The Group III metabotropic glutamate receptors (mGluR) are located presynaptically on axon terminals and act as autoreceptors and heteroreceptors by inhibiting neurotransmitter release. Much has been learned about these receptors through exogenous application of L-serine-O-phosphate (L-SOP), an endogenous amino acid derivative and known activator of the Group III mGluRs. We hypothesized that L-SOP is the endogenous co-agonist at the high affinity Group III mGluR, mGluR4. We found the EC50 of L-SOP at mGluR4 was 0.5 μM, and determined that the concentration of L-SOP in whole brain was approximately 5 μM. An immunocytochemical survey revealed that cells containing the enzymatic machinery necessary for L-SOP synthesis and metabolism were observed in two brain regions known to express mGluR4, namely, cerebellum and hippocampus. In the cerebellum, the L-SOP synthetic and metabolic enzymes were found in Bergmann glia and Purkinje cells, two cells which form a tripartite synapse with parallel fiber axon terminals where the mGluR4 subtype is exclusively expressed at high levels. In the hippocampus, the L-SOP metabolic enzyme was detected in young neurons emanating from the neurogenic subventricular zone. Attempts to raise endogenous levels of L-SOP by crippling the L-SOP metabolizing enzyme (phosphoserine phosphatase), over-expressing the L-SOP synthesizing enzyme (phosphoserine aminotransferase), or through dietary protein restriction, to study the effects on neurotransmission and neurodevelopment in the central nervous system (CNS) were unsuccessful, suggesting that the production of L-SOP remains stable despite manipulation of the synthetic and metabolic enzymes. Finally, the ability of L-SOP to modulate glutamate release from presynaptic terminals was examined in cerebellar synaptosomes. Co-incident activation of presynaptic mGluR4 and presynaptic GABAA receptors facilitated glutamate release, suggesting that simultaneous activation of parallel fibers and Bergmann glia may serve to enhance synaptic transmission. This observation expands the traditional view of Group III mGluRs acting solely as inhibitory autoreceptors. Taken together, these results provide compelling evidence to support the hypothesis that L-SOP is the endogenous agonist at mGluR4, and possibly other Group III mGluRs.

The Group III metabotropic glutamate receptors (mGluR) are located presynaptically on axon terminals and act as autoreceptors and heteroreceptors by inhibiting neurotransmitter release. Much has been learned about these receptors through exogenous application of L-serine-O-phosphate (L-SOP), an endogenous amino acid derivative and known activator of the Group III mGluRs. We hypothesized that L-SOP is the endogenous co-agonist at the high affinity Group III mGluR, mGluR4. We found the EC50 of L-SOP at mGluR4 was 0.5 μM, and determined that the concentration of L-SOP in whole brain was approximately 5 μM. An immunocytochemical survey revealed that cells containing the enzymatic machinery necessary for L-SOP synthesis and metabolism were observed in two brain regions known to express mGluR4, namely, cerebellum and hippocampus. In the cerebellum, the L-SOP synthetic and metabolic enzymes were found in Bergmann glia and Purkinje cells, two cells which form a tripartite synapse with parallel fiber axon terminals where the mGluR4 subtype is exclusively expressed at high levels. In the hippocampus, the L-SOP metabolic enzyme was detected in young neurons emanating from the neurogenic subventricular zone. Attempts to raise endogenous levels of L-SOP by crippling the L-SOP metabolizing enzyme (phosphoserine phosphatase), over-expressing the L-SOP synthesizing enzyme (phosphoserine aminotransferase), or through dietary protein restriction, to study the effects on neurotransmission and neurodevelopment in the central nervous system (CNS) were unsuccessful, suggesting that the production of L-SOP remains stable despite manipulation of the synthetic and metabolic enzymes. Finally, the ability of L-SOP to modulate glutamate release from presynaptic terminals was examined in cerebellar synaptosomes. Co-incident activation of presynaptic mGluR4 and presynaptic GABAA receptors facilitated glutamate release, suggesting that simultaneous activation of parallel fibers and Bergmann glia may serve to enhance synaptic transmission. This observation expands the traditional view of Group III mGluRs acting solely as inhibitory autoreceptors. Taken together, these results provide compelling evidence to support the hypothesis that L-SOP is the endogenous agonist at mGluR4, and possibly other Group III mGluRs.

Die Informationsverarbeitung im Nervensystem basiert auf der Signalübertragung an chemischen Synapsen. Um diese bei hochfrequenter Aktivität aufrecht erhalten zu können, ist das Nachfüllen von Neurotransmitter-gefüllten Vesikeln an die präsynaptische Membran von zentraler Bedeutung. Die glutamatergen Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapsen (PF-PC-Synapsen) des Zerebellums weisen eine ausgeprägte und anhaltende Kurzzeitbahnung für bis zu 30 Aktionspotentiale (APs) bei hochfrequenter Aktivität auf, obwohl anfänglich nur eine vergleichsweise geringe Anzahl synaptischer Vesikel (~ 3) an der aktiven Zone gedockt ist. Dies wird durch ultra-schnelles Nachfüllen (Recruitment) im Millisekundenbereich ermöglicht, welches sogar zu einer Vergrößerung des Pools gedockter und freisetzungsbereiter Vesikel (Readily releasable pool, RRP) führt (Overfilling, Überfüllen). Es gibt Evidenz dafür, dass dieser Prozess mindestens teilweise Kalzium(Ca2+)-abhängig ist. Durch welche Kanäle das hierfür bereitgestellte Ca2+ in die Präsynapse gelangt, war bislang unklar. An PF-PC-Synapsen sind drei Subtypen spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle (Cavs) vorhanden: Cav2.1 (P/Q Typ), Cav2.2 (N Typ) und Cav2.3 (R Typ). Diese stellen in jungen Mäusen (P8-10) gemeinsam das Ca2+ für die Freisetzung der Transmitter-Vesikel zur Verfügung. Während der Entwicklung verringert sich die Kopplungsdistanz zwischen Cav2.1-Kanälen und Ca2+-Sensor, sodass bei reiferen Tieren (P21–24) allein der Ca2+-Einstrom durch eng gekoppelte Cav2.1 zur Vesikelfreisetzung führt. Cav2.2 und Cav2.3 sind jedoch weiterhin an der Präsynapse vorhanden und tragen zum Aktionspotential(AP)-vermittelten Ca2+-Einstrom bei. Die Funktion dieser Kanäle in reiferen Tieren blieb bisher weitgehend ungeklärt. Vorliegend wurden folgende Hypothesen überprüft: 1. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 ist für spontane, nicht AP-vermittelte Vesikelfreisetzung verantwortlich. 2. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 stellt Ca2+ für ultra-schnelles Nachfüllen mit Überfüllen bereit. Um diese Hypothesen zu prüfen, wurden Whole-Cell Patch-Clamp Messungen an Purkinjezellen in akuten Hirnschnitten reifer (P21–24) C57BL/6 Mäuse durchgeführt und die Parallelfasern (PFs) extrazellulär in der Molekularschicht stimuliert. Zunächst wurde die Hypothese geprüft, ob Cav2.2 und Cav2.3 an der Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Dazu wurden sogenannte miniature excitatory postsynaptic currents (Miniatur-EPSCs, mEPSCs) der Purkinjezellen aufgezeichnet. Bei Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration von 2 mM auf 5 mM zeigte sich eine deutliche Steigerung der mEPSC-Frequenz, was die Annahme stützt, dass die spontane Vesikelfreisetzung eine Ca2+-abhängige Komponente hat. Um Rückschlüsse auf die Beteiligung der Cav-Subtypen ziehen zu können, wurden Cav2 Subtyp-spezifische Toxinblocker eingesetzt. Ω-Agatoxin-IVA wurde zur Blockierung von Cav2.1 eingesetzt. Cav2.2 wurde mit Ω-Conotoxin GVIA und Cav2.3 mit SNX-482 blockiert. Unter dem Einfluss dieser Toxine konnte weder einzeln noch in Kombination ein Effekt auf die Frequenz der mEPSCs beobachtet werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Funktion dieser Cav2s nicht die Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung ist. Anschließend wurde der Einfluss der Blockade der Cav2 Subtypen