ricas por Lutzomyia longipalpis, o controle do vetor ? indispens?vel ? preven??o da doen?a. Mas como n?o ? poss?vel identificar onde ocorre a oviposi??o, o combate ? direcionado aos insetos adultos, utilizando armadilhas impregnadas com atrativos qu?micos. Considerando que as Prote?nas Ligadoras de Odor (OBPs) atuam no primeiro n?vel de sele??o dos odores, este trabalho utilizou uma metodologia in silico para identificar potenciais moduladores qu?micos olfativos do vetor baseando-se na estrutura das OBPs e de ligantes conhecidos. Para isso, foram preditas as estruturas tridimensionais (3D) de OBPs de L. longipalpis por tr?s m?todos de modelagem comparativa. O melhor modelo, predito pelo I-Tasser, foi refinado por Din?mica Molecular no Gromacs. Ent?o, numa abordagem hier?rquica da triagem virtual, os compostos naturais do ZINC12 mais pr?ximos dos t?picos ligantes de OBPs no espa?o qu?mico global, fornecido pelo ChemGPS-NP, foram avaliados e escalonados quanto ? afinidade com o s?tio ortost?rico da OBP, pelo acoplamento molecular no DOCK6. Os compostos foram pontuados pelo Gridscore, em seguida, os cem melhores classificados foram submetidos ? pontua??o pelo Amberscore, que levou em conta a flexibilidade tanto da OBP como dos ligantes acoplados. As conforma??es de menor energia interagiram com um bols?o hidrof?bico atrav?s dos res?duos Met6, Ala9, Gly10, Glu11, Arg14, Met53, Leu74, Phe118, Phe119, Pro120; grupamentos amino formaram pontes salinas com a carboxila do Glu11. Al?m disso, os res?duos Phe119, Asn29 e Gln69 formaram liga??es hidrog?nio, sendo que, este ?ltimo res?duo formou liga??es-H aceptoras e doadoras.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao Priscila Capriles.pdf: 11456267 bytes, checksum: 5add21ce6ff9ebf894b553efdf4c5125 (MD5) Previous issue date: 2007-03-15 / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quase 100 anos após a descoberta do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, não existem tratamentos efetivos para esta doença tanto em sua fase aguda quanto crônica. Neste trabalho é apresentado um estudo em grande escala das proteínas preditas a partir de seqüências genômicas de T. cruzi, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, visando investigar e discutir os seguintes aspectos: (i) quais seqüências podem ter suas estruturas tridimensionais (3D) geradas e qualificadas por técnicas de modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline; (ii) associar a estes modelos protéicos uma classificação enzimática (EC), através da ferramenta ECNGet (desenvolvida neste trabalho); (iii) através desta associação enzimática aos modelos, usá-los para inferir possíveis funções biológicas às suas seqüências alvos originalmente anotadas como hipotéticas, e/ou sugerir uma possível reanotação de seqüências; (iv) investigar dentre as enzimas com estruturas 3D geradas quais possuem similaridades (ortologias) com enzimas humanas (genoma de Homo sapiens); (v) determinar quais das enzimas identificadas fazem parte de alguma via metabólica representativa depositada em bancos de dados específicos. Dentre as enzimas de T. cruzi consideradas como alvos moleculares para o tratamento da doença de Chagas, as cisteíno proteases têm sido extensivamente estudadas experimentalmente. Neste presente estudo, as isoformas 1 e 2 da cruzipaína foram investigadas por simulações de dinâmica molecular (DM), nas temperaturas de 25°C e 37°C, tendo como controle a papaína, enzima representativa da família C1 de cisteíno proteases. Analisando 20.679 seqüências protéicas preditas a partir de CDS (Seqüência Codificante) não redundantes do genoma de T. cruzi (cepa CL Brener), 4.719 seqüências foram associadas a proteínas de membrana e foram gerados 2.786 modelos estruturais protéicos. Destes modelos, 1.888 foram associados a um EC, dos quais aproximadamente 79,5% foram classificados como tendo uma qualidade suficientemente boa para serem usados em estudos de desenho racional de fármacos baseado em estrutura, através de métodos de modelagem molecular. Dos 1.876 modelos enzimáticos com, pelo menos, uma sub-subclasse enzimática, foram identificadas 99 seqüências possivelmente análogas a enzimas humanas, 1.776 como similares e 1 bifuncional como análoga/similar. Também foi possível detectar um subgrupo de 10 modelos considerados como prováveis enzimas específicas de T. cruzi em relação a H. sapiens, não descartando possíveis relações destas seqüências com outros organismos. Nos estudos de DM realizados, o principal resultado obtido indica que a presença de resíduos ácidos na posição 158 (numeração da papaína) no sítio catalítico, pode induzir uma reorganização estrutural, suscetível a variações de temperatura, dos resíduos catalíticos em cisteíno proteases da família da papaína. Esta reorganização estrutural gera uma conformação semelhante à apresentada pela tríade catalítica (ASP/HIS/SER) em serino proteases.