Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438254-Texto+Completo-0.pdf: 475511 bytes, checksum: 55b686575a0c7ed0d039db86576374f6 (MD5) Previous issue date: 2012 / Ewing´s sarcoma is a highly aggressive tumor of bone and soft tissues. It affects mainly children and young adults. In about 88% to 95% there is the occurrence of a translocation between the EWS gene (22q12 locus) and two members of ETS transcription factors family: FLI1 (11q24 locus) or ERG (21q22). The most common translocation involves gene EWS and FLI1. This translocation leads to the formation of EWS/FLI1chimeric aberrant transcription factor. The EWS/FLI1 regulates the NR0B1 gene promoter through a direct binding to GGAA microsatellites sequences. Our objective was to identify and describe the molecular structure of GGAA motifs in NR0B1 promoter in unrelated Ewing's Sarcoma patients and healthy subjects from South Brazilian population. Were identified 21 different alleles in the 224 subjects. All alleles had at least 4 to 5 consecutive GGAA motifs. The 24. 2, corresponding to (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10 sequence, was the most frequent in our population, being present in 50. 4% of subjects. Allele 24. 2 could be associated to Ewing's sarcoma development since it was significantly more frequent among patients. Differences in the global configuration of NR0B1 promoter GGAA microsatellites (size, sequence, amount and position of GGAA repeats and single 'A' base insertions) could result in differences in Ewing's sarcoma susceptibility. These results would provide insights for the understanding of tumorigenesis. / O sarcoma de Ewing é um tumor altamente agressivo que afeta ossos e tecidos moles. Ele acomete principalmente crianças e adultos jovens. Em torno de 88% a 95% dos casos verifica-se a ocorrência de uma translocação entre o gene EWS (lócus 22q12) e dois membros da família do fator de transcrição ETS: o FLI1 (11q24) ou o ERG (21q22). A translocação mais frequente envolve os genes EWS e FLI1. Esta translocação leva à formação do fator de transcrição quimérico aberrante EWS/FLI1. O fator EWS/FLI1 regula o promotor do gene NR0B1 através de uma ligação direta a sequências de microssatélites GGAA. Nosso objetivo foi identificar e descrever a estrutura molecular de motivos GGAA no promotor de NR0B1 em pacientes com Sarcoma de Ewing não relacionados e não afetados da população sul brasileira. Foram identificados 21 alelos diferentes em 224 indivíduos estudados. Todos os alelos tiveram, pelo menos, de 4 a 5 motivos consecutivos GGAA. O alelo 24. 2, correspondente a sequência (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10, foi o mais freqüente em nossa população, estando presente em 50,4% de todos os indivíduos. O alelo 24. 2 pode estar associado ao desenvolvimento do Sarcoma de Ewing, dado que sua frequência foi significativamente mais alta entre afetados. Diferenças na configuração global dos microssatélites GGAA no promotor de NR0B1 (em relação à tamanho, sequência, quantidade e posição das repetições GGAA e inserções de base única ‘A’) podem resultar em diferente susceptibilidade ao sarcoma de Ewing. Tais resultados poderão fornecer subsídios para uma melhor compreensão da tumorigênese.

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular. / The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.

