Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la jonction mobile contrôlant l'invasion de la cellule hôte par Toxoplasma gondii. Les apicomplexes sont des parasites eucaryotes responsables d'infections humaines et animales, dont le paludisme et la toxoplasmose. La plupart sont des parasites intracellulaires obligatoires ; l'entrée dans la cellule hôte est donc un évènement crucial dans leur cycle de développement. Ce processus, conservé au sein du phylum, implique la sécrétion séquentielle du contenu de deux organites : les micronèmes et les rhoptries. Lors de l'invasion, le parasite établit un contact étroit entre son extrêmité apicale et la membrane plasmique de la cellule hôte, appelé la jonction mobile (JM). La JM est un point d'ancrage à la cellule hôte qui est initié chez Toxoplasma par la sécrétion de protéines du col des rhoptries appelées TgRON2/RON4/RON5/RON8 (complexe de RONs). Ces protéines sont sécrétées dans la cellule hôte et TgRON2 est insérée dans la membrane de la cellule hôte. TgRON2 peut servir de récepteur à la protéine TgAMA1 (Apical Membrane Antigen 1) qui est une protéine de micronèmes sécrétée à la surface du parasite durant l'invasion. L'interaction AMA1-RON2 est également conservée chez Plasmodium, mais il n'existe pas de réactivité croisée entre espèces d'apicomplexes. La résolution de la structure de la protéine recombinante TgAMA1 en complexe avec un peptide TgRON2 nous a permis de déterminer des résidus critiques à l'interaction entre ces deux protéines in vitro et à l'invasion du parasite in vivo, et de définir les bases structurales de la spécificité intra-espèce de l'interaction AMA1-RON2. Par l'obtention d'une souche dépourvue de TgAMA1, nous montrons qu'AMA1 n'est pas essentielle à la survie du toxoplasme, comme il avait été supposé depuis longtemps. Nous confirmons le rôle clé de cette protéine dans l'invasion et la formation de la JM. Les mutants dépourvus d'AMA1 sont capables d'insérer le complexe de RONs dans la cellule hôte mais se détachent plus fréquemment, entrainant des invasions abortives. L'invasion résiduelle observée en absence d'AMA1 pourrait impliquer des protéines homologues à TgAMA1, TgRON2 et TgRON4, dont nous avons entamé la caractérisation moléculaire et fonctionnelle.Mot-clés : Apicomplexes, Toxoplasma gondii, invasion, jonction mobile, micronèmes, rhoptries / Molecular and functional characterisation of the moving junction controlling host cell invasion by Toxoplasma gondiiAbstract:Apicomplexa are eukaryotic parasites responsible for a variety of human and animal diseases, including malaria or toxoplasmosis. Most of them have an obligatory intracellular stage; thus, the invasive process is a crucial step in their developmental cycle. It implies the sequential secretion of two organelles: micronemes and rhoptries. During invasion, the parasite establishes a structure called the moving junction (MJ), which is a close apposition between the apical end and the plasma membrane of host cell. The MJ is an anchoring point for invasion that is initiated in Toxoplasma by the secretion of rhoptry neck proteins named TgRON2/RON4/RON5/RON8 (the RONs complex). These proteins are exported to the host cell cytoplasm and TgRON2 spans the host cell membrane. There, TgRON2 will function as a receptor to Apical Membrane antigen 1 (TgAMA1), which is a micronemal protein displayed on the surface of the parasite during the invasion process. The AMA1-RON2 interaction is conserved in Plasmodium but there is no interspecies cross-binding.We have determined the structure of a TgAMA1 recombinant protein in complex with a TgRON2 peptide, which allowed us to determine which residues are critical for the interaction between both proteins in vitro and for parasite invasion in vivo. Moreover, the co-structure explains at the structural level the evolutionary constraint of the AMA1-RON2 interaction. By generating an AMA1 null strain in T. gondii, we demonstrate that TgAMA1 is not an essential gene, as claimed before. We confirm the importance of AMA1 in invasion and its key role in MJ formation. AMA1 null parasites insert the RON complex into the host cell but are more frequently detached from it, causing abortive invasions. The residual invasion might involve proteins homologous to TgAMA1, TgRON2 and TgRON4, for which the molecular and functional characterization is undertaken.Keywords: Apicomplexes, Toxoplasma gondii, invasion, moving junction, micronemes, rhoptries