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LudovicoM.pdf: 1651172 bytes, checksum: 32d873e29ab629d06ae3a79806c6523e (MD5) Previous issue date: 2008-07-02 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Serines proteinases inhibitors (PIs) are widely distributed in nature and are able to inhibit both in vitro and in vivo enzymatic activites. Seed PIs in than leguminous are classified in seven families, Bowman-Birk and Kunitz type families that most studied representing an important role in the first line of defense toward insects pests. Some Kunitz type inhibitors possess activities serine and cysteine for proteinases named bifunctional inhibitor, as ApTKI the inhibitor isolate from seed of Adenanthera pavonina. The A. pavonina inhibitor presenting the uncommon property and was used for interaction studies between proteinases serine (trypsin) and cysteine (papain). In order to determinate the in vitro interaction of ApTKI against enzymes inhibitor purification was carried cut by using chromatographic techniques and inhibition assays. The 3D model of the bifunctional inhibitor ApTKI was constructed SWISS-MODEL program by homology modeling using soybean trypsin inhibitor (STI, pdb:1ba7), as template which presented 40% of identity to A. pavonina inhibitor. Model quality was evaluated by PROCHECK program. Moreover in silico analyzes of formed complex between the enzymes and ApTKI was evaluated by HEX 4.5 program. In vitro results confirmed the inhibitory assays, where the inhibitor presented the ability to simultaneously inhibit trypsin and papain. The residues encountered in the inhibitor model of folder structural three-dimensional that make contact to enzymes target coud explain the specificity pattern against serine and cysteine proteinases / Os inibidores de proteinases ser?nicas (IPs) est?o extensamente distribu?dos na natureza e inibem a atividade enzim?tica in vitro e in vivo. Estes IPs em sementes de leguminosas compreendem sete fam?lias, no entanto as fam?lias Bowman-Birk e do tipo Kunitz s?o as mais estudadas e representam um papel importante na primeira linha de defesa contra insetos pragas. Alguns inibidores do tipo Kunitz possuem atividades para proteinases ser?nicas e ciste?nicas sendo denominados inibidores bifuncionais, como o inibidor ApTKI da semente de Adenanthera pavonina. O inibidor de A. pavonina por apresentar essa caracter?stica incomum aos inibidores dessa fam?lia foi utilizado para o estudo da intera??o entre as proteinases ser?nica (tripsina) e ciste?nica (papa?na). Para determinar a intera??o in vitro de ApTKI e as enzimas alvo foi realizada a purifica??o do inibidor a partir de t?cnicas cromatogr?ficas e ensaios de inibi??o. O modelo 3D do inibidor bifuncional ApTKI foi constru?do pelo programa SWISS-MODEL atrav?s da metodologia de modelagem por homologia utilizando como molde o inibidor de tripsina de soja (STI, pdb:1ba7) que apresentou 40% de identidade com a prote?na alvo. A qualidade do modelo foi avaliada pelo programa PROCHECK. Para a an?lise do complexo in silico entre as enzimas alvo e o inibidor foi utilizado o programa HEX 4.5. Estes resultados confirmaram os ensaios inibit?rios in vitro, onde ApTKI apresentou a capacidade de inibir simultaneamente tripsina e papa?na. Algumas das diferen?as observadas nos res?duos do sitio reativo explicam a forte afinidade para tripsina e a fraca para papa?na