O sarcoma de Ewing é uma neoplasia maligna agressiva que acomete ossos e tecidos moles com maior frequência em crianças e adolescentes. O tratamento consta de quimioterapia de indução, seguida pelo controle local da doença (cirurgia, cirurgia associada à radioterapia, ou apenas radioterapia), e quimioterapia de consolidação. A introdução da quimioterapia possibilitou aumento significativo na sobrevida dos pacientes nas últimas décadas. Por outro lado, o impacto da modalidade de controle local ainda não está bem estabelecido. Estudos observacionais têm demonstrado superioridade do tratamento cirúrgico em relação à radioterapia isolada, no entanto, são limitados os estudos prospectivos que confirmam esta diferença. O objetivo deste estudo é avaliar o impacto da modalidade de tratamento local nos desfechos oncológicos, bem como descrever o perfil clínico-epidemiológico de portadores de sarcoma de Ewing ósseo não-metastático. Os dados foram coletados em 15 instituições no período entre 2003 e 2010 e fazem parte do primeiro estudo do Grupo Colaborativo Brasileiro para Tratamento dos Tumores da Família Ewing (EWING I). Dos 73 pacientes incluídos, 47 foram tratados com cirurgia isolada, 13 receberam cirurgia associada à radioterapia, e 13 apenas radioterapia. O seguimento médio foi de 4,5 anos (2,3 até 6,7 anos) e a sobrevida geral e livre de eventos foi de 63,3 e 62,1 por cento em 5 anos, respectivamente. A falha do tratamento local foi de 0 (zero) por cento para a modalidade de cirurgia associada à radioterapia, 6,5 por cento para cirurgia isolada, e 10 por cento para radioterapia (p=0,5). A sobrevida dos pacientes submetidos à radioterapia isolada foi significativamente inferior à sobrevida dos tratados com cirurgia e com cirurgia associada a radioterapia (30,8 versus 71,7 versus 64,1 por cento, respectivamente). Concluiu-se que não houve diferença em termos de falha local de acordo com a modalidade de tratamento empregada, no entanto houve diferença significativa em termos de sobrevida. Apesar dos resultados cirúrgicos superiores, a radioterapia isolada ainda apresenta papel fundamental no tratamento de casos selecionados. / Ewing sarcoma is a small round cell malignancy of bone and soft tissue that usually occurs in children and adolescents. Current treatment includes induction chemotherapy, local control of the primary tumor (surgery, surgery plus radiotherapy, or radiotherapy) and consolidation chemotherapy. The introduction of chemotherapy has improved significantly the oncologic outcomes in Ewing sarcoma. On the other hand, the impact of the local control modality has not been established. Surgery alone or in combination with radiation has traditionally been considered a good choice for resectable ES, while unresectable tumors have been treated with definitive radiotherapy. Despite the results from a few trials and observational studies, there is no consistent knowledge about the local control modality in ES outcomes. The present study aims to evaluate the impact of the local control modality in the oncologic outcomes, as well as to describe the clinical features of the patients with localized Ewing sarcoma of the bone. The data were collected between 2003 and 2010 in 15 hospitals and were part of the first Brazilian Collaborative Group for the Treatment of the Ewing Sarcoma Family Tumors (EWING 1). From 73 patients (median age 12.8 years old), 47 were treated with surgery, 13 with surgery plus radiotherapy, and 13 with definitive radiotherapy. Median follow up was 4.5 years (2.3 to 6.7 years) and the overall and event-free survival 63.3 and 62.1 percent in 5 years, respectively. The local control failure was 0 percent for surgery plus radiotherapy, 6.5 percent for surgery, and 10 percent for radiotherapy (p=.5). The survival of the patients treated with radiotherapy was significantly worse than those treated with surgery and surgery plus radiotherapy (30.8 versus 71.7 versus 64.1 percent, respectively). In conclusion, there was no significant difference in local failure according to the modality of treatment, but there was significant difference in survival rates. Despite the better outcomes in individuals treated with surgery, the radiotherapy modality has still an important role in selected patients.

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular. / The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.

