Doctor of Philosophy / Biochemistry and Molecular Biophysics Interdepartmental Program / Subbaratnam Muthukrishnan / In this study, I have used dsRNA-mediated down-regulation of transcripts/proteins of several potential targets in the model beetle, Tribolium castaneum to identify a molecular target of the “chitin inhibitor”, diflubenzuron (DFB). The elytron of the red flour beetle, T. castaneum, was chosen as the model tissue for studying the mode of action of DFB and its molecular target(s). We have standardized the protocol for topical administration of DFB on precisely aged prepupae to achieve the desired level of mortality (90-95%) on day 5 of the pharate adult stage. Exposure of prepupae to DFB at 1000 ppm results in a near complete loss of chitin in the newly forming adult procuticle of the elytron and the body wall. Global analysis of transcripts by RNA Seq was carried out to look for differential expression of several critical genes of cuticle assembly in these insects compared to mock-treated controls. Interestingly, genes directly involved in the biosynthetic pathway of chitin were not among those affected by DFB. However, immunolocalization studies have shown that several proteins of chitin metabolism including chitin synthase A, which is involved in the synthesis of cuticular chitin, are present in near normal amounts but are mislocalized in DFB-treated insects. Assays for chitin synthase using elytral extracts have indicated that the enzyme preparations from DFB-treated insects are catalytically inactive. By using RNA interference and competition studies with fluorescently-tagged glibenclamide (a sulfonylurea compound) or DFB, we have identified a long-sought molecular receptor of DFB as an ABCC class transporter. DFB-treatment and RNAi of a specific ABCC-type transporter gene lead to identical phenotypes including loss of chitin, loss of laminar architecture of the cuticle, and mislocalization of CHS from its normal plasma membrane location to intracellular locations presumably by affecting vesicular transport. Further, using an in vitro chitin synthesizing system consisting of microsomes prepared from elytral tissue, which exhibits all of the hallmarks of cuticular chitin-synthesizing epidermal cells including sensitivity to DFB, further insights into the mechanistic details of how this class of insecticides inhibits chitin synthesis have been obtained.

Three novel, synthetic biarylheterocycles bearing imidazole terminal groups had previously been discovered with high cytotoxicity (IC50 16¿640 nM) against a number of human tumour cell lines. Notably, this biological activity was independent of duplex DNA binding affinity. The compounds were tested in the NCI 60-cell line panel and COMPARE analysis suggests they have a novel mechanism of action, targeting the product of a ¿gene-like sequence¿ of unidentified function. The identity of likely protein targets was explored using a chemical proteomic strategy. Bespoke affinity matrices for chromatography were prepared in which test compounds were attached to a solid support through a biotin tag. A synthetic route to hit compounds containing a biotin moiety in place of one of the imidazole sidechains was developed. Chemosensitivity studies confirmed that the biotinylated compounds retained their activity showing IC50 = 6.25 ¿M in a susceptible cell line, compared with > 100 ¿M for an insensitive cell line. The biotinylated ligands were complexed to a streptavidin-activated affinity column and exposed to cell lysates from the susceptible cell lines. Bound proteins were eluted from the column and separated using SDS-PAGE. Proteins were characterised by MALDI MS and MS/MS and identified using Mascot database searches. Heterogeneous nuclear ribonuclear protein A2/B1 was found to selectively bind to the affinity probes. / Yorkshire Cancer Research, BMSS, School of Life Sciences and the Frank Hudson Memorial Fund

Three novel, synthetic biarylheterocycles bearing imidazole terminal groups had previously been discovered with high cytotoxicity (IC₅₀ 16-640 nM) against a number of human tumour cell lines. Notably, this biological activity was independent of duplex DNA binding affinity. The compounds were tested in the NCI 60-cell line panel and COMPARE analysis suggests they have a novel mechanism of action, targeting the product of a 'gene-like sequence' of unidentified function. The identity of likely protein targets was explored using a chemical proteomic strategy. Bespoke affinity matrices for chromatography were prepared in which test compounds were attached to a solid support through a biotin tag. A synthetic route to hit compounds containing a biotin moiety in place of one of the imidazole sidechains was developed. Chemosensitivity studies confirmed that the biotinylated compounds retained their activity showing IC₅₀ = 6.25 μM in a susceptible cell line, compared with > 100 μM for an insensitive cell line. The biotinylated ligands were complexed to a streptavidin-activated affinity column and exposed to cell lysates from the susceptible cell lines. Bound proteins were eluted from the column and separated using SDS-PAGE. Proteins were characterised by MALDI MS and MS/MS and identified using Mascot database searches. Heterogeneous nuclear ribonuclear protein A2/B1 was found to selectively bind to the affinity probes.

