Débutée en 2005, l'ère du pangénome a connu un important essor ces dernières années, notamment grâce aux progrès des techniques de séquençage haut débit. Le pangénome, qui est divisé en deux grandes parties, le core génome et le génome accessoire, offre un grand éventail d'utilisation. Au cours de ces trois dernières années, nous avons étudié cette gamme de possibilités en nous basant sur des pathogènes humains tel que Coxiella burnetii, Kingella kingae et Bacillus anthracis. Ainsi, outre la découverte d'une nouvelle espèce de Kingella et l'étude de quelques génomes spécifiques, nous nous sommes attardés sur le lien entre pangénome et pathogénicité, sur l'importance des SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), ainsi que sur la corrélation entre pangénome et taxonomie et donc, par extension, nous avons étudié la notion d'espèce bactérienne. / The pangenome area began in 2005 and had known a huge increase thanks to the improvement of the Next Generation Sequencing methods. The pangenome, which is divided into two parts, the core and the accessory genome, offer a large panel of uses. During the last three years, we have studied all these possibilities. We based our work on human pathogens as Coxiella burnetii, Kingella kingae and Bacillus anthracis. Thus, in addition to the discovery of a new Kingella species and the study of some specific genomes, we studied in details the link between pangenome and pathogenicity, the importance of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) and the correlation between pangenome and taxonomy. Finally, we worked on the bacterial species definition.

La pathogénicité des bactéries a toujours été attribuée à des facteurs de virulence et les bactéries pathogènes sont considérées comme étant mieux armées, comparé à des bactéries ne provoquant pas de maladies. Selon les premières études génomiques, le fait de supprimer un certain nombre de gènes des bactéries pathogènes, limiterait leur capacité à infecter leurs hôtes. Au contraire, des études de génomique comparatives récentes, démontrent que la spécialisation des bactéries dans les cellules eucaryotes est associée à une perte de gènes massive, en particulier pour les endosymbiontes allopatriques qui sont isolés depuis longtemps dans une niche intracellulaire. En effet, les bactéries sympatriques, extracellulaires, ont souvent des génomes plus grands et présentent une résistance et une plasticité plus importante. Ces bactéries constituent, de fait, plutôt des complexes d’espèces que de vraies espèces. Certaines bactéries spécialistes, comme les bactéries pathogènes, arrivent à s’échapper de ces complexes et à coloniser une niche, bénéficiant alors d’un nom d’espèce. Leur spécialisation leur permet de devenir allopatriques et leurs pertes de gènes favorisent une évolution réductive. Ces observations nous ont conduits à réaliser une étude afin de quantifier le taux de perte de gènes lors de l’évolution de ces bactéries extracellulaires vers celle de bactéries spécialistes intracellulaires. Notre objectif était de vérifier que ce qui caractérise l’évolution des bactéries intracellulaires est bien la réduction génomique, en prenant en compte tous les événements possibles de gains de gènes. Par ailleurs, dans une étude neutre comparant les 12 espèces pandémiques les plus dangereuses pour l’homme avec les espèces non-épidémiques les plus proches, nous avons voulu identifier des spécificités génomiques associées à la capacité virulente de bactéries pathogènes et démontrer que, à part les toxines et les modules toxine-antitoxine, ce qui caractérise ces espèces ce ne sont pas les facteurs de virulence, mais la perte des gènes de régulation. Au final, les bactéries pathogènes ont un répertoire virulent dans lequel les gènes absents sont aussi importants que les gènes présents. / The virulence of pathogenic bacteria has been attributed to virulence factors and pathogenic bacteria are considered to have more genes compared to bacteria that do not cause disease. According to the first genomic studies, removing a certain number of genes from pathogenic bacteria impairs their capacity to infect hosts. However, more recent studies have demonstrated that the specialization of bacteria in eukaryotic cells is associated with massive gene loss, especially for allopatric endosymbionts that have been isolated for a long time in an intracellular niche. Indeed, bacteria living in sympatry often have bigger genomes and exhibit greater resistance and plasticity and constitute species complexes rather than true species. Specialists, including specific pathogenic bacteria, escape these bacterial complexes and colonize a niche; thereby gaining a species name. Their specialization allows them to adopt allopatric lifestyle and experience reductive genome evolution. These observations led us to design a study to quantify the rate of gene losses during the evolution of free-living bacteria to intracellular specialists. Our objective was to verify that what characterizes the evolution of intracellular bacteria is genomic reduction, taking under consideration all possible gene gain events. Furthermore, in another neutral study comparing the 12 most dangerous pandemic bacteria to Humans to their closest non-epidemic species, we wished to identify any genomic specificities associated to the virulent capacity of pathogenic bacteria and demonstrate that, besides toxins and surprisingly, toxin-antitoxin modules, pathogenic bacteria are not characterized by more virulence factors, but rather by a loss of regulatory genes. Finally, virulent bacteria exhibit a genomic repertoire in which absent genes are as important as present ones.