O sarcoma de Ewing é uma neoplasia maligna agressiva que acomete ossos e tecidos moles com maior frequência em crianças e adolescentes. O tratamento consta de quimioterapia de indução, seguida pelo controle local da doença (cirurgia, cirurgia associada à radioterapia, ou apenas radioterapia), e quimioterapia de consolidação. A introdução da quimioterapia possibilitou aumento significativo na sobrevida dos pacientes nas últimas décadas. Por outro lado, o impacto da modalidade de controle local ainda não está bem estabelecido. Estudos observacionais têm demonstrado superioridade do tratamento cirúrgico em relação à radioterapia isolada, no entanto, são limitados os estudos prospectivos que confirmam esta diferença. O objetivo deste estudo é avaliar o impacto da modalidade de tratamento local nos desfechos oncológicos, bem como descrever o perfil clínico-epidemiológico de portadores de sarcoma de Ewing ósseo não-metastático. Os dados foram coletados em 15 instituições no período entre 2003 e 2010 e fazem parte do primeiro estudo do Grupo Colaborativo Brasileiro para Tratamento dos Tumores da Família Ewing (EWING I). Dos 73 pacientes incluídos, 47 foram tratados com cirurgia isolada, 13 receberam cirurgia associada à radioterapia, e 13 apenas radioterapia. O seguimento médio foi de 4,5 anos (2,3 até 6,7 anos) e a sobrevida geral e livre de eventos foi de 63,3 e 62,1 por cento em 5 anos, respectivamente. A falha do tratamento local foi de 0 (zero) por cento para a modalidade de cirurgia associada à radioterapia, 6,5 por cento para cirurgia isolada, e 10 por cento para radioterapia (p=0,5). A sobrevida dos pacientes submetidos à radioterapia isolada foi significativamente inferior à sobrevida dos tratados com cirurgia e com cirurgia associada a radioterapia (30,8 versus 71,7 versus 64,1 por cento, respectivamente). Concluiu-se que não houve diferença em termos de falha local de acordo com a modalidade de tratamento empregada, no entanto houve diferença significativa em termos de sobrevida. Apesar dos resultados cirúrgicos superiores, a radioterapia isolada ainda apresenta papel fundamental no tratamento de casos selecionados. / Ewing sarcoma is a small round cell malignancy of bone and soft tissue that usually occurs in children and adolescents. Current treatment includes induction chemotherapy, local control of the primary tumor (surgery, surgery plus radiotherapy, or radiotherapy) and consolidation chemotherapy. The introduction of chemotherapy has improved significantly the oncologic outcomes in Ewing sarcoma. On the other hand, the impact of the local control modality has not been established. Surgery alone or in combination with radiation has traditionally been considered a good choice for resectable ES, while unresectable tumors have been treated with definitive radiotherapy. Despite the results from a few trials and observational studies, there is no consistent knowledge about the local control modality in ES outcomes. The present study aims to evaluate the impact of the local control modality in the oncologic outcomes, as well as to describe the clinical features of the patients with localized Ewing sarcoma of the bone. The data were collected between 2003 and 2010 in 15 hospitals and were part of the first Brazilian Collaborative Group for the Treatment of the Ewing Sarcoma Family Tumors (EWING 1). From 73 patients (median age 12.8 years old), 47 were treated with surgery, 13 with surgery plus radiotherapy, and 13 with definitive radiotherapy. Median follow up was 4.5 years (2.3 to 6.7 years) and the overall and event-free survival 63.3 and 62.1 percent in 5 years, respectively. The local control failure was 0 percent for surgery plus radiotherapy, 6.5 percent for surgery, and 10 percent for radiotherapy (p=.5). The survival of the patients treated with radiotherapy was significantly worse than those treated with surgery and surgery plus radiotherapy (30.8 versus 71.7 versus 64.1 percent, respectively). In conclusion, there was no significant difference in local failure according to the modality of treatment, but there was significant difference in survival rates. Despite the better outcomes in individuals treated with surgery, the radiotherapy modality has still an important role in selected patients.

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular. / The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.