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodrigoOA.pdf: 1265658 bytes, checksum: 99f4f1b083a5b39748d0fb4e05fcf79f (MD5) Previous issue date: 2009-02-06 / Chitin is an important structural component of the cellular wall of fungi and exoskeleton of many invertebrate plagues, such as insects and nematodes. In digestory systems of insects it forms a named matrix of peritrophic membrane. One of the most studied interaction models protein-carbohydrate is the model that involves chitin-binding proteins. Among the involved characterized domains already in this interaction if they detach the hevein domain (HD), from of Hevea brasiliensis (Rubber tree), the R&R consensus domain (R&R), found in cuticular proteins of insects, and the motif called in this study as conglicinin motif (CD), found in the cristallography structure of the β-conglicinin bounded with GlcNac. These three chitin-binding domains had been used to determine which of them could be involved in silico in the interaction of Canavalia ensiformis and Vigna unguiculata vicilins with chitin, as well as associate these results with the WD50 of these vicilins for Callosobruchus maculatus larvae. The technique of comparative modeling was used for construction of the model 3D of the vicilin of V. unguiculata, that was not found in the data bases. Using the ClustalW program it was gotten localization of these domains in the vicilins primary structure. The domains R&R and CD had been found with bigger homology in the vicilins primary sequences and had been target of interaction studies. Through program GRAMM models of interaction ( dockings ) of the vicilins with GlcNac had been gotten. The results had shown that, through analysis in silico, HD is not part of the vicilins structures, proving the result gotten with the alignment of the primary sequences; the R&R domain, although not to have structural similarity in the vicilins, probably it has a participation in the activity of interaction of these with GlcNac; whereas the CD domain participates directly in the interaction of the vicilins with GlcNac. These results in silico show that the amino acid number, the types and the amount of binding made for the CD motif with GlcNac seem to be directly associates to the deleterious power that these vicilins show for C. maculatus larvae. This can give an initial step in the briefing of as the vicilins interact with alive chitin in and exert its toxic power for insects that possess peritrophic membrane / A quitina (homopol?mero linear contendo res?duos de β-1,4-N-acetil-D-glicosamina (GlcNac) ? um importante componente estrutural da parede celular de fungos e exoesqueletos de muitos invertebrados pragas, tais como insetos e nemat?ides. Em sistemas digest?rios de insetos forma uma matriz denominada de membrana peritr?fica. Um dos mais estudados modelos de intera??o prote?na-carboidrato ? o modelo que envolve as prote?nas ligantes ? quitina. Dentre os motivos j? caracterizados envolvidos nesta intera??o se destacam o motivo heve?na (HD), obtida de Hevea brasiliensis (Seringueira), o motivo R&R consenso (R&R), encontrado em prote?nas cuticulares de insetos, e o motivo denominado neste estudo como motivo conglicinina (CD), encontrado na estrutura cristalogr?fica da β-conglicinina complexada com GlcNac. Estes tr?s motivos de liga??o ? quitina foram usados para determinar qual(is) deles poderia(m) estar envolvido(s) in silico na intera??o das vicilinas de Canavalia ensiformis e Vigna unguiculata com quitina, como tamb?m associar estes resultados com o WD50 destas vicilinas para larvas de Callosobruchus maculatus. A t?cnica de modelagem comparativa foi utilizada para constru??o do modelo 3D da vicilina de V. unguiculata, que n?o foi encontrada nos bancos de dados. Atrav?s do programa ClustalW obteve-se a localiza??o destes dom?nios na estrutura prim?ria das vicilinas. Os dom?nios R&R e CD foram encontrados com maior homologia nas seq??ncias prim?rias das vicilinas e foram alvos de estudos de intera??o. Atrav?s do programa GRAMM foram obtidos modelos de intera??o ( dockings ) das vicilinas com GlcNac. Os resultados mostraram que, atrav?s de an?lises in silico, o motivo HD n?o faz parte da estrutura das vicilinas, comprovando o resultado obtido com o alinhamento das seq??ncias prim?rias; o motivo R&R, apesar de n?o ter semelhan?a estrutural nas vicilinas, provavelmente tem uma participa??o na atividade de intera??o destas com GlcNac; enquanto que o motivo CD participa diretamente na intera??o das vicilinas com GlcNac. Estes resultados in silico mostram que o n?mero de amino?cidos, os tipos e a quantidade de liga??es feitas pelo motivo CD com GlcNac parecem estar diretamente associados ao poder delet?rio que essas vicilinas possuem para larvas de C. maculatus. Isso pode constutuir um passo inicial na elucida??o de como as vicilinas interagem com quitina in vivo e exercem seu poder t?xico para insetos que possuem membrana peritr?fica

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-15Bitstream added on 2014-06-13T21:03:48Z : No. of bitstreams: 1 provazzi_pjs_dr_sjrp.pdf: 1081709 bytes, checksum: 9a35b9ad50fc4eed266a481d830f02de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-13T12:21:40Z No. of bitstreams: 1 viniciusschmitzpereiranunes.pdf: 31716642 bytes, checksum: 9cfc92a2078f124a8a9e3fa1c6509c7e (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T03:28:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 viniciusschmitzpereiranunes.pdf: 31716642 bytes, checksum: 9cfc92a2078f124a8a9e3fa1c6509c7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T03:28:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 viniciusschmitzpereiranunes.pdf: 31716642 bytes, checksum: 9cfc92a2078f124a8a9e3fa1c6509c7e (MD5) Previous issue date: 2015-12-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Esquistossomose é uma doença negligenciada causada por parasitas do gênero Schistosoma. Segundo a Oganização Mundial da Saúde, mais de 200 milhões de pessoas no mundo estão infectadas, sendo de 4 a 6 milhões de pessoas somente no Brasil. A principal forma de tratamento da doença é o uso do medicamento praziquantel, porém, há relatos na literatura de resistência do parasita ao medicamento. Tal situação levantou a necessidade pela busca de novos alvos moleculares e novos medicamentos para o tratamento da doença. Um grupo de proteínas apresentadas como potenciais alvos moleculares de esquistomicidas é o das NTPDases. Estas enzimas hidrolisam nucleotídeos di e trifosfatados (e.g. ADP e ATP) em presença de cátions bivalentes, e estão descritas em diferentes organismos. No parasita Schistosoma mansoni foi descrita uma isoforma de NTPDase ancorada na membrana plasmática das células do tegumento do verme adulto e conhecida como SmATPDase1 ou Sm1. Segundo a literatura, esta isoforma é a segunda proteína mais expressa no tegumento dos vermes adultos. Devido à localização e a importância dos nucleotídeos di e trifosfatos na ativação hemostática e de células do sistema imunológico, foi sugerido que a Sm1 estaria envolvida na regulação das concentrações de nucleotídeos em torno do parasita, o que contribuiria com sua evasão. Baseado nos pressupostos acima, tem sido proposto o uso da Sm1 como possível alvo molecular de novos esquistomicidas. Nos mamíferos foram descritas oito isoformas de NTPDases. A isoforma 1 de humanos (HsNTPDase1), mais conhecida como CD39, está presente nas células do endotélio dos vasos sanguíneos, sendo responsável pela regulação das concentrações extracelulares de ATP e ADP. No presente trabalho, apresentamos os modelos 3D da Sm1 e CD39, construídos por meio da técnica de modelagem por homologia. Devido a semelhança da estrutura 3D de ambos os modelos, foi necessário realizar uma análise estrutural comparativa entre as duas enzimas, por meio de simulações de dinâmica molecular e estudos de docking receptor-ligante. Predição de cavidades foram feitas no modelo da Sm1 a fim de detectar cavidades diferentes do sítio-ativo que pudessem ser usadas em estudos de docking. Dessa etapa resultou a seleção de duas cavidades, o sítio-ativo e um sítio alternativo. Em seguida foram realizadas simulações de dinâmica molecular envolvendo os modelos da Sm1 e CD39, e os moldes PDB3ZX3 e PDB3CJA. Para cada modelo foram feitas duas simulações, uma com a presença do ANP (análogo do ATP) no sítio-ativo e uma na ausência do ANP. Em todas as quatro simulações os modelos estão acoplados a uma membrana do tipo POPC, e o tempo de simulação foi de 32ns. Para os moldes o tempo de simulação foi 40ns. As simulações mostraram que a região do sítio alternativo apresentou, no modelo da Sm1 sem o ligante, mudanças na conformação que não foram observadas na Sm1 com ligante e nas duas simulações envolvendo o modelo da CD39. Isso sugere que o ligante contribui na estabilização da estrutura da Sm1 e CD39. Também foram feitas análises de drogabilidade e de agrupamento das conformações geradas ao longo das simulações envolvendo os modelos. Para as análises de agrupamento foi proposto o uso da metodologia GLCM, juntamente com o algoritmo K-means. Essas análises tinham como objetivo selecionar conformações das trajetórias que pudessem ser usadas nos estudos de docking. Para os estudos de docking foram analisadas a afinidade de três ligantes (ANP, ARL67153 e praziquantel) no sítio