L’étude, la détection et l’identification de pathogènes est une problématique majeure pour la sécurité alimentaire et la médecine. Cependant, les pathogènes bactériens présents à de faibles concentrations nécessitent souvent une période de plus de 36h pour être identifiés par les méthodes standards. Ce délai est extrêmement contraignant pour des domaines où la rapidité du diagnostic est un facteur clé. Il y a donc une forte demande pour le développement d’outils pour mieux comprendre le comportement bactérien et ainsi développer des techniques de détection plus rapides et plus performantes.Les systèmes d’imagerie SPR sont largement utilisés pour l’analyse d’interactions moléculaires, car ils permettent une mesure en parallèle, en temps réel et sans marquage, tout en étant faciles d’utilisation et compatibles avec des milieux complexes. Cette technique a montré son efficacité pour l'étude et la détection de bactéries en utilisant les interactions moléculaires avec les anticorps, mais les délais de détection restent pénalisants.Dans ce contexte, un nouveau système d’imagerie permettant l’étude et la détection spécifique de pathogènes bactériens performant est développé en mettant à profit les avancées récentes en imagerie SPR optimisée en résolution. Notre système permet d'améliorer les temps de détection de pathogènes en milieux modèles grâce à sa capacité à détecter des bactéries individuelles. Il peut également être utilisé pour l'étude de l'interaction entre bactéries et surfaces spécifiques. Des premiers tests montrent que notre instrument est capable de caractériser le comportement bactérien de plusieurs souches bactériennes en interaction avec des surfaces fonctionnalisées par des espèces chimiques différentes / The study, detection and identification of pathogens is a major issue for food safety and medicine. However, bacterial pathogens present at low concentrations often require a period of more than 36 hours to be identified by standard methods. This delay is extremely constraining for areas where rapid diagnosis is a key factor. There is therefore a strong demand for the development of tools to better understand bacterial behavior and thus develop faster and more efficient detection techniques.SPR imaging systems are widely used for the analysis of molecular interactions, as they allow parallel, real-time and unlabeled measurement, while being easy to use and compatible with complex media. This technique has proven effective in the study and detection of bacteria using molecular interactions with antibodies, but detection times remain penalizing.In this context, a new imaging system allowing the study and specific detection of high-performance bacterial pathogens is being developed, taking advantage of recent advances in SPR imaging optimized in resolution. Our system improves pathogen detection times in model environments through its ability to detect individual bacteria. It can also be used to study the interaction between bacteria and specific surfaces. Initial tests show that our instrument is capable of characterizing the bacterial behaviour of several bacterial strains in interaction with surfaces functionalized by different chemical species.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

Le phénomène de multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif causant des infections sévères du sang est un problème mondial grandissant. La détection du niveau de sensibilité aux antibiotiques avec des tests phénotypiques requière un minimum de 48 h avant l'obtention des résultats. Il est donc nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires pour améliorer le traitement des septicémies. Ce mémoire de maîtrise présente le développement d'un test de diagnostic moléculaire permettant la détection rapide des gènes de résistance aux antibiotiques cliniquement importants associés aux bactéries à Gram positif causant des septicémies. Ce test comprend 4 essais PCR multiplex combinés à une hybridation microfluidique sur puces à ADN intégrées à un disque compact. Les corrélations obtenues entre les résultats génotypiques et phénotypiques étaient de 98% pour les P-lactamines et de 100% pour la vancomycine, la clindamycine et la gentamicine. Cette approche moléculaire pourrait éventuellement être utilisée pour le diagnostic clinique afin de guider l'antibiothérapie des patients atteints d'une septicémie.

Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida est un agent pathogène aquatique causant la furonculose chez les salmonidés, particulièrement les poissons d’élevage. L'antibiothérapie est la méthode couramment utilisée pour traiter cette maladie dans le monde entier. Toutefois, son efficacité est menacée par l’apparition de souches résistantes, voire multirésistantes, aux antibiotiques. L’étude de ces souches bactériennes devient donc nécessaire afin d’identifier les éléments génétiques responsables de ces résistances et comprendre comment ils contribuent à la propagation de l’antibiorésistance. C’est dans cette démarche que se positionne la présente étude qui a pour objectif de caractériser de nouveaux éléments génétiques porteurs de résistances aux antibiotiques chez A. salmonicida ssp. salmonicida à l’aide du séquençage à longues lectures. Plus spécifiquement, au centre de ce projet se trouve la souche SHY16-3432 dont l’étude a permis d’identifier trois nouveaux variants de plasmides nommés pAsa9b, pAsa5-3432 et pRAS3-3432, où ces deux derniers confèrent les résistances aux antibiotiques observées. L’analyse des séquences de ces trois variants a révélé qu’ils se distinguent tous de leur contrepartie classique par leur contenu en éléments génétiques mobiles. Le plasmide pAsa5-3432 possède une nouvelle région de multirésistances composée de plusieurs éléments génétiques mobiles. Celle-ci semble avoir été acquise à la suite d’une recombinaison entre deux plasmides. De son côté, pRAS3-3432 porte un nouvel élément inséré qui a uniquement été identifié chez l’agent pathogène porcin Chlamydia suis. Quant à pAsa9b, il se différencie du plasmide de référence par l’absence d’une séquence d’insertion. Ces découvertes soulignent ainsi l’importance des éléments mobiles sur la plasticité génomique d’A. salmonicida ssp. salmonicida ainsi que sa grande capacité d’interactions avec d’autres bactéries incluant des agents pathogènes animaux. En outre, les données obtenues dans ce projet suggèrent qu’il est nécessaire d’utiliser le séquençage à lectures longues pour caractériser complètement le génome de bactéries au plasmidome complexe comme A. salmonicida ssp. salmonicida. / Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida is an aquatic pathogen that causes furunculosis to salmonids, especially in fish farms. Antibiotherapy is a common method used to treat this worldwide disease. Unfortunately, its effectiveness is becoming limited due to the presence of drug-resistant strains and even multidrug-resistance strains of the bacterium. The study of these bacterial strains becomes necessary in order to identify the genetic elements responsible for this resistance and to understand how they contribute to the spread of antibiotic resistance. In this study, we focused on the A. salmonicida subsp. salmonicida strain SHY16-3432 to characterize novel genetic elements conferring resistance to antibiotics using long-read sequencing technologies. It allowed us to identify three novel plasmid variants named pAsa9b, pAsa5-3432 and pRAS3-3432, the latter two being responsible for the observed antibiotic resistance. The sequence analysis of these three variants revealed that they all differ from their classical counterparts through the presence or absence of mobile genetic elements. The plasmid pAsa5-3432 carries a new multi-drug resistance region composed of numerous mobile genetics elements that appears to have been acquired through plasmid recombination. As for pRAS3-3432, it contains a new inserted element that has only been reported in the swine pathogen Chlamydia suis. Lastly, the only variation between pAsa9b and the reference plasmid is the absence of an insertion sequence in pAsa9b. Overall, these discoveries highlight the significant implication of mobile genetics elements in the genomic plasticity of A. salmonicida subsp. salmonicida and suggest that this aquatic bacterium has a high capacity to interact with other bacteria, including animal pathogens. Furthermore, the data obtained suggest that the use of long-read sequencing technologies is required to fully decipher the genome of bacteria possessing complex plasmid repertoire, such as A. salmonicida subsp. salmonicida.

Les norovirus sont les principaux agents responsables des gastroentérites aiguës d'origine virale à travers le monde, pouvant être transmis par des aliments contaminées. La quantité de particules virales retrouvée dans les aliments dépasse rarement la dose minimale infectieuse. Une étape de concentration s'avère nécessaire pour la détection de ces virus dans les aliments. L'objectif de ce projet était de développer et de valider une méthode de concentration immuno-magnétique combinée à l'amplification en temps réel pour une détection spécifique et sensible des norovirus. Une séquence peptidique caractéristique de la capside virale a été sélectionnée pour la production d'anti-norovirus spécifiques du génogroupe II. Les anticorps couplés à des billes magnétiques ont été utilisés pour concentrer les norovirus à partir d'aliments artificiellement contaminés. Les norovirus capturés ont été lysés et l'ARN viral libéré a été détecté par RT-PCR en temps réel. Les norovirus ont été détectés à une concentration de 20 unités RT-PCR.

