Enzyme dynamics has been established to play a crucial role in catalysis, and it has therefore become an important area of research to better understand enzymatic rate enhancements. The light-activated enzyme protochlorophyllide oxidoreductase (POR) is a well-studied model system where dynamics are known to be important for catalysis. The catalytic reaction involves a sequential hydride and proton transfer to reduce the C17-C18 double bond in the protochlorophyllide (Pchlide) substrate with NADPH as a cofactor to yield the chlorophyllide (Chlide) product. Both H-transfer steps are established to undergo quantum tunneling, as derived from the temperature-dependence of the kinetic isotope effects (KIEs). Furthermore, a role for ‘promoting motions/vibrations’ has been presumed from the temperature-dependence KIE data, which will be investigated further in this thesis by the study of the KIE response to pressure. A general overview of the pressure-dependence as a new experimental probe is presented and compared with temperature-dependencies of KIEs, to establish whether pressure is suitable as an alternative technique for studying the role of enzyme dynamics in catalysis. This involves a comparison of pressure data from other enzyme systems to newly collected data for POR. However, no clear trend between temperature and pressure data is observed and hence, it can be concluded that pressure effects can be difficult to interpret. A case by case analysis is required and needs to be combined with computational simulations based on structural evidence (e.g. X-ray crystallographic), which is not yet available for POR.Solvent-viscosity has been successfully used to probe enzyme dynamics in POR and provides information on the extent of any protein networks that are involved along the reaction coordinate. Here I investigate the solvent-viscosity dependence of both H-transfer reactions in POR for a range of homologous POR enzymes to obtain an evolutionary perspective of the protein dynamics required for catalysis. This has been successfully used in the past on a limited number of POR homologues and has led to the formulation of a hypothesis supporting a twin-track evolution of the two catalytic steps in POR. I observed a lack of solvent-viscosity dependence in case of the hydride transfer across all the investigated lineages, while the proton transfer was shown to be more strongly affected by viscosity in prokaryotic enzymes than in their eukaryotic counterparts. This supports the proposed theory, suggesting an early optimisation of the dynamics involved in the light-activated hydride transfer with a strong reliance on localised motion. Conversely, the proton transfer experienced selective pressure to reduce its dependence on complex solvent-slaved motion and that has led to localised dynamics in eukaryotic POR homologues. Additionally, I found that the enzymes from eukaryotic species have a higher rate of both H-transfer steps, suggesting that an optimisation of the active site architecture occurred upon endosymbiosis. Enzyme dynamics clearly have a pivotal role to play in catalysis of this unique light-activated enzyme and detection of these will only be possible by detailed structural information.

This work aims to study the pressure dependence of the thickness of the epitaxial silicon carbide SiC film growing from crystalline silicon Si due to the heterogeneous reaction with gaseous carbon monoxide CO.

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Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:08/57338-5

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2,4 kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de eGFP foram obtidos por incubação durante várias horas a níveis de pressão entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta condição de pressão se mostrou favorável à renaturação de eGFP e é possível que também possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras proteínas monoméricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que os CI desta proteína produzidos por bactérias cultivadas em menor temperatura (37ºC) possuem maior quantidade de proteína recombinante apresentando a fluorescência característica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os CI expressos em temperaturas mais elevadas (42ºC e 47ºC). A análise realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) também demonstrou que os CI produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas secundárias semelhantes às da proteína na sua forma nativa. Além disso, os CI produzidos a 37ºC também são mais facilmente solubilizados pela ação da alta pressão do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a renaturação da eGFP a partir de CI produzidos a 37ºC foi 25 vezes mais eficiente do que a obtida utilizando CI produzidos a 47ºC. No presente estudo demonstramos também que a dissociação dos agregados exercida pela ação da alta pressão (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associação com a incubação em baixa temperatura (-9ºC) e que a combinação destas duas propriedades físicas eleva a solubilização dos agregados em CI, com a consequente elevação dos rendimentos de renaturação de eGFP. Mostramos ainda no presente estudo que a cinética de renaturação de eGFP em 0,69 kbar é proporcional à temperatura de incubação (entre 10ºC e 50ºC). O nível mais elevado de fluorescência foi obtido quando a renaturação de eEGP foi realizada a 20ºC. A taxa de maturação do cromóforo da eGFP é mais fortemente afetada pela temperatura do que a taxa de enovelamento da proteína. Em conclusão, a temperatura de produção dos CI, a temperatura de dissociação dos agregados e a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cinética da renaturação de eGFP em alta pressão. Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para melhorias no processo de enovelamento de proteínas a partir de CI utilizando alta pressão. Também neste trabalho descrevemos a renaturação das proteínas de Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na forma solúvel. Os rendimentos de solubilização destas três proteínas foram muito altos, entre 75% e 89%. A proteína PilB renaturada em alta pressão apresentou atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de Xac. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:08/57338-5

