Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T22:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizeto_Luciana_M.pdf: 1491855 bytes, checksum: f428d0df16b92e28a1011622265135ee (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Neste trabalho, investigamos o efeito de calicreínas tissulares e plasmática sobre a permeabilidade vascular em pele de coelhos in vivo. A seguir, investigamos o efeito de dez novos inibidores de calicreína tissular sobre o aumento de permeabilidade vascular induzido por calicreínas tissulares. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer foi também usado como agente edematogênico em virtude da capacidade do mesmo de aumentar a permeabilidade vascular em coelhos por um mecanismo dependente da ativação do sistema de calicreína tissular. Nossos resultados mostraram que calicreínas tissulares, tais como a calicreína pancreática de porco (CPP; 0.1 1l9/sítio) e a calicreína urinária de coelho (10 119/sítio) induzem extravazamento significante de proteínas plasmáticas quando administradas na presença do vasodilatador prostaglandina E1 (PGE1). Ao contrário, a calicreína plasmática de coelho não causou extravazamento de proteínas, mesmo na presença de PGE1...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: In this study we have investigated the effect of novel tissue kallikreins on the plasma protein exudation induced by eitheR porcine pancreas kallikrein (PPK) or Phoneutria nigriventer spider venon in the rabbit skin in vivo. The tissue kallikrein inhibitors here described were synthetised based on analogues of peptide substrates for tissue kallikreins. The intradermal injection of PPK and rabbit urinary kallikrein, but not of rabbit plasma kallikrein, significantly increased the microvascular permeability leading to local oedema formation in the rabbit skin...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Benedito Oliveira Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:16:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rego_EvandroJoseLima_M.pdf: 2167106 bytes, checksum: 6b5b4442c07aa7a3e5bf6b9480c2a233 (MD5) Previous issue date: 1995 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Gilberto de Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T10:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bento_AntonioCarlos_D.pdf: 5486208 bytes, checksum: 86e0d68eb8dc5a8d1275f317cfca657e (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Nesta tese, caracterizamos bioquímica e farmacologicamente três polipeptídeos do veneno da aranha Phoneutria nigriventer. Após o fracionamento parcial do veneno através da filtração em gel de Sephadex G-1 O e cromatografia de troca iônica, obtivemos oito frações com atividade espasmogênica em tecidos arteriais e venosos de coelho e uma fração com atividade edematogênica em pele de coelho. Duas das frações com atividade sobre o músculo liso vascular foram selecionadas para purificação em HPLC e caracterização bioquímica através de eletroforese, determinação da composição de aminoácidos e seqüenciamento da região N-terminal dos polipeptídeos, denominados PNV1 e PNV2. A fração com atividade edematogênica em pele de coelho foi também purificada e o polipeptídeo responsável por esta atividade caracterizado bioquimicamente e denominado PNV3. A atividade espasmogênica do PNV1, PNV2 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada num sistema de cascata. Os coelhos anestesiados, foram exsanguinados e os vasos sanguíneos (artéria pulmonar e veias cava e mesentérica) foram removidos, cortados em espiral e montados para registro isotônico das contrações. O PNV1, PNV2 e as frações obtidas após purificação por HPLC foram liofilizadas, ressuspendidas em H2O deionizada e injetadas na forma de "bolus" sobre os tecidos. A atividade edematogênica do PNV3 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada em coelhos anestesiados e injetados com uma mistura de azul de Evans (0,5 ml/kg, 2,5%) e 1251-albumina (1,5 µCi/kg). As substâncias testadas foram injetadas intradermicamente no dorso dos animais. Após 30 minutos, foi coletado