O sarcoma de Ewing é uma neoplasia maligna agressiva que acomete ossos e tecidos moles com maior frequência em crianças e adolescentes. O tratamento consta de quimioterapia de indução, seguida pelo controle local da doença (cirurgia, cirurgia associada à radioterapia, ou apenas radioterapia), e quimioterapia de consolidação. A introdução da quimioterapia possibilitou aumento significativo na sobrevida dos pacientes nas últimas décadas. Por outro lado, o impacto da modalidade de controle local ainda não está bem estabelecido. Estudos observacionais têm demonstrado superioridade do tratamento cirúrgico em relação à radioterapia isolada, no entanto, são limitados os estudos prospectivos que confirmam esta diferença. O objetivo deste estudo é avaliar o impacto da modalidade de tratamento local nos desfechos oncológicos, bem como descrever o perfil clínico-epidemiológico de portadores de sarcoma de Ewing ósseo não-metastático. Os dados foram coletados em 15 instituições no período entre 2003 e 2010 e fazem parte do primeiro estudo do Grupo Colaborativo Brasileiro para Tratamento dos Tumores da Família Ewing (EWING I). Dos 73 pacientes incluídos, 47 foram tratados com cirurgia isolada, 13 receberam cirurgia associada à radioterapia, e 13 apenas radioterapia. O seguimento médio foi de 4,5 anos (2,3 até 6,7 anos) e a sobrevida geral e livre de eventos foi de 63,3 e 62,1 por cento em 5 anos, respectivamente. A falha do tratamento local foi de 0 (zero) por cento para a modalidade de cirurgia associada à radioterapia, 6,5 por cento para cirurgia isolada, e 10 por cento para radioterapia (p=0,5). A sobrevida dos pacientes submetidos à radioterapia isolada foi significativamente inferior à sobrevida dos tratados com cirurgia e com cirurgia associada a radioterapia (30,8 versus 71,7 versus 64,1 por cento, respectivamente). Concluiu-se que não houve diferença em termos de falha local de acordo com a modalidade de tratamento empregada, no entanto houve diferença significativa em termos de sobrevida. Apesar dos resultados cirúrgicos superiores, a radioterapia isolada ainda apresenta papel fundamental no tratamento de casos selecionados. / Ewing sarcoma is a small round cell malignancy of bone and soft tissue that usually occurs in children and adolescents. Current treatment includes induction chemotherapy, local control of the primary tumor (surgery, surgery plus radiotherapy, or radiotherapy) and consolidation chemotherapy. The introduction of chemotherapy has improved significantly the oncologic outcomes in Ewing sarcoma. On the other hand, the impact of the local control modality has not been established. Surgery alone or in combination with radiation has traditionally been considered a good choice for resectable ES, while unresectable tumors have been treated with definitive radiotherapy. Despite the results from a few trials and observational studies, there is no consistent knowledge about the local control modality in ES outcomes. The present study aims to evaluate the impact of the local control modality in the oncologic outcomes, as well as to describe the clinical features of the patients with localized Ewing sarcoma of the bone. The data were collected between 2003 and 2010 in 15 hospitals and were part of the first Brazilian Collaborative Group for the Treatment of the Ewing Sarcoma Family Tumors (EWING 1). From 73 patients (median age 12.8 years old), 47 were treated with surgery, 13 with surgery plus radiotherapy, and 13 with definitive radiotherapy. Median follow up was 4.5 years (2.3 to 6.7 years) and the overall and event-free survival 63.3 and 62.1 percent in 5 years, respectively. The local control failure was 0 percent for surgery plus radiotherapy, 6.5 percent for surgery, and 10 percent for radiotherapy (p=.5). The survival of the patients treated with radiotherapy was significantly worse than those treated with surgery and surgery plus radiotherapy (30.8 versus 71.7 versus 64.1 percent, respectively). In conclusion, there was no significant difference in local failure according to the modality of treatment, but there was significant difference in survival rates. Despite the better outcomes in individuals treated with surgery, the radiotherapy modality has still an important role in selected patients.

