A fragmentação e a invasão de florestas tropicais e a crescente concentração de assentamentos humanos aumentaram exponencialmente as chances de exposição a vírus emergentes e emergentes. Dado o grande potencial de espalhamento de patógenos em população humanas, a identificação e caracterização de agentes patogênicos circulantes podem melhorar a atenção primária e as capacidades de diagnóstico para um agente emergente futuro. As abordagens moleculares e metagenômicas que utilizam as tecnologias de sequenciação da próxima geração levaram a descoberta e caracterização de muitos vírus emergentes na última década. Além disso, as abordagens in silico também podem ajudar a identificar vírus emergentes usando apenas dados de sequenciamento publicamente disponíveis. Além disso, estimar a ascendência filogenética e até mesmo analisar as mudanças no uso de codons são ferramentas adicionais que podem melhorar a nossa compreensão de vírus emergentes ou reemergentes. Este projeto visou aplicar essas ferramentas em ambos os vírus que poderiam estar circulando no Brasil: Parvovírus B19 e vírus da Febre Amarela. Também exploramos as aplicações de modelos ocultos de Markov e índice de adaptação de codons usando dados publicamente disponíveis. Esperamos que este trabalho forneça uma prova de conceito para futuros projetos metagenômicos e demonstre a utilidade das várias técnicas moleculares e bioinformáticas no estudo de vírus emergentes. / Fragmentation and encroachment of tropical rainforests and the growing concentration of human settlements have exponentially increased chances of exposure to re-emerging and emerging viruses. Given the large potential for pathogens to spillover and spread in a population, identifying and characterizing circulating human pathogens could improve the readiness and diagnostic capabilities for a future emergence. Molecular and metagenomic approaches using next-generation sequencing technologies have led to the discovery and characterization of many emerging viruses over the last decade. In complement, in silico approaches can also help identify emerging viruses using only publicly available sequencing data. Moreover, estimating the phylogenetic ancestry and even analyzing changes in codon usage are additional tools that can improve our understanding of an emerging or re-emerging virus. This project aimed to apply these tools to two viruses that could be circulating in Brazil: Parvovirus B19 and Yellow Fever virus. We also explored the applications of Hidden Markov models and codon adaptation index using publicly available data. We expect this work to provide a proof-of-concept for future metagenomic projects, and demonstrate the utility for several molecular and bioinformatics techniques in the study of emerging viruses.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study reports a serologic survey of the main viral infections of dogs in Santa Maria, RS, Brazil, and the production of cell lines of canine, swine and leporine origin resistant to bovine viral diarrhea virus (BVDV). Canine distemper virus (CDV), parvovirus (CPV), adenovirus (CAV) and coronavirus (CCoV) infections have been associated with significant morbidity and mortality among dogs worldwide. The aim of this study was to determine the prevalence of antibodies against these viruses in the canine population of Santa Maria. To this purpose, 817 blood samples were collected from non-vaccinated dogs of 14 neighborhoods and tested by virus neutralization (CDV, CAV and CCoV) and by hemagglutining inhibition (CPV). Specific antibodies to CDV were detected in 27.3% (223/817) of the samples, to CPV in 68.7% (561/817), to CAV in 43% (353/817) and to CCoV in 50.4% (412/817) of the dogs. These results indicate that CDV, CPV, CAV and CCoV infections are spread among dogs in Santa Maria. However, a significant part of the population is seronegative and therefore unprotected against these viruses. This indicates a need for extending the vaccination programs against these viruses. During the standardization of serologic tests and expansion of cell cultures for virus amplification, the canine MDCK cell line was found to be contaminated with BVDV, the main viral contaminant of cultured cells. The inadverted contamination of cultured cells with BVDV may represent a serious problem for diagnostic virology, research and production of biologicals. The second part of this dissertation reports the production and characterization of three cell lines resistant BVDV, obtained out of each parental cell line (canine MDCK, porcine PK-15 and leporine RK-13) that were contaminated with BVDV. Initially, the cells were submitted to four rounds of infection with a highly cytolytic BVDV strain. The cells surviving infection were then cloned out, expanded and assayed for their susceptibility to BVDV. The