O Sarcoma de Ewing (ES) é um raro tumor de ossos e tecidos moles com uma característica translocação cromossomal, a fusão EWS/FLI-1, que atua sobre diversos processos oncogênicos. O desenvolvimento da resistência à quimioterapia é comum no tumor e continua como uma das principais causas na falha do tratamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de genes após a indução de resistência em linhagens celulares de ES. Foi selecionado um conjunto de genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 e SMARCB1) a partir da mineração da literatura em resistência tumoral para duas drogas utilizadas na terapia de ES, doxorrubicina e vincristina. Descrevemos a expressão de cada gene selecionado antes e após as linhagens SK-ES-1 serem submetidas a um protocolo de indução de resistência para ambos os fármacos, que obteve êxito ao induzir as células à resistência. A expressão relativa dos níveis de mRNA foi avaliada e foi encontrada em maior expressão para os genes SMARCA4, SMARCB1 e POLDIP2, e em menor expressão para os genes TUBA1A e CCAR1, quando comparadas às linhagens de controle não-resistentes de cada quimioterápico. Os resultados sugerem o envolvimento de mecanismos de reparo de dano ao DNA, remodelamento de cromatina via SWI/SNF, atividade de microtúbulos e atividade spliceossomal nos processos de resistência quimioterápica em ES. / Ewing Sarcoma (ES) is a rare bone and soft tissue tumor with a characteristic chromosomal translocation, the fusion protein EWS/FLI-1, that drives several oncogenic processes. The development of resistance to chemotherapy is common and remains as the main cause of treatment failure. The goal of this study was to evaluate the expression of selected genes in ES cell lines after induction of resistance. A set of genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 and SMARCB1) was data mined from tumoral resistance literature for two drugs used in ES therapy, doxorubicin and vincristine. We describe the expression of each selected gene before and after SK-ES-1 cell lines were exposed to a drug resistance inducing protocol for doxorubicin and vincristine. Cell lines were successfully induced to be resistant to doxorubicin and vincristine. The relative mRNA expression levels were upregulated for genes SMARCA4, SMARCB1 and POLDIP2 and downregulated for genes TUBA1A and CCAR1, when comparing resistant and non-resistant ES cell lines for each drug. The results suggest involvement of repair pathways, SWI/SNF chromatin remodeling, microtubule and spliceosomal activity processes in drug resistance mechanisms in ES.

O Sarcoma de Ewing (ES) é um raro tumor de ossos e tecidos moles com uma característica translocação cromossomal, a fusão EWS/FLI-1, que atua sobre diversos processos oncogênicos. O desenvolvimento da resistência à quimioterapia é comum no tumor e continua como uma das principais causas na falha do tratamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de genes após a indução de resistência em linhagens celulares de ES. Foi selecionado um conjunto de genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 e SMARCB1) a partir da mineração da literatura em resistência tumoral para duas drogas utilizadas na terapia de ES, doxorrubicina e vincristina. Descrevemos a expressão de cada gene selecionado antes e após as linhagens SK-ES-1 serem submetidas a um protocolo de indução de resistência para ambos os fármacos, que obteve êxito ao induzir as células à resistência. A expressão relativa dos níveis de mRNA foi avaliada e foi encontrada em maior expressão para os genes SMARCA4, SMARCB1 e POLDIP2, e em menor expressão para os genes TUBA1A e CCAR1, quando comparadas às linhagens de controle não-resistentes de cada quimioterápico. Os resultados sugerem o envolvimento de mecanismos de reparo de dano ao DNA, remodelamento de cromatina via SWI/SNF, atividade de microtúbulos e atividade spliceossomal nos processos de resistência quimioterápica em ES. / Ewing Sarcoma (ES) is a rare bone and soft tissue tumor with a characteristic chromosomal translocation, the fusion protein EWS/FLI-1, that drives several oncogenic processes. The development of resistance to chemotherapy is common and remains as the main cause of treatment failure. The goal of this study was to evaluate the expression of selected genes in ES cell lines after induction of resistance. A set of genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 and SMARCB1) was data mined from tumoral resistance literature for two drugs used in ES therapy, doxorubicin and vincristine. We describe the expression of each selected gene before and after SK-ES-1 cell lines were exposed to a drug resistance inducing protocol for doxorubicin and vincristine. Cell lines were successfully induced to be resistant to doxorubicin and vincristine. The relative mRNA expression levels were upregulated for genes SMARCA4, SMARCB1 and POLDIP2 and downregulated for genes TUBA1A and CCAR1, when comparing resistant and non-resistant ES cell lines for each drug. The results suggest involvement of repair pathways, SWI/SNF chromatin remodeling, microtubule and spliceosomal activity processes in drug resistance mechanisms in ES.