Os sarcomas ósseos representam uma proporção significativa de tumores na faixa etária pediátrica, ainda apresentando um quadro desafiador devido a sua significativa taxa de morbimortalidade. Pesquisas para o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas e para o desenvolvimento de métodos que identifiquem características da doença que possam permitir melhor estratificação dos pacientes através de dados clinicamente relevantes para individualizar as condutas clínicas são necessárias. Dentro deste contexto surge o conceito de radiômica, que visa extrair dados clinicamente relevantes a partir de imagens médicas. Entretanto, para colocar a radiômica em prática, é necessário selecionar, nas imagens médicas, as áreas de interesse referentes às patologias estudadas, e este processo se denomina segmentação. O objetivo primário deste estudo foi avaliar a reprodutibilidade intra e inter-observador da segmentação manual de sarcomas ósseos em imagens de ressonância magnética (RM). Como objetivo secundário, foi avaliada a capacidade da segmentação semiautomática em reduzir o tempo necessário para segmentação, mantendo similaridade com a segmentação manual. O estudo foi realizado de forma retrospectiva com inclusão de pacientes com diagnóstico de osteossarcoma ou sarcoma de Ewing confirmado por estudo histopatológico e que tivessem imagens de RM realizadas no Hospital Universitário de nossa Instituição realizadas previamente a qualquer intervenção terapêutica. Três médicos radiologistas, de forma independente e às cegas em relação as demais segmentações e em relação ao resultado histopatológico, realizaram a segmentação manual dos contornos destes tumores utilizando o software 3DSlicer, permitindo que fosse realizada avaliação da reprodutibilidade interobservador. Um dos radiologistas realizou uma segunda segmentação manual dos mesmos casos, possibilitando a avaliação da reprodutibilidade intraobservador, e, ainda, uma terceira segmentação foi realizada, utilizando metodologia semiautomática, disponível no software mencionado. Para a análise estatística, foi utilizado o coeficiente de similaridade de Dice (DICE), a distância Hausdorff (DH), comparações de volumes e análises dos intervalos de tempo necessários para realização das segmentações. Os parâmetros avaliados demonstraram haver boa reprodutibilidade intraobservador, com DICE variando entre 0,83 a 0,97; e distância Hausdorff variando entre 3,37 a 28,73 mm. Também foi demonstrada boa reprodutibilidade interobservador com DICE variando entre 0,73 a 0,97; e distância Hausdorff variando entre 3,93 a 33,40 mm. A segmentação semiautomática demonstrou boa similaridade em relação à segmentação manual (DICE variando entre 0,71 a 0,96 e DH variando entre 5,38 a 31,54 mm), havendo redução significativa do tempo necessário para segmentação. Entre todas as situações comparadas, os volumes não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p-valor>0,05). / Bone sarcomas represent a significant proportion of tumors in the pediatric age group and they still are a challenge due to their significant morbidity and mortality rates. Reseaches are important for the development of new therapeutic modalities and for the development of methods that identify features that allow better stratification of the patients with theses diseases for individualization of their treatments. In this context emerges the concept of radiomics, which is the process of extraction of clinically relevant data from medical images. It is important to segment the areas of interest im medical images for the pratice of this process. The primary objective of this study was to evaluate the intra- and interobserver reproducibility of manual segmentation of bone sarcomas on magnetic resonance imaging (MRI). As a secondary objective, it was evaluated if the semiautomatic segmentation could be similar to manual segmentation and if the semiautomatic method could reduce the time required for segmentation. The study was performed retrospectively with the inclusion of patients with osteosarcoma or Ewing sarcoma confirmed by histopathological study and who had MRI performed at the University Hospital of our Institution prior to any therapeutic intervention. Three radiologists, independently and blindly in relation to the other segmentations and in relation to the histopathological results, performed the manual segmentation of the contours of these tumors using 3DSlicer software, allowing an interobserver reproducibility evaluation. One of the radiologists performed a second manual segmentation of the same cases, allowing the evaluation of intraobserver reproducibility. A third segmentation was performed, using semi-automatic methodology, available in the mentioned software. For the statistical analysis, Dice similarity coefficient (DICE), Hausdorff distance (DH), comparisons between volumes and time intervals for segmentations were used. The parameters evaluated demonstrated a good intraobserver reproducibility, with DICE ranging from 0.83 to 0.97 and Hausdorff distance ranging from 3.37 to 28.73 mm. Good interobserver reproducibility was also demonstrated with DICE ranging from 0.73 to 0.97 and Hausdorff distance ranging from 3.93 to 33.40 mm. Semiautomatic segmentation demonstrated good similarity to manual segmentation (DICE ranging from 0.71 to 0.96 and HD ranging from 5.38 to 31.54mm), and there was significant reduction in the time required for segmentation. Among all the situations compared, the volumes did not present significant statistical differences (p-value> 0.05).