resistance to BVDV was investigated by search for viral proteins by immunofluorescence and by cocultivation with susceptible cells following inoculation of BVDV at high titers. All three cell lines were resistant to three standard BVDV strains (Singer, NADL e Oregon) and 10 field isolates. Inoculation of these cells with BVDV at a multiplicity of infection of 10 TCID50/cell resulted in frequencies of infection of <10-5 for MDCK-R and PK-15R cells and of 3,3x10-4 for RK- 13R. Compared to the parental ones, the resistant cells were >10.000 (MDCK-R), >20.000 (PK-15R) and 600 (RK-13R) times less susceptible to BVDV. The inoculation of virus in the resistant cells in the presence of polyethylene-glicol (PEG) resulted in an increase in susceptibility in the order of >437 (MDCK-R), >346 (PK-15R) and 87 (RK-13R) times. These results indicate that the resistance of these cell lines is probably due to a block in viral entry which can be overcome by addition of PEG. On the other hand, each resistant cell line retained the susceptibility to other three viruses of interest which replicate in the parental cells. Thus, these cells may be useful for virology diagnostic, virus propagation and for vaccine production, without the risk of being inadvertedly contaminated with BVDV. / O presente trabalho relata um inquérito sorológico das principais infecções víricas de cães em Santa Maria, RS, Brasil e a obtenção de linhagens celulares de origem canina, suína e leporina resistentes ao vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV). As infecções pelo vírus da cinomose (CDV), parvovírus (CPV), adenovírus (CAV) e coronavírus (CCoV) são importantes causas de morbidade e de mortalidade em cães em todo o mundo. Com o objetivo de determinar a prevalência de anticorpos contra esses vírus na população canina da cidade de Santa Maria, coletou-se amostras de sangue de 817 cães não-vacinados, em 14 bairros. Estas foram testadas pela técnica de soroneutralização (CDV, CAV e CCoV) ou inibição da hemaglutinação (CPV). Anticorpos específicos contra o CDV foram detectados em 27,3% (223/817) das amostras, contra o CPV em 68,7% (561/817), contra o CAV em 43% (353/817) e contra o CCoV em 50,4% (412/817) dos cães. Esses resultados demonstram que esses vírus estão difundidos na população canina dos bairros da cidade. Por outro lado, demonstram também que uma parte considerável da população é soronegativa e, portanto está desprotegida contra esses agentes, indicando a necessidade de se ampliar os programas de vacinação para essas infecções. Durante a padronização das técnicas sorológicas e expansão dos cultivos celulares para amplificação dos vírus, detectou-se a contaminação da linhagem de células caninas MDCK com o BVDV, o principal vírus contaminante de cultivos celulares. A contaminação inadvertida de cultivos celulares com o BVDV pode representar um sério problema para o diagnóstico virológico, pesquisa e produção de imunobiológicos. A segunda parte dessa dissertação descreve a produção e caracterização de três linhagens celulares resistentes ao BVDV, obtidas a partir das células parentais de origem canina (MDCK), suína (PK-15) e leporina (RK-13) que estavam contaminadas com o BVDV. Essas células foram submetidas a quatro ciclos de infecção com uma cepa citolítica de BVDV. As células que sobreviveram a infecção lítica foram clonadas, expandidas e testadas para a sua susceptibilidade ao BVDV e outros vírus de interesse. A resistência ao BVDV foi investigada pela pesquisa de antígenos virais por imunofluorescência indireta e por cocultivo com células susceptíveis após a inoculação do vírus em altos títulos. As três linhagens celulares demonstraram ser resistentes a três cepas-padrão (Singer, NADL e Oregon) e a 10 isolados de campo do BVDV. A inoculação do BVDV nessas células com uma multiplicidade de infecção de 10 DICC50/célula resultou em freqüências de infecção de <10-5 para as células MDCK-R e PK-15R; e de 3,3x10-4 para as células RK-13R. Comparando-se com as células parentais, verificou-se que as linhagens resistentes são >10.000 (MDCK-R), >20.000 (PK-15R) e 600 (RK-13R) vezes menos susceptíveis ao BVDV. A inoculação do vírus nas células resistentes na presença de polietilenoglicol (PEG) resultou em um aumento na susceptibilidade dessas células na ordem de >437 (MDCK-R), >346 (PK-15R) e 87 vezes (RK-13R). Esses resultados indicam que a resistência dessas linhagens ao BVDV reside em um bloqueio na penetração do vírus, que pode ser parcialmente revertido pela adição do PEG. Por outro lado, cada linhagem resistente conservou a susceptibilidade a outros três vírus que replicam nas células parentais. Essas características tornam essas linhagens celulares potencialmente úteis para o diagnóstico, amplificação de vírus e produção de vacinas, sem o risco de contaminação acidental com o BVDV.