La recherche de nouvelles molécules à activité antiparasitaire pour lutter contre les parasites responsables de maladies telles que le paludisme ou la trypanosomiase humaine africaine est un enjeu primordial car il n’existe pas de vaccin pour ces maladies qui peuvent être mortelles et qui touchent près de 1/6 de la population mondiale. Dans ce contexte, il a été observé au laboratoire que l’amélioration de l’activité des molécules sur une cible isolée ne se retrouvait pas toujours sur les parasites. Une faible entrée de la molécule dans la cellule pourrait être une des causes de ce manque de corrélation, comme cela est souvent le cas dans la recherche de molécules actives.Pour valider ou non cette cause, ces travaux de thèse ont eu pour but de concevoir, synthétiser et évaluer de nouvelles sondes fluorescentes qui permettraient de visualiser la pénétration de molécules actives dans des cellules, en nous intéressant en particulier aux parasites responsables de la maladie du sommeil et du paludisme.Notre concept se base sur le principe de la chimie « click », sans catalyseur, impliquant une fonction alcyne et un groupement azoture. Ceci est possible lorsque la fonctionalcyne est insérée dans un cycle tendu comme celui d’un cyclooctyne qui lui confère une plus grande réactivité (Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition).Nous avons synthétisé des dérivés de la dibenzocyclooctynone, une molécule fluorescente décrite pour réagir sans catalyseur avec des azotures, de manière à obtenir des sondes à détection « on-on’ ». Ainsi, sept nouvelles sondes fluorescentes ont été obtenues, dont trois réagissent avec des azotures avec une cinétique adéquate. Les propriétés photophysiques de ces molécules ont été caractérisées et nous avons vérifié qu’elles traversent bien la membrane des protozoaires parasites que nous étudions. La fluorescence n’est observée qu’à l’intérieur du parasite.La détection d’un azoture in cellulo a été vérifiée par HPLC- MS/MS avec une des sondes.Parmi les sept cyclooctynones obtenues, une sonde forme un adduit triazole fluorescent avec une cinétique acceptable, ce qui constitue le premier exemple de sonde « on-on’ » de cette série et une véritable avancée dans la chimie bio-orthogonale. / The discovery of new molecules with antiparasitic activity is crucial today to fight against infectious diseases such as malaria and HAT since no vaccine is available to cure these diseases. In our search for new antiparasitic compounds, we observed that activity improvement on an isolated target was not seen on parasite. We suspected an ineffective entry of the molecule into the cell to be one of the reasons for these uncorrelated results.To explore this possibility, this PhD work aimed to design, synthetize and evaluate new fluorescent probes that would allow the visualization of drug entry into parasites responsible for HAT and malaria.Our concept is based on “click” chemistry that can be achieved without catalyst, between an azide and a strained alkyne like cyclooctyne (Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition).We synthetized derivatives of dibenzocyclooctynone, a fluorescent molecule described to undergo SPAAC reaction with azides, in order to obtain “on-on’” detection probes. Seven new fluorescent probes were therefore synthetized, among which three of them displayed adequate SPAAC kinetics. Photophysical properties of these molecules were characterized and their penetration into protozoan cells was demonstrated. Fluorescence was only observed in the parasitic cytosol.In cellulo azide detection was achieved and verified by LC- MS/MS with one of our probes.One out of the seven probes formed a fluorescent triazole adduct, which constitutes the first example of an « on-on’ » probe for this series and a real progress in bioorthogonal chemistry.