Quase 100 anos após a descoberta do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, não existem tratamentos efetivos para esta doença tanto em sua fase aguda quanto crônica. Neste trabalho é apresentado um estudo em grande escala das proteínas preditas a partir de seqüências genômicas de T. cruzi, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, visando investigar e discutir os seguintes aspectos: (i) quais seqüências podem ter suas estruturas tridimensionais (3D) geradas e qualificadas por técnicas de modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline; (ii) associar a estes modelos protéicos uma classificação enzimática (EC), através da ferramenta ECNGet (desenvolvida neste trabalho); (iii) através desta associação enzimática aos modelos, usá-los para inferir possíveis funções biológicas às suas seqüências alvos originalmente anotadas como hipotéticas, e/ou sugerir uma possível reanotação de seqüências; (iv) investigar dentre as enzimas com estruturas 3D geradas quais possuem similaridades (ortologias) com enzimas humanas (genoma de Homo sapiens); (v) determinar quais das enzimas identificadas fazem parte de alguma via metabólica representativa depositada em bancos de dados específicos. Dentre as enzimas de T. cruzi consideradas como alvos moleculares para o tratamento da doença de Chagas, as cisteíno proteases têm sido extensivamente estudadas experimentalmente. Neste presente estudo, as isoformas 1 e 2 da cruzipaína foram investigadas por simulações de dinâmica molecular (DM), nas temperaturas de 25C e 37C, tendo como controle a papaína, enzima representativa da família C1 de cisteíno proteases. Analisando 20.679 seqüências protéicas preditas a partir de CDS (Seqüência Codificante) não redundantes do genoma de T. cruzi (cepa CL Brener), 4.719 seqüências foram associadas a proteínas de membrana e foram gerados 2.786 modelos estruturais protéicos. Destes modelos, 1.888 foram associados a um EC, dos quais aproximadamente 79,5% foram classificados como tendo uma qualidade suficientemente boa para serem usados em estudos de desenho racional de fármacos baseado em estrutura, através de métodos de modelagem molecular. Dos 1.876 modelos enzimáticos com, pelo menos, uma sub-subclasse enzimática, foram identificadas 99 seqüências possivelmente análogas a enzimas humanas, 1.776 como similares e 1 bifuncional como análoga/similar. Também foi possível detectar um subgrupo de 10 modelos considerados como prováveis enzimas específicas de T. cruzi em relação a H. sapiens, não descartando possíveis relações destas seqüências com outros organismos. Nos estudos de DM realizados, o principal resultado obtido indica que a presença de resíduos ácidos na posição 158 (numeração da papaína) no sítio catalítico, pode induzir uma reorganização estrutural, suscetível a variações de temperatura, dos resíduos catalíticos em cisteíno proteases da família da papaína. Esta reorganização estrutural gera uma conformação semelhante à apresentada pela tríade catalítica (ASP/HIS/SER) em serino proteases.