auf das Vesikel-Nachfüllen untersucht. Dazu wurden Parallelfasern zunächst fünf Mal bei einer Frequenz von 20 Hz extrazellulär stimuliert und die hervorgerufenen EPSCs aufgezeichnet. Hieraus wurde das Verhältnis aus den Amplituden des zweiten bis fünften EPSCs zur Amplitude des ersten EPSCs berechnet (Ai/A1). Diese Paarpulsverhältnisse sollten sich bei einem durch Cav2-Blocker beeinträchtigtem Vesikel-Nachfüllen verkleinern. Ein solcher Effekt war jedoch bei dieser kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli nicht zu beobachten. Da die in-vivo-Aktivität an der PF-PC-Synapse aus längeren, hochfrequenten Trains besteht und sie in der Lage ist, auch bei länger anhaltender Stimulation zu bahnen, wurde ein weiteres Experiment mit Trains aus 50 Stimuli durchgeführt. Hierbei sollte während oder zumindest gegen Ende des Trains ein Gleichgewicht aus Freisetzung und Nachfüllen (Steady State) erreicht werden. Dazu war es erforderlich, die extrazelluläre Ca2+-Konzentration auf 6 mM zu erhöhen. Die aufgezeichneten EPSC-Amplituden wurden in einem kumulativen Plot aufgetragen und mit einer Methode nach Schneggenburger et al. ausgewertet. Dabei wird der Gleichgewichtsbereich mit einer linearen Funktion gefittet, deren Anstieg ein Maß für die Nachladerate und deren y-Achsenabschnitt ein Maß für das Dekrement des RRP ist. Durch spezifische Blockade einzelner Cav-Subtypen kann man Aussagen über deren Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen und RRP treffen. Unter Hinzugabe von Ω Agatoxin IVA konnte, wie erwartet, eine starke Reduktion bereits bei der ersten EPSC-Amplitude beobachtet werden, da der Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 entscheidend für die Freisetzungswahrscheinlichkeit der Vesikel (pv) ist. Hierdurch erklärt sich die beobachtete Abnahme des RRP-Dekrements. Der Anstieg der Geraden im Gleichgewichtszustand zeigte sich durch Ω-Agatoxin-IVA nicht signifikant verändert. Allerdings könnte ein möglicher Effekt durch die starke Reduktion der pv maskiert sein. Daher wurde in einem weiteren Versuch eine reduzierte Dosis (100 nM statt 250 nM) Ω Agatoxin-IVA eingesetzt. Hier zeigte sich neben dem Effekt auf das RRP-Dekrement außerdem ein vermindertes Nachfüllen der Vesikel. Dieser Effekt wurde bei voller Dosis vermutlich maskiert und weist darauf hin, dass Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 zur Aufrechterhaltung des Vesikel-Nachfüllens beiträgt. Bei Blockade von Cav2.3 mit SNX-482 konnte kein signifikanter Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen oder RRP festgestellt werden. Unter dem Einfluss des Cav2.2-Blockers Ω-Conotoxin GVIA zeigte sich ein interessanter Effekt: Die Nachladerate wurde durch die Toxinapplikation selektiv reduziert. Hieraus lässt sich schlussfolgern, dass die Bereitstellung von Ca2+ für das Vesikel-Nachfüllen eine Funktion des Cav2.2 an dieser Synapse darstellt. Das RRP-Dekrement blieb davon unbeeinflusst, was zu dem beschriebenen Befund passt, nach dem Cav2.2s in diesem Alter nicht an der Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Unter Cav2.1-Block dagegen, blieben die EPSC-Amplituden am Ende verhältnismäßig unbeeinflusst, während die ersten stark reduziert waren. Dieser Befund passt zu der Annahme, dass Ω-Agatoxin-IVA pv stark verringert, während das Nachfüllen über den erhaltenen Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 weiterläuft. Anhand