Pathogenic E. coli infections cause approximately one quarter of disease losses in commercial turkey flocks. A small subgroup of E. coli causes most infections. Epidemiologic studies of this disease have been hindered by a lack of reliable markers to discriminate between pathogenic and fecal E. coli and by the diversity of poultry strains. Reliance on antimicrobials to control E. coli infections has caused widespread antimicrobial resistance. One hundred five clinical E. coli were obtained, and 1104 isolates were collected from fecal specimens of 20 flocks in an integrated turkey operation. Biochemical fingerprinting and antimicrobial susceptibility tests were performed on all isolates, and somatic antigen serologic testing and PCR for potential virulence genes were conducted on 299 strains including all clinical isolates and fecal isolates that had similar traits to clinical isolates. Most avian E. coli infections were caused by a few clonal strains that were uncommon in normal fecal flora. The potential virulence genes iss, K1 and tsh were detected more frequently among clinical than fecal isolates; however, the pattern of occurrence did not suggest that these genes were useful markers for identifying pathogenic strains. Syndromes consistent with colibacillosis were the most commonly reported illness and principal rationale for antimicrobial therapy in sampled flocks. Most clinical E. coli isolates were resistant to gentamicin, sulfamethoxazole and tetracycline. Although resistance to fluoroquinolones and β-lactam antibiotics occurred less frequently, the potential for resistance to emerge to these antimicrobials was evident. A Bayesian model to estimate sample size confirmed the diversity of avian fecal E. coli strains. Studies are needed to define risk factors for infection with and identify markers for avian pathogenic E. coli strains. These research priorities are complementary and may lead to the identification of new interventions to prevent this important infectious disease of poultry. / Ph. D.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:50:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_Flavio_M.pdf: 7271586 bytes, checksum: 61c4ca3b97e4b7443d820cd714394fa8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Os objetivos desta pesquisa foram observar a incidência de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica clásssica (EPEC) e E. coli invasora (EIEC) em alimentos e estudar algumas de suas propriedades. Foram estudadas 360 amostras de alimentos, de origem animal e vegetal, das quais foram isoladas 1351 cepas diferentes de E.coli. Todas foram sorotipadas para investigação daquelas pertencentes aos sorogrupos enteropatogênicos clássicos, e as cepas imóveis e lisinadescarboxilase negativas sorotipadas para identificação daquelas pertencentes aos sorogrupos invasores. A capacidade de produção das enterotoxinas LT e ST de todas as cepas de E. coli foi também investigada. As amostras patogênicas isoladas corresponderam a 1,6 do total de cepas de E.coli estudado. Os alimentos de onde foram isolados representaram 4,2% do total de amostras de alimentos estudados e 5,2% das amostras de alimentos contendo E. coli. Não foram isoladas amostras de EIEC nas amostras de alimentos estudadas. As amostras de EPEC isoladas pertenceram aos sorogrupos 026 e 0125. Entre as amostras de ETEC isoladas predominaram aquelas produtoras somente da toxina LT, não tendo sido isoladas amostras capazes de produzir as toxinas LT e ST simultaneamente. Nenhuma das amostras de ETEC pertenceu aos sorogrupos enterotoxigênicos mais frequentes, nem possuiu os fatôres de colonização CFA/I e CFA/II. No teste de resistência a drogas, a maioria das amostras enteropatogênicas mostrou-se sensível às drogas utilizadas. O modelo de fermentação de açúcares foi relativamente uniforme entre estas amostras, e bastante semelhante ao apresentado pelo gênero Escherichia. / The objectives of this research work were to study the incidence of enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic. E.coli (EPEC) and invasive E. coli (EIEC) in foods, and to study some of their properties. 360 food samples, both of animal and plant origin, were studied and 1351 different E. coli strains were isolated. All of them were serotyped in order to identify those belonging to the serogroups enteropathogenic for children (EPEC). The strains which were non-motile and lysine descarboxylase negative were serotyped for the identification of those belonging to invasive serogroups. The capacity of all strains in producing enterotoxins ST and LT was also investigated. The isolated pathogenic strains corresponded to 1,6% of the E. coli strains tested. The foods from which they were isolated represented 4,2% of the total of food samples tested, and 5,2% of the food samples showing contamination with E. coli. No invasive strain was observed in the food samples tested. The isolated EPEC strains belonged to serogroups 026 and 0125. There was a prevalence of enterotoxin LT only producing strains among the ETEC ones, and no strain able to produce both enterotoxins LT and ST simultaneously was observed. None of them belonged to the usual enterotoxigenic serogroups, nor had colonization factors CFA/I and CFA/II. The antibiotic resistence test showed that the majority of pathogenic strains were sensitive to the drugs employed. The sugar fermentation model was relatively uniform among these strains, and very smilar to the one showed by the genus Escherichia.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Palma Sircili / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T16:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_VictorGoncalves_M.pdf: 5059455 bytes, checksum: b3305e2d1e0d658292aa1e194e68fb8f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causa diferentes tipos de infecções sistêmicas extraintestinais nestes hospedeiros, coletivamente denominadas colibaciloses, causando grandes prejuízos econômicos à indústria aviária. Essas doenças incluem, dentre outras, septicemia, onfalite, celulite e síndrome da cabeça inchada. Entretanto, não há até o momento wna descrição de genes ou características que permitam classificar as linhagens aviárias em patótipos responsáveis por causar doenças específicas em seus hospedeiros, a semelhança do que ocorre para linhagens de E. co/i patogênicas para seres humanos. O objetivo deste estudo foi caracterizar linhagens de Escherichia coli de origem aviána representantes de 4 grupