Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_M.pdf: 4387966 bytes, checksum: 19da59ac17254dba0a8949838880eefc (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra / Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated. The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type. DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:02:01Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_dr_botfm.pdf: 1064227 bytes, checksum: 6970ff58c4a9d38097a4690dd21b1c4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... / The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher’s interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034_20171203.pdf: 153851 bytes, checksum: 30ebdc494e0c9267585653b781683912 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-12-08T12:00:13Z: 000865034_20171203.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-12-08T12:01:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034.pdf: 1774770 bytes, checksum: cbbb1c1e9d8ae900c12fb9153a166e2e (MD5) / A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic

Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Coorientador: Teresa Cristina Goulart de Oliveira-Sequeira / Banca: Silvana Torossian Coradi / Banca: Clélia Akiko Hiruma Lima / Banca: Sérgio de Albuquerque / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher's interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / Abstract: From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic / Mestre

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-23T13:40:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_M.pdf: 3586687 bytes, checksum: c237f07c98d63bb8fea1e7e5a22bb2b4 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A aprotinina é um inibidor de proteases presente em alguns órgãos bovinos como pâncreas, fígado e pulmão. Neste trabalho, as enzimas tripsina e quimotripsina (suínas e bovinas) foram utilizadas como ligantes imobilizados em matriz de agarose visando a recuperação de aprotinina presente em efluente de processamento industrial de insulina através de adsorção por afInidade. As quatro enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com bisoxirana e avaliadas quanto a capacidade de adsorção de aprotinina pura, o que permitiu a seleção da tripsina suína e quimotripsina bovina como os ligantes de maior efIciência. Estas proteases foram ainda imobilizadas com sucesso em gel de agarose previamente ativado com brometo de cianogênio, o que permitiu a comparação entre dois métodos distintos de ativação e imobilização de enzimas. O gel de agarose ativado com brometo de cianogênio com tripsina suína imobilizada foi o que apresentou maior capacidade de adsorção de aprotinina pura (12,6 mg!g). Estudo-se, para ambas as enzimas, a influência do pH e força iônica na adsorção e dessorção da aprotinina, em faixas próximas aos valores encontrados na literatura, através de planejamento estatístico experimental. A influência do pH mostrou ser menor para o processo de adsorção e maior para a dessorção, ocorrendo o inverso para a influência da força iônica, principalmente quando o ligante utilizado foi a tripsina. Estudos de adsorção em coluna de leito fIxo para recuperação do inibidor presente em efluente do processamento industrial da insulina produzida a partir de pâncreas bovino constataram a presença de inibição que pôde ser recuperada utilizando ambas as enzimas como ligantes. A análise do poder de inibição de tripsina e quimotripsina, bem como os ensaios de eletroforese das frações dessorvidas das colunas indicam fortemente que o inibidor recuperado é aprotinina / Abstract: Aprotinin is a protease inhibitor found in bovine organs like pancreas, lung and liver. In this work, trypsin and chymotrypsin (bovine and swine) were immobilized in agarose and used as ligands for aprotinin recovery from industrial insulin process wastewater via affinity adsorption. The enzymes were immobilized on bisoxirane activated agarose and evaluated by their aprotinin adsorption capacity. Swine trypsin and bovine chymotrypsin were chosen as the most efficient ligands. These proteases were also immobilized on cianogen bromide activated agarose allowing the comparison of the two activation methods. Swine trypsin immobilized on cianogen bromide activated agarose had the highest aprotinin adsorption capacity (12,6 mglg). The effects of pH and ionic strength on aprotinin adsorption and desorption for immobilized swine trypsin and bovine chymotrypsin were studied using a experimental design method. The effect of the ionic strength was higher than that of the pH on aprotinin adsorption. The effect of pH was the most significant on the aprotinin desorption. Fixed bed adsorption studies with insulin process wastewater showed that inhibition could be recovered using both enzymes as ligands. Analysis of trypsin and chymotrypsin inhibition and electrophoresis assay of chromatographic fractions strongly suggested that the inhibitor recovered is aprotinin / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:48:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) Previous issue date: 2002-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente. / The identification and characterization of proteases from insects midgut are important in developing cultivars resistant to insect attack. In this study, proteolytic activities in the larval midgut of A. gemmatalis were investigated. Enzymatic extracts were obtained after frozen-and-thawed several times and centrifugation of the midgtus homogenate at 100,000 g, and the resulting supernatant (Fraction I) used as source of soluble proteins. As part of our studies involving the identification of proteases from midgut larvae of A. gemmatalis, the presence of the membrane-bound enzymes was evaluated. For this purpose, the pellet from midgut homogenates centrifuged at 100,000 g. was resuspended in buffer with Triton X-100, centrifuged as before and the supernatant (Fraction II), used as a source of membrane-bound proteases. Fraction I was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Using L-BApNA as substrate, Fraction I activity was investigated in the presence of several protease inhibitors. Thus, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidine and aprotinin, were all able to inhibit Fraction I activity, with greater inhibition observed with TLCK and benzamidine. According with these results, we conclude that the midgut larvae of A. gemmatalis have a trypsin-like serine protease. In order to further characterize the trypsin-like activities, the optimal activity for Fraction I was determined. The optimal pH was 8.5 and the optimal temperature was 35 o C, toward L-BApNA. Optimum pH and temperature were 8.0 and 30 o C, toward TAME. The effect of calcium on Fraction I activity was investigated using L-BApNA as substrate. The maximum activity was obtained at 20 mM calcium concentration. K Mapp values for L- BApNA and TAME were 0.32mM and 52.5μM, respectively. Fraction II was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Also, the effect of several proteases inhibitors were evaluated, using L-BApNA as substrate. EDTA, PMSF, TLCK, Benzamidine and Aprotinin were able to inhibit Fraction II activity, with TLCK and benzamidine exhibiting stronger inhibition. These results showed that the midgut larvae of A. gemmatalis have a membrane-bound trypsin-like protease. These trypsin-like activities were further characterized. Optimum of pH for Fraction II activity using L-BApNA and TAME were 8.5 and 8.0, respectively. Optimal activity was exhibited at 50 o C toward L- BApNA and TAME. At 20 mM calcium concentration, Fraction II showed the highest activity toward L-BApNA. K Mapp values for L-BApNA and TAME were 0.23mM and 95.4 μM, respectively. / Dissertação importada do Alexandria

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_M.pdf: 764391 bytes, checksum: 2ea9b8ea9a806b452272ef5f3e45ba17 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividades / Abstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activities / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Paula Rahal / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Nelson José Freitas da Silveira / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Osmar Gaspar / Resumo: A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / Abstract: The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus / Doutor