unserer Daten ist allerdings nicht auszuschließen, dass ein Unterschied zwischen früh und spät im Train rekrutierten Vesikeln hinsichtlich deren Kopplung an Cav2.1 oder Cav2.2 besteht. Im Anschluss an die Trains mit 50 Stimuli wurde eine Erholungsphase aufgezeichnet. Hierbei wurde mit konsekutiv steigenden Interstimulus-Intervallen die Regeneration der EPSC-Amplituden bis etwa auf das Ausgangsniveau aufgezeichnet. Der Zeitverlauf der Erholung wurde mittels biexponentieller Funktionen gefittet. Bei der Applikation von Ω Agatoxin-IVA zeigte sich der Gleichgewichtszustand ohne Depression, während er unter Ω Conotoxin GVIA und SNX-482 eine deutliche Depression aufwies. Ω-Agatoxin-IVA führte zu einer signifikant beschleunigten Erholung. Dieser Effekt resultiert aber am ehesten aus der starken Reduktion von pv und der fehlenden Depression. Sowohl der Zeitverlauf der Erholung als auch die EPSC-Amplituden während der kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli waren unbeeinflusst von Cav2.2- und Cav2.3-Block. Gemeinsam spricht dies für das Vorhandensein eines basalen Nachfüllens, welches zusätzlich zum Ca2+-abhängigen Nachfüllen mit Einstrom durch Cav2.1 und Cav2.2 stattfindet. Das Ziel der Studie bestand darin, die Funktion der Cav2.2- und Cav2.3-Kanäle im präsynaptischen Bouton der reifen Parallelfaser zu erforschen. Obwohl spontane Vesikelfreisetzung zumindest teilweise Ca2+-abhängig zu sein scheint, war keiner der untersuchten Cav2-Kanäle bedeutsam beteiligt. Bei Cav2.3 konnte des Weiteren keine Relevanz für das Nachfüllen festgestellt werden. Für Cav2.2-Kanäle konnte jedoch die Funktion als Ca2+-Bereitsteller für das Nachfüllen bei anhaltender synaptischer Transmission identifiziert werden. Zusammenfassend bestätigen unsere Daten den maßgeblichen Einfluss von Cav2.1 auf pv und zeigen eine wichtige Funktion von Cav2.2: die Erhaltung der synaptischen Effektivität unter anhaltender, hochfrequenter Aktivität an der Parallelfaser. Es bleibt die Frage offen, inwiefern diese Befunde auch für andere kleine glutamaterge Synapsen, beispielsweise im Neocortex, zutreffen. Auch dort konnte der entwicklungsbedingte Wechsel von gemeinsamer Steuerung der Vesikelfreisetzung durch Cav2.1 und Cav2.2 zu alleiniger Steuerung durch Cav2.1 beobachtet werden. Gleichzeitig bleibt auch hier die Ca2+-Signalgebung durch Cav2.2 erhalten.:Einleitung 1 Aufbau und Funktion chemischer Synapsen 1 Kurzzeitbahnung und Vesikel-Nachfüllen 2 Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapse als Modellsystem 4 Experimenteller Aufbau und Auswertungsmethoden 7 Publikation 9 Zusammenfassung 24 Literaturverzeichnis 28 Darstellung des eigenen Beitrags 31 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 32 Lebenslauf 33 Danksagung 34

Synaptic plasticity describes efficacy changes in synaptic transmission and ranges in duration from tens to hundreds of milliseconds (short-term), to hours and days (long-term). Short-term plasticity plays crucial roles in synaptic computation, information processing, learning, working and short-term memory as well as its dysfunction in psychiatric and neurodegenerative diseases. The main aim of my PhD thesis was to determine the molecular mechanisms of different forms of presynaptic plasticity. Short-term facilitation increases neurotransmitter release in response to a high-frequency pair (paired-pulse facilitation; PPF) or train (train facilitation; TF) of presynaptic stimuli. Synaptotagmin 7 (Syt7) has been shown to act as residual calcium (Ca$_{res}$) sensor for PPF and TF at various synapses. Syt7 also seems to be involved in recovery from depression, whereas its role in neurotransmission remains controversial. My aim was to express Syt7 in a synapse where it is not normally found and determine how it affects short-term synaptic plasticity. Immunohistochemistry indicated that Syt7 is not localized to cerebellar climbing fibers (CFs). Wild-type (WT) and Syt7 knockout (KO) recordings at CF to Purkinje cell (CF-PC) synapses established that at near-physiological external calcium (Ca$_{ext}$) levels both genotypes displayed similar recovery from paired-pulse depression. In low Ca$_{ext}$,WT CF-PC synapses showed robust PPF, which turned out to be independent of Syt7. All my experiments strongly suggested that WT CFs do not express native Syt7, but display low Ca$_{ext}$ CF-PC PPF and TF. Thus, channelrhodopsin-2 and Syt7 were bicistronically expressed via AAV9 virus in CFs. This ectopic Syt7 expression in CFs led to big increases in low-Ca$_{ext}$ CF-PC facilitation, more than doubling PPF and more than tripling TF. While overexpression of Syt7 might turn out to have an effect on the initial release probability (pr), the observed CF-PC facilitation increase still critically depended on presynaptic Syt7 expression. And when comparing only cells in a defined EPSC1 amplitude range, the Syt7-induced increase in low-Ca$_{ext}$ PPF could not be accounted for by changes in initial pr, suggesting a general role for Syt7 as calcium sensor for facilitation. Another form of short-term plasticity, post-tetanic potentiation (PTP), is believed to be mediated presynaptically by calcium-dependent protein kinase C (PKC) isoforms that phosphorylate Munc18-1 proteins. It is unknown how generally applicable this mechanism is throughout the brain and if other proteins might be able to modulate PTP. Combining genetic (PKCαβy triple knockout [TKO] and Munc18-1SA knock-in [Munc18 KI] mice, in which Munc18- 1 cannot get phosphorylated) with pharmacological tools (PKC inhibitor GF109203), helped us show that PTP at the cerebellar parallel fiber to Purkinje cell (PF-PC) synapse seems to depend on PKCs but seems mostly independent of Munc18-1 phosphorylation. In addition, compared to WT animals, genetic elimination of presynaptic active zone protein Liprin-α3 led to similar PF-PC PTP and paired-pulse ratios (PPRs). At the hippocampal CA3-CA1 synapse previous pharmacological studies suggested that PKC mediates PTP. A genetic approach helped to show that calcium dependent PKCs do not seem to be required for CA3-CA1 PTP. Pharmacologically inhibiting protein kinase A as well as genetically eliminating Syt7 also had no effect on CA3-CA1 PTP. In addition, Ca IM-AA mutant mice, in which Ca$_{v}$2.1 channels have a mutated IQ-like motif (IM) so that it cannot get bound by calcium sensor proteins any more, not only displayed regular PTP, but also normal PPF and TF at CA3-CA1 synapses. In conclusion, my PhD thesis helped further characterize different forms of presynaptic plasticity, underlined that short-term synaptic plasticity can be achieved through diverse mechanisms across the Mammalian brain and supported a potentially general role for synaptotagmin 7 acting as residual calcium sensor for facilitation.