o sangue e o animal sacrificado. A pele dorsal foi removida e os sítios cortados para contagem de radioatividade acumulada. O PNV1, PNV2 e PNV3 possuem massa molecular de 13,9 kDa, 12,1 kDa e 14,5 kDa, com 125, 102 e 132 resíduos, respectivamente. A seqüência N-terminal para os três polipeptídeos foi a seguinte: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET e AVFAIQDQPC, respectivamente. A purificação e caracterização bioquímica destes peptídeos se constitui em ferramentas úteis não apenas para uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos decorrentes do envenenamento humano por Phoneutria nigriventer mas também para a compreensão do papel do sistema calicreína tissular-cininogênio cinina, tendo em vista que nossos resultado sugerem fortemente que o PNV3 é capaz de ativar este sistema / Abstract: This thesis describes the biochemical and pharmacological characterization of three polypeptides from the venom of the spider Phoneutria nigriventer. The fractionation of Phoneutria nigriventer venom by gel filtration on Sephadex G-10-120 provided eight peaks (SI to S-VIII) of which only the first (S-I) was investigated further. lonexchange chromatography of S-I on CM-cellulose-52 yielded 16 fractions (C-I to C-XVI). Of these, Fractions C-VII + VIII and C-X +XI were further purified by reverse phase HPLC to yield two polypeptides (PNV1 and PNV2) with contractile activity. Similar purification of Fraction C-XIII by HPLC resulted in the isolation of the polypeptide with oedematogenic activity (PNV3). Ali three proteins were single chain polypeptides (as shown by SDS-PAGE under reducing conditions) with global amino acid compositions (excluding Trp) of 125, 102 and 132 residues corresponding to molecular weights of 13,900, 12,100 and 14,500 for PNV1, PNV2 and PNV3, respectively. The N-terminal amino acid sequencesof PNV1, PNV2 and PNV3 were: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET, and AVFAIQDQPC. The contractile activity of PNV1 and PNV2 was examined using rabbit arterial and venous vessels. The vessels were mounted in a cascade system and perfused with warm (37°C) and oxygenated (95% O2 + 5% CO2 Krebs' solution. Since the spasmogenic effect of whole Phoneutria nigriventer venom in rabbit vascular smooth muscle is not affected by tetrodotoxin, it is unlikely that sodium channel activation plays a role in these tissues, as it does in both rat phrenic-diaphragm muscle-nerve preparation and guinea-pig isolated atria. Furthermore, the finding that the a-adrenoceptor antagonist phenoxybenzamine does not affect PNV-induced contractions excludes the possibility that Phoneutria nígríventer venom induces endogenous noradrenaline release from autonomic nerve endings present in the vascular walls, as occurs in guinea pig auricles. Phoneutría envenomation is mainly characterized by severe local pain, but it may be accompanied by vascular disturbances such as lung oedema and priapism. Whether these peptides with vascular smooth muscle spasmogenic activity are responsible for the mentioned permeability alterations, it remains to be further investigated. The oedema formation induced by PNV3 was investigated in rabbit skin as the local accumulation of 1251-human serum albumin. Our results showed that PNV3 significantly increased the vascular permeability in the rabbit skin. The increased microvascular permeability induced by whole Phoneutría nígríventer venom in rabbit skin involves local kinin synthesis in response to the activation of tissue (but not plasma) kallikrein-kininogen-kinin system. The biochemical identification of the peptide responsible for this activity in Phoneutría venom might provide a useful tool to further understand the role of tissue kallikrein-kinin system / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Krauchenko_Sandra_D.pdf: 16409460 bytes, checksum: de77214db0609d7859cd4a199cf747a6 (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_M.pdf: 4387966 bytes, checksum: 19da59ac17254dba0a8949838880eefc (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra / Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated. The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type. DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T10:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_RodrigoAlvaroBrandaoLopes_M.pdf: 956127 bytes, checksum: 79ba90f4a57e003faa26b44d93e90c3f (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: O veneno de Phoneutría nígríventer causa formação de edema local em pele de coelho por um mecanismo que envolve a ativação do sistema de calicreína tissular. O veneno de Phoneutría nígríventer produz ainda ereções prolongadas em cães, coelhos, ratos e no homem. Visto que a calicreína tissular está envolvida no sistema reprodutor masculino, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do veneno de Phoneutría nígríventer sobre corpo cavernoso isolado de coelhos. Coelhos "New Zealand", machos, adultos (2-3 Kg) foram, anestesiados e exsanguinados Os pênis dos coelhos foram então retirados e os corpos cavernosos isolados e perfundidos em cascata (Vane, 1964). O veneno de Phoneutría nígríventer e demais agonistas foram administrados na forma de bolus; os antagonistas ou inibidores foram administrados continuamente por infusão. Veneno de Phoneutría nígríventer (3-1 00 µg), acetilcolina (0.1-100 nmol), bradicinina (1-3 nmol) e calicreína de pâncreas de porco (3-30 µg) induziram relaxamentos dose-dependentes da musculatura lisa cavernosa. O inibidor da síntese de EDRF N µ-nitro L- arginina metil ester (10 µM), mas não seu enantiômero D-NAME (10 µM), aboliu completamente os relaxamentos induzidos pela acetilcolina, bradicinina e Veneno de Phoneutría nígríventer sem afetar o relaxamento induzido pelo gliceriltrinitrato. O efeito inibitório do L-NAME foi parcialmente revertido pela infusão de L-Arginina (300 µM), mas não de D-Arginina (300 µM). O inibidor de protease aprotinina (10 µg/ml), conhecido por inibir a síntese de bradicinina, aboliu os relaxamentos da musculatura lisa cavernosa induzidos pelo veneno de Phoneutría nígríventer e calicreína tissular. O inibidor de cininase, II captopril (1-1 µM), potenciou os relaxamentos induzidos pelo Veneno de Phoneutría nígríventer, bradicinina e calicreína tissular. O inibidor de calicreína tissular Pro-Phe-Aph-Ser-Val-Gln-NH2 (KIZD-06, 1.3 µM) inibiu significativamente o relaxamento da musculatura lisa cavernosa induzido pelo veneno de Phoneutria nigriventer sem afetar aqueles induzidos por GTN e ACh. O inibidor de calicreína plasmática obtido do feijão de soja (soybean trypsin inhibitor; 10 µg/ml) não afetou os relaxamentos da musculatura lisa cavernosa inuzidos pelo veneno de Phoneutria nigriventer, bradicinina, acetilcolina ou calicreína. O antagonista de receptores B2 de bradicinina, HOE-140 (50nM) aboliu completamente os relaxamentos induzidos pelo veneno de Phoneutria nigriventer e bradicinina. Nossos resultados demonstram que o veneno de Phoneutria nigriventer ativa o sistema de calicreína tecidual levando à formação local de cininas e consequente liberação de EDRF (óxido nítrico) na musculatura lisa cavernosa de coelhos / Abstract: The roles of the tissue kallikrein-kinin system and nitric oxide (NO) release in Phoneutria nigriventer venom-induced relaxations of rabbit corpus cavernosum (RbCC) smooth muscle have been investigated using a bioassay cascade. Phoneutria nigriventer venom (10-30 µg), porcine pancreatic kallikrein (100 mU), rabbit urinary kallikrein (10 mU), bradykinin (BK, 0.3-3 nmol), acetylcholine (ACh, 0.3-30 nmol) and glyceryl trinitrate (GTN, 0.5-10 nmol) caused relaxations of the RbCC strips. Captopril (1 µ.M) substantially potentiated Phoneutria nigriventer venom- and BK-induced RbCC relaxations without affecting those elicited by GTN. The bradykinin B2 receptor antagonist Hoe 140 (D-Arg-[Hyp3,Thi5,Dtic7,Oic8]-BK, 50 nM), aprotinin (10 µg ml-1) and the tissue kallikrein inhibitor Pro-Phe-Aph-5er-Val-Gln-NH2 (KIZD-06, 1.3 µM) significantly inhibited Phoneutria nigriventer venom-induced RbCC relaxations, without affecting those provoked by GTN and ACh. The B1 receptor antagonist [Leu9]des Arg10BK (0.5 µM) and soybean