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Submitted by Pedro Silva Filho (pfsilva@ipen.br) on 2017-11-17T17:27:31Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-11-17T17:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os elementos de combustível de um reator nuclear de pesquisa tipo MTR (\"Material Testing Reactor\") são, em sua grande maioria, formados por placas de combustível revestidas com alumínio contendo no cerne silicileto de urânio (U3Si2) disperso em matriz de alumínio. Essas placas possuem espessura da ordem de milímetros e comprimentos muito maiores em relação à sua espessura. Elas são dispostas paralelamente no conjunto que forma o elemento combustível, de maneira a formar canais entre elas com poucos milímetros de espessura, por onde escoa o fluido de refrigeração (água leve ou água pesada). Essa configuração, associada à necessidade de um escoamento com altas vazões para garantir o resfriamento das placas em operação, pode gerar problemas de falhas mecânicas das placas de combustível devido às vibrações induzidas pelo escoamento nos canais e, consequentemente, acidentes de proporções graves no caso de velocidade crítica que possa gerar o colapso das placas. Embora não haja ruptura das placas de combustível durante o colapso, as deflexões permanentes excessivas das placas podem causar bloqueio do canal de escoamento no núcleo do reator e levar ao superaquecimento nas placas. Para este trabalho, foram desenvolvidas uma bancada experimental com capacidade para altas vazões volumétricas (Q=100 m3/h) e uma seção de testes que simula um elemento combustível do tipo placa com três canais de resfriamento. A seção de testes foi construída com placas de alumínio e acrílico e foi instrumentada com sensores de deformação, sensores de pressão, um acelerômetro e um tubo de pitot. As dimensões da seção de testes foram baseadas nas dimensões do Elemento Combustível do Reator Multipropósito Brasileiro (RMB), cujo projeto está sendo coordenado pela Comissão Nacional de Energia Nuclear - CNEN. Os experimentos realizados alcançaram o objetivo de chegar à condição de velocidade crítica de Miller com o colapso das placas. A velocidade crítica foi atingida com 14,5 m/s levando a consequente deformação plástica das placas que formam o canal do escoamento. O canal central na entrada da seção de testes apresentou uma abertura de 3 mm em seu centro, causando um grande bloqueio do escoamento nos canais laterais. Este comportamento foi v constatado visualmente durante a desmontagem da seção de testes, ilustrado e discutido na análise de resultados apresentado neste trabalho. O bloqueio dos canais também foi observado por meio de gráficos de queda de pressão e por gráficos das deformações da entrada, centro e saída das placas contra a velocidade média da seção de testes. Observou-se uma queda da resistência hidráulica da seção de testes devido ao aumento da seção transversal de escoamento no canal central e um aumento exponencial das deformações quando da ocorrência da velocidade crítica. Comparativamente, o valor experimental obtido para velocidade crítica na seção de testes foi da ordem de 85% do valor obtido por cálculo com a expressão teórica de Miller. Os experimentos realizados permitiram um melhor entendimento da interação fluido estrutura em elementos de combustível tipo placa como: valores de frequências de vibrações naturais, instabilidade fluido elástica e desenvolvimento de técnicas para a detecção de valores de velocidade crítica. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / CNPq:481193/2012-0

No / The shear viscosity of polymethylmethacrylate (PMMA) melt is particularly investigated by using a twin-bore capillary rheometer at four temperatures of 210, 225, 240, and 255 degrees C with different capillary dies. Experimental results show that the geometrical dependence of shear viscosity is significantly dependent on melt pressure as well as melt temperature. The measured shear viscosity increases with the decrease of die diameter at lower temperatures (210 and 225 degrees C) but decreases with the decrease of die diameter at higher temperatures (240 and 255 degrees C). Based on the deviation of shear viscosity curves and Mooney method, negative slip velocity is obtained at low temperatures and positive slip velocity is obtained at high temperatures, respectively. Geometrical dependence and pressure sensitivity of shear viscosity as well as temperature effect are emphasized for this viscosity deviation. Moreover, shear viscosity curve at 210 degrees C deviates from the power law model above a critical pressure and then becomes less thinning. Mechanisms of the negative slip velocity at low temperatures are explored through Doolittle viscosity model and Barus equation, in which the pressure drop is used to obtain the pressure coefficient by curve fitting. Dependence of pressure coefficient on melt temperature suggests that the pressure sensitivity of shear viscosity is significantly affected by temperature. Geometrical dependence of shear viscosity can be somewhat weakened by increasing melt temperature. (c) 2013 Wiley Periodicals, Inc. J. Appl. Polym. Sci. 130: 3384-3394, 2013