ativo e no sítio alternativo, de ambas as enzimas. Para o sítio ativo, os melhores resultados foram obtidos com os ligantes ANP e ARL67153, em todas as simulações. Foi observado que o ARL67153 apresentou resultados similares com os do ANP. No sítio alternativo os melhores resultados foram obtidos com as conformações da simulação da Sm1 sem o ANP no sítio ativo, sendo que na CD39 nenhum dos ligantes foram atracados dentro do sítio. Com relação ao praziquantel, os melhores resultados foram observados no sítio ativo da Sm1 e CD39. É possível concluir que o sítio alternativo da Sm1 é uma região que pode ser usada para o atracamento de possíveis inibidores dessa enzima. / Schistosomiasis is a neglected disease caused by parasites of the genus Schistosoma. According to the World Health Organization, over 200 million people worldwide were infected, and 4 to 6 million people only in Brazil. The main treatment is the use of the drug praziquantel, but there are reports in the literature suggesting the parasite’s resistance to praziquantel. This situation raised the need for search new molecular targets and new drugs for treating this disease. A group of proteins as potential targets is NTPDase. These enzymes hydrolyse nucleotides (e.g., ADP and ATP) in the presence of bivalent cations, and they are described in different organisms. In the parasite Schistosoma mansoni, an isoform of NTPDase„ named SmATPDase1 or Sm1, was described as a protein anchored in the plasma membrane of cells in the seed coat of the adult worm. According to the literature, this isoform is the most expressed enzyme in the tegument of adult worms. Due to the location and importance of nucleotide triphosphates in the hemostatic and activation of immune cells, Sm1 has been suggested to be involved in the regulation of nucleotide concentrations around the parasite, which could be a mechanism of immune evasion in schistosomiasis. Based on the above assumptions, it has been proposed the use of Sm1 as a possible target for new schistosomicide drugs. In mammals have been described eight isoforms. Isoform 1 of human NTPDase (HsNTPDase1), also known as CD39, is present in the endothelial cells of blood vessels, and it is responsible for the regulation of extracellular concentrations of ATP and ADP. In this paper, we present 3D models of Sm1 and CD39, constructed by homology modeling technique. Due to the similarity of 3D structures of both models, it was necessary to perform a comparative structural analysis of both enzymes by molecular dynamics simulations and and receptorligand docking. Cavities prediction were made in Sm1’s model and two cavities were selected, the active site and an alternative binding site proposed in this work. After, it was performed molecular dynamics simulations involving models of Sm1 and CD39, and PDB3ZX3 and PDB3CJA templates. Two simulations were performed for each model, one in the presence of ANP (ATP analog) in the active-site and other in the absence. In models’ simulations, structures were coupled to a POPC membrane, and the simulation time was 32ns. Simulation time for templates was 40ns. Simulations showed that the alternative site in Sm1 without ANP presented conformational changes which were not observed in simulations of CD39 and Sm1 with ANP. This suggests that the presence of ligand in the active site contributes in stabilizing the structure of Sm1 and CD39. Druggability and clustering analysis were performed with conformations generated through simulations. In this work, we proposed the use of GLCM methodology with Kmeans algorithm for clustering analysis, aiming to select conformations from trajectories that could be used in receptor-ligand docking. We analyzed the affinity of three ligands (ANP, ARL67153 and praziquantel) in the active site and in the alternative site of Sm1 and CD39 enzymes. The best results for active site were obtained with ANP and ARL67153 ligands, in all simulations. For alternative site, the best results were obtained with conformations from the simulation of Sm1 without ANP in the active site. For CD39’s simulations, none of the ligands were docked within the cavity of alternative site. With regard to praziquantel, the best results were observed in the active site of Sm1 and CD39. It is possible to conclude that the alternative site of Sm1 is a region which can be used for docking of possible inhibitors of this enzyme.