O Sarcoma de Ewing (ES) é um raro tumor de ossos e tecidos moles com uma característica translocação cromossomal, a fusão EWS/FLI-1, que atua sobre diversos processos oncogênicos. O desenvolvimento da resistência à quimioterapia é comum no tumor e continua como uma das principais causas na falha do tratamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de genes após a indução de resistência em linhagens celulares de ES. Foi selecionado um conjunto de genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 e SMARCB1) a partir da mineração da literatura em resistência tumoral para duas drogas utilizadas na terapia de ES, doxorrubicina e vincristina. Descrevemos a expressão de cada gene selecionado antes e após as linhagens SK-ES-1 serem submetidas a um protocolo de indução de resistência para ambos os fármacos, que obteve êxito ao induzir as células à resistência. A expressão relativa dos níveis de mRNA foi avaliada e foi encontrada em maior expressão para os genes SMARCA4, SMARCB1 e POLDIP2, e em menor expressão para os genes TUBA1A e CCAR1, quando comparadas às linhagens de controle não-resistentes de cada quimioterápico. Os resultados sugerem o envolvimento de mecanismos de reparo de dano ao DNA, remodelamento de cromatina via SWI/SNF, atividade de microtúbulos e atividade spliceossomal nos processos de resistência quimioterápica em ES. / Ewing Sarcoma (ES) is a rare bone and soft tissue tumor with a characteristic chromosomal translocation, the fusion protein EWS/FLI-1, that drives several oncogenic processes. The development of resistance to chemotherapy is common and remains as the main cause of treatment failure. The goal of this study was to evaluate the expression of selected genes in ES cell lines after induction of resistance. A set of genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 and SMARCB1) was data mined from tumoral resistance literature for two drugs used in ES therapy, doxorubicin and vincristine. We describe the expression of each selected gene before and after SK-ES-1 cell lines were exposed to a drug resistance inducing protocol for doxorubicin and vincristine. Cell lines were successfully induced to be resistant to doxorubicin and vincristine. The relative mRNA expression levels were upregulated for genes SMARCA4, SMARCB1 and POLDIP2 and downregulated for genes TUBA1A and CCAR1, when comparing resistant and non-resistant ES cell lines for each drug. The results suggest involvement of repair pathways, SWI/SNF chromatin remodeling, microtubule and spliceosomal activity processes in drug resistance mechanisms in ES.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao Priscila Capriles.pdf: 11456267 bytes, checksum: 5add21ce6ff9ebf894b553efdf4c5125 (MD5) Previous issue date: 2007-03-15 / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quase 100 anos após a descoberta do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, não existem tratamentos efetivos para esta doença tanto em sua fase aguda quanto crônica. Neste trabalho é apresentado um estudo em grande escala das proteínas preditas a partir de seqüências genômicas de T. cruzi, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, visando investigar e discutir os seguintes aspectos: (i) quais seqüências podem ter suas estruturas tridimensionais (3D) geradas e qualificadas por técnicas de modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline; (ii) associar a estes modelos protéicos uma classificação enzimática (EC), através da ferramenta ECNGet (desenvolvida neste trabalho); (iii) através desta associação enzimática aos modelos, usá-los para inferir possíveis funções biológicas às suas seqüências alvos originalmente anotadas como hipotéticas, e/ou sugerir uma possível reanotação de seqüências; (iv) investigar dentre as enzimas com estruturas 3D geradas quais possuem similaridades (ortologias) com enzimas humanas (genoma de Homo sapiens); (v) determinar quais das enzimas identificadas fazem parte de alguma via metabólica representativa depositada em bancos de dados específicos. Dentre as enzimas de T. cruzi consideradas como alvos moleculares para o tratamento da doença de Chagas, as cisteíno proteases têm sido extensivamente estudadas experimentalmente. Neste presente estudo, as isoformas 1 e 2 da cruzipaína foram investigadas por simulações de dinâmica molecular (DM), nas temperaturas de 25°C e 37°C, tendo como controle a papaína, enzima representativa da família C1 de cisteíno proteases. Analisando 20.679 seqüências protéicas preditas a partir de CDS (Seqüência Codificante) não redundantes do genoma de T. cruzi (cepa CL Brener), 4.719 seqüências foram associadas a proteínas de membrana e foram gerados 2.786 modelos estruturais protéicos. Destes modelos, 1.888 foram associados a um EC, dos quais aproximadamente 79,5% foram classificados como tendo uma qualidade suficientemente boa para serem usados em estudos de desenho racional de fármacos baseado em estrutura, através de métodos de modelagem molecular. Dos 1.876 modelos enzimáticos com, pelo menos, uma sub-subclasse enzimática, foram identificadas 99 seqüências possivelmente análogas a enzimas humanas, 1.776 como similares e 1 bifuncional como análoga/similar. Também foi possível detectar um subgrupo de 10 modelos considerados como prováveis enzimas específicas de T. cruzi em relação a H. sapiens, não descartando possíveis relações destas seqüências com outros organismos. Nos estudos de DM realizados, o principal resultado obtido indica que a presença de resíduos ácidos na posição 158 (numeração da papaína) no sítio catalítico, pode induzir uma reorganização estrutural, suscetível a variações de temperatura, dos resíduos catalíticos em cisteíno proteases da família da papaína. Esta reorganização estrutural gera uma conformação semelhante à apresentada pela tríade catalítica (ASP/HIS/SER) em serino proteases.