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438254.pdf: 475511 bytes, checksum: 55b686575a0c7ed0d039db86576374f6 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Ewing?s sarcoma is a highly aggressive tumor of bone and soft tissues. It affects mainly children and young adults. In about 88% to 95% there is the occurrence of a translocation between the EWS gene (22q12 locus) and two members of ETS transcription factors family: FLI1 (11q24 locus) or ERG (21q22). The most common translocation involves gene EWS and FLI1. This translocation leads to the formation of EWS/FLI1chimeric aberrant transcription factor. The EWS/FLI1 regulates the NR0B1 gene promoter through a direct binding to GGAA microsatellites sequences. Our objective was to identify and describe the molecular structure of GGAA motifs in NR0B1 promoter in unrelated Ewing's Sarcoma patients and healthy subjects from South Brazilian population. Were identified 21 different alleles in the 224 subjects. All alleles had at least 4 to 5 consecutive GGAA motifs. The 24.2, corresponding to (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10 sequence, was the most frequent in our population, being present in 50.4% of subjects. Allele 24.2 could be associated to Ewing's sarcoma development since it was significantly more frequent among patients. Differences in the global configuration of NR0B1 promoter GGAA microsatellites (size, sequence, amount and position of GGAA repeats and single 'A' base insertions) could result in differences in Ewing's sarcoma susceptibility. These results would provide insights for the understanding of tumorigenesis. / O sarcoma de Ewing ? um tumor altamente agressivo que afeta ossos e tecidos moles. Ele acomete principalmente crian?as e adultos jovens. Em torno de 88% a 95% dos casos verifica-se a ocorr?ncia de uma transloca??o entre o gene EWS (l?cus 22q12) e dois membros da fam?lia do fator de transcri??o ETS: o FLI1 (11q24) ou o ERG (21q22). A transloca??o mais frequente envolve os genes EWS e FLI1. Esta transloca??o leva ? forma??o do fator de transcri??o quim?rico aberrante EWS/FLI1. O fator EWS/FLI1 regula o promotor do gene NR0B1 atrav?s de uma liga??o direta a sequ?ncias de microssat?lites GGAA. Nosso objetivo foi identificar e descrever a estrutura molecular de motivos GGAA no promotor de NR0B1 em pacientes com Sarcoma de Ewing n?o relacionados e n?o afetados da popula??o sul brasileira. Foram identificados 21 alelos diferentes em 224 indiv?duos estudados. Todos os alelos tiveram, pelo menos, de 4 a 5 motivos consecutivos GGAA. O alelo 24.2, correspondente a sequ?ncia (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10, foi o mais freq?ente em nossa popula??o, estando presente em 50,4% de todos os indiv?duos. O alelo 24.2 pode estar associado ao desenvolvimento do Sarcoma de Ewing, dado que sua frequ?ncia foi significativamente mais alta entre afetados. Diferen?as na configura??o global dos microssat?lites GGAA no promotor de NR0B1 (em rela??o ? tamanho, sequ?ncia, quantidade e posi??o das repeti??es GGAA e inser??es de base ?nica A ) podem resultar em diferente susceptibilidade ao sarcoma de Ewing. Tais resultados poder?o fornecer subs?dios para uma melhor compreens?o da tumorig?nese.

O sarcoma de Ewing (SE) é um tumor caracterizado por possuir células indiferenciadas, de origem neuroepitelial. É o segundo tumor ósseo maligno mais comum em crianças e adolescentes. O tratamento consiste na aplicação de quimioterapia neoadjuvante, seguida da cirurgia e a quimioterapia adjuvante ou radioterapia. Contudo, a disseminação deste tumor é muito intensa, e mesmo em pacientes onde a metástase não ocorreu, podem haver células tumorais circulantes. Além disso, a sobrevida de 5 anos que cerca de 70% dos pacientes que não apresentam metástase no momento do diagnóstico atingem, cai para 25% nos pacientes que apresentam metástase. A migração e invasão celular dos tecidos vizinhos e vasos sanguíneos, a adesão celular e a proliferação são processos essenciais para que a metástase tumoral aconteça. Dentre as reguladoras da mobilidade, adesão celular e proliferação estão as GTPases da família Rho, que possuem entre suas quinases efetoras, ROCK1 e ROCK2. Assim, as proteínas ROCK induzem inúmeras respostas celulares que envolvem a regulação de muitas proteínas associadas ao citoesqueleto. Estudos evidenciam que respostas sinalizadas por ROCK agravam fenótipos associados ao câncer e outras doenças. O presente trabalho teve como objetivo verificar a expressão dos genes ROCK1 e ROCK2 em amostras tumorais e linhagens celulares de SE, e os efeitos in vitro da inibição farmacológica de ambas as quinases. O estudo da expressão gênica de ROCK1 e ROCK2 em amostras de pacientes com SE (n=18) revelaram uma hipoexpressão de ambos genes, tanto nas amostras de pacientes com SE quanto nas linhagens celulares SK-ES-1 e RD-ES. Não foi encontrada nenhuma relação das expressões gênicas com os dados clínicos. Contudo, a presença do gene de fusão EWS-FLI1 parece estar associada com menor expressão de ROCK1. Verificou-se que a proliferação celular, a capacidade clonogênica e o ciclo celular não se alteraram significativamente nas linhagens celulares de SE após os diferentes tratamentos com as drogas GSK429286 (inibidor de ROCK1), SR3677 (inibidor de ROCK2) e Hidroxifasudil (pan-inibidor). Porém, apesar de não significativo, observou-se um tênue aumento na migração e invasão celular após o tratamento com as drogas. Nossos dados indicam que ROCK1 e ROCK2 podem possuir um papel na tumorigênese do SE, e ainda estar relacionadas com os mecanismos de migração e invasão celular, processos importantes para a metástase tumoral. / Ewing\'s sarcoma (ES) is characterized by undifferentiated cells of neuroepithelial origin. It is the second most common malignant bone tumor in children and adolescents. Standard treatment consists of preoperative chemotherapy, followed by surgery and postoperative chemotherapy and/or radiotherapy. However, the spread of the tumor is very high and even in patients where the metastasis has not occurred, there may be circulating tumor cells. Furthermore, the 5-year survival which about 70% of patients without metastases at diagnosis achieve, falls to 25% in patients with metastases. Migration and invasion into adjacent tissues and blood vessels, cell adhesion and proliferation are essential for tumor metastasis to occur. Among the regulators of the processes are the Rho family of GTPases, which have as their effector kinases, ROCK1 and ROCK2. Thus, ROCK induce numerous cellular responses involving the regulation of many proteins associated with the cytoskeleton. Studies show that responses regulated by ROCK aggravate phenotypes associated with cancer and other diseases. This study aimed to verify the expression of ROCK1 and ROCK2 genes in ES tumor samples and to evaluate the effects of their pharmacological inhibition in vitro. Gene expression analysis showed lower expression of ROCK in both, patient samples (n=18) and the SK-ES- 1 and RD-ES cell lines. There was no relation of gene expression with clinical data. Nonetheless, the presence of EWS-FLI1 fusion appears to be associated with lower expression of ROCK1. Cell proliferation, clonogenic capacity and the cell cycle were not affected after different treatments with GSK429286 (ROCK1 inhibitor), SR3677 (ROCK2 inhibitor) and Hydroxyfasudil (pan-inhibitor). However, although not significant, there was a tenuous increase in cell migration and invasion following treatment with the drugs. Our data suggest that ROCK1 and ROCK2 might have a role in ES tumorigenesis and may be related im part to migration and invasion cell mechanisms, important processes for tumor metastasis.