La leishmaniose est une zoonose à transmission vectorielle due au parasite protozoaire Leishmania ; des co-infections avec plusieurs espèces de Leishmania ont également été rapportées. Il a été démontré que les vésicules extracellulaires (VE) de ce parasite jouent un rôle dans l'infection précoce, ainsi que la propagation de la résistance in vitro aux médicaments. Peu de médicaments anti-Leishmania sont disponibles, et la résistance continue de croître chez ce parasite; il est donc impératif de comprendre la propagation de la résistance aux antileishmaniens. Nous avons exploré la capacité des VE xénogéniques de Leishmania à moduler la physiopathologie de l'infection et la sensibilité du parasite aux médicaments après contact in vivo. La co-inoculation de parasites et de VE provenant de souches/espèces de Leishmania présentant divers profils de résistance aux médicaments a été réalisée chez la souris. La physiopathologie et la charge parasitaire ont été suivies, et des tests de sensibilité aux médicaments effectués. Les résultats ont démontré que les VE de Leishmania infantum influencent la physiopathologie de Leishmania major dans le cadre in vivo. Nous avons également constaté que ces VE modulent la sensibilité aux médicaments de L. major après un contact in vivo dans un modèle d'infection précoce, entraînant une diminution significative de la sensibilité à l’antileishmanien antimoine. Nous démontrons ici pour la première fois que les VE des parasites xénogéniques peuvent participer à la propagation de la résistance aux médicaments entre les populations de parasites après un contact in vivo, ce qui pourrait expliquer en partie l'augmentation des taux d'échec des traitements contre Leishmania. / Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by the protozoan parasite Leishmania, endemic to 98 countries and territories. There are several manifestations of leishmaniasis, some fatal if left untreated. Furthermore, co-infections with multiple species of Leishmania have also been reported. Extracellular vesicles (EVs) from Leishmania have been demonstrated to play a role in early infection, as well as spread of drug resistance in vitro. Few antileishmanial drugs are available, and drug resistance to those in use continues to grow; as such, there is an urgent need to better understand the spread of Leishmania drug resistance. In this study, the ability of xenogeneic Leishmania EVs to modulate infection pathophysiology and parasite drug sensitivity after in vivo contact was explored. Co-inoculation of parasites and purified EVs from strains/species of Leishmania with contrasting drug resistance profiles was performed in BALB/c mice. Pathophysiology and parasite burden were monitored, and drug-susceptibility testing performed on recovered parasites. Results demonstrated that EVs from Leishmania infantum influence pathophysiology of Leishmania major in in vivo experiments. These EVs were also found to modulate drug sensitivity of L. major after in vivo contact in a 6-hour infection model, leading to a highly significant decrease in susceptibility to antileishmanial antimony. Here it is demonstrated for the first time that EVs from xenogeneic parasites can participate directly in propagating drug resistance between parasite populations after in vivo contact. These findings may help explain current observations of rising rates of Leishmania treatment failure.

Toxoplasma gondii, Neospora caninum et Plasmodium falciparum sont des parasites protozoaires intracellulaires obligatoires, respectivement responsables de la toxoplasmose, de la néosporose et du paludisme. Les différents traitements mis en œuvre reposent sur une association médicamenteuse. Cependant, des échecs thérapeutiques et des résistances aux traitements ont été décrits. Notre travail a porté sur l’identification de molécules actives isolées par Chomatographie de Partage Centrifuge (CPC) à partir d’extraits d’écorces d’Anogeissus leiocarpus, un arbre d’Afrique de l’ouest connu pour son activité antipaludique, et de dix arbres de la région Champagne-Ardenne. Nous nous sommes penchés, dans un premier temps, sur l’activité antiparasitaire des fractions obtenues à partir d’extrait d’écorce d’A. leiocarpus. La trachélospérogénine E et l’extrait global sans tanin se sont révélés actifs, notamment en inhibant l’invasion des cellules hôtes par T. gondii. Cet extrait a également préservé la survie des souris atteintes de toxoplasmose chronique. Les mêmes composés naturels ont eu un effet contre N. caninum et P. falciparum. Dans une seconde partie, 30 extraits d’écorces de dix arbres de la région Champagne-Ardenne ont été testés sur T. gondii et N. caninum. Les composés responsables de l’activité antiparasitaire présents chez Alnus glutinosa semblent être la bétuline et ses dérivés. Dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à l’activité de 400 molécules de synthèse de la Pathogen Box. Huit d’entre elles ont eu un effet significatif contre T. gondii, dont trois avec une sélectivité importante. Des expérimentations sont toutefois à réaliser pour N. caninum. / Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Plasmodium falciparum are mandatory intracellular protozoan parasites and are responsible for toxoplasmosis, neosporosis and malaria, respectively. The different treatments used are based on drug combination. However therapeutic failures and drug resistances have been described. Our work focused on the identification of active compounds isolated by Centrifugal Partition Chromatography (CPC) from crude barks extracts from Anogeissus leiocarpus, a West African tree known for its antimalarial activity, and ten trees from the Champagne-Ardenne region. First we studied the activity of the fractions obtained from the crude bark extract from A. leiocarpus. Trachelosperogenin E and the global extract without tannin showed a good activity by inhibiting host cell invasion by T. gondii. The latter was able to preserve mice survival toward chronic toxoplasmosis. These extracts were also active on N. caninum and P. falciparum. In a second part 30 crude barks extracts from ten trees located in the Champagne-Ardenne region were screened on T. gondii and N. caninum. Compounds responsible for the antiparasitic activity found in Alnus glutinosa were especially betulin and its derivatives. In the last part of this study we focused on the antiparasitic activity of 400 synthetic molecules from the Pathogen Box. Eight out of them were significantly efficient against T. gondii, among which three showed an important selectivity. Further experiments must be completed in the case of N. caninum.

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