trypsin inhibitor (SBTI, 10 µg ml-1) had no effect on Phoneutria nigriventer venom-induced RbCC relaxations. The relaxations induced by Phoneutria nigriventer venom, porcine pancreas kallikrein, BK and ACh were significantly inhibited by N µ-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 10 µM) but not by D-NAME (10 µM). L-NAME did not affect GTN-induced relaxations. L-arginine (300 µM), but not D-arginine (300 µM), significantly reversed the inhibitory effect of L-NAME. Our results indicate that Phoneutria nigriventer venom activates the tissue kallikrein-kininogen-kinin system in RbCC strips leading to NO release and suggest a functional role for this system in penile erection / Mestrado / Mestre em Farmacologia

O sistema calicreína-cinina (SCC) é reconhecido por desempenhar funções que envolvem a manutenção da homeostase do sistema cardiovascular. Novas vias de sinalização intracelulares tem sido propostas devido a ativação desencadeada pelas cininas. O objetivo deste estudo foi avaliar os mecanismos moleculares implicados na sinalização dos receptores para cininas sob a função cardiovascular. Foram utilizados animais knockout dos receptores B1 (B1-/-) e B2 (B2-/-) para cininas. Avaliamos a função contrátil cardíaca e vascular, assim como, medimos em ambos tecidos, coração e aorta torácica, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Para avaliar a expressão das enzimas antioxidantes e que sintetizam o óxido nítrico (NO) foram realizados experimentos de western blot, em coração, para detecção e quantificação destas enzimas, assim como, de estruturas relacionadas com a homeostase do cálcio intracelular. Identificamos redução na tensão sistólica cardíaca (B1-/-: 53% e B2-/-: 52%), entretanto, não foram identificadas alterações na tensão diastólica e frequência cardíaca, pela técnica de Langendorff. Propusemos, a participação do SCC na regulação da função cardiovascular através de vias de sinalização intracelular que promovem a produção de ROS. Detectamos aumento na geração do peróxido de hidrogênio (H2O2, B1-/-: 75% e B2-/-: 54%), superóxido (O2 -, B1-/-: 40% e B2-/-: 41%), explicado pela redução na expressão de enzimas antioxidantes detectadas: superóxido dismutase (B1-/-: 32% e B2-/-: 20%), catalase (B1-/-: 34% e B2-/-: 39%) e glutationa peroxidase (B1-/-: 29% e B2-/-: 25%). Adicionalmente, verificamos aumento na produção do NO (B1-/-: 75% e B2-/-: 36%) e sugerimos que o aumento da expressão das óxido nítrico sintases constitutivas (eNOS: B1-/-: 20% e B2-/-: 23% e nNOS: B1-/-: 27% e B2-/-: 30%) e atividades das mesmas (peNOSSer1177: B1-/-: 161% e B2-/-: 154%; peNOSThr495: B1-/-: 43% e B2-/-: 45%; pnNOSSer852: B1-/-: 25% e B2-/-: 26%) sejam os mecanismos envolvidos. Em conjunto, os resultados descritos, indicam o desenvolvimento do estresse oxidativo em cardiomiócitos de animais B1-/- e B2-/-, e que, possivelmente, este estado, causaria o comprometimento na função sistólica cardíaca através de oxidações e/ou nitrosilações das proteínas envolvidas na remoção citosólica do Ca2+ ou, ainda, repercutiria na redução da expressão da SERCA2a (B1-/-: 41% e B2-/-: 46%) e aumento na expressão do NCX (B1-/-: 16% e B2-/-: 22%). Encontramos elevada resistência coronariana nos grupos B1-/- (38%) e B2-/- (38%) e, sugerimos, que a disfunção endotelial seja a principal causa dessa alteração. Confirmamos esta hipótese através de experimentos de reatividade vascular, onde foi demonstrado prejuízos nos mecanismos vasoconstritores (B1-/-: 66% e B2-/-: 266%) e vasodilatadores (B1-/-: 50% e B2-/-: 56%), e ainda, comprometimento da função da nNOS em aorta de animais dos grupos B1-/- e B2-/-. Verificamos que os receptores B1 ou B2 estão espontaneamente heterodimerizados com a nNOS e eNOS. Desta forma, propomos que a deleção dos receptores para cininas criam perturbações na atividade catalítica da nNOS favorecendo o estado de desacoplamento desta enzima e, consequentemente, comprometendo a biodisponibilidade do NO (B1-/-: 30% e B2-/-: 20%) e gerando exacerbada produção de H2O2 (B1-/-: 30% e B2-/-: 52%) e O2 - (B1-/-: 46% e B2-/-: 69%).