ChuS est une protéine provenant d'une bactérie pathogène de l'humain qui a la capacité de lier et de dégrader l'hème de l'hôte pour en libérer le fer nécessaire à la croissance bactérienne. Deux résidus potentiellement importants du site actif, l'arginine 100 (R100) et l'acide aspartique 191 (D191) ont été investigués afin de mieux comprendre leur rôle dans la catalyse par ChuS. Nos résultats révèlent que le résidu D191 n'est pas essentiel à l'activité catalytique, mais qu'il est important pour la stabilité du complexe entre l'enzyme et l'un de ses substrats (hème) alors que le résidu R100 est absolument essentiel à l'activité catalytique. Nos études cinétiques et spectroscopiques détaillées fournissent des informations qui permettent de mieux comprendre le mécanisme catalytique de ChuS. Elles aident ainsi à obtenir une meilleure compréhension des voies d'acquisition de l'hème comme source de fer chez les bactéries pathogènes et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

En considérant la problématique grandissante des résistances bactériennes, cette étude avait pour but d’évaluer l’utilisation des antibiotiques et des tests diagnostiques microbiens en thérapie parodontale afin de vérifier si les pratiques cliniques actuelles des parodontistes canadiens concordent avec la littérature disponible. La collecte de données a été effectuée par l’entremise d'un questionnaire électronique acheminé par courriel et rempli de façon anonyme. Parmi les 322 parodontistes contactés, 64 ont participé à cette étude. Un taux de participation de 19,88 % a alors été atteint. Les résultats obtenus ont révélé que 59,38 % des parodontistes canadiens utilisent les antibiotiques locaux. Toutefois, les participants rapportent y avoir recours rarement et principalement pour la prise en charge de la parodontite réfractaire (39,47 %) et la parodontite chronique sévère localisée (21,05 %). D’ailleurs, la minocycline est l’antibiotique local le plus fréquemment utilisé. Pour ce qui est de l’antibiothérapie systémique, la majorité des parodontistes canadiens ont démontré des pratiques cliniques similaires pour les différentes conditions parodontales évaluées, et ce, autant pour les fréquences d’utilisation que les choix d’antibiotiques. La combinaison d’amoxicilline et de métronidazole est l’antibiothérapie systémique sélectionnée le plus fréquemment pour différentes conditions parodontales. Finalement, 82,81 % des participants n’utilisent jamais les tests diagnostiques microbiens dans leur pratique et cette non-utilisation a été justifiée par l’absence d’avantages associés à leur utilisation. En conclusion, une certaine similarité entre les habitudes de pratique a été dénotée pour l’antibiothérapie et les tests diagnostiques. Ainsi, en ce qui a trait à l’utilisation globale de l’antibiothérapie, les parodontistes canadiens respectent les évidences scientifiques actuelles. Pour ce qui est des tests diagnostiques, l’absence de littérature démontrant clairement les bénéfices cliniques d’avoir recours à ce type de test en thérapie parodontale a été reflétée par la faible utilisation de ceux-ci rapportée dans ce projet. / Considering the emerging problem of bacterial resistance, this study was designed to evaluate the use of antibiotics and microbial diagnostic tests in periodontal therapy to determine whether the current clinical practices of Canadian periodontists are consistent with available literature. The data were collected through an electronic questionnaire sent by email and completed anonymously. There are 64 of the 322 periodontists contacted who participated in this study. A participation rate of 19.88 % was then obtained. The results show that 59.38 % of periodontists practicing in Canada use local antibiotics. However, participants mentioned using it rarely and mainly for the management of refractory periodontitis (39.47 %) and localized severe chronic periodontitis (21.05 %). Moreover, minocycline is the most frequently used local antibiotic. For systemic antibiotic therapy, the majority of Canadian periodontists demonstrated similar clinical practices. In fact, similarities were observed for frequency of use and antibiotic choice in various periodontal conditions evaluated. The combination of amoxicillin and metronidazole is the most frequently selected systemic antibiotic therapy for different periodontal conditions. Finally, 82.81 % of participants never use microbial diagnostic tests in their practice and this non-use was justified by the lack of benefits associated with these tests. In conclusion, a certain similarity between the practice habits was denoted for antibiotic therapy and diagnostic tests. Thus, the overall use of antibiotic therapy by Canadian periodontists respects current scientific evidence. The low use of diagnostic tests reported in this project reflects the lack of literature clearly supporting the clinical benefits of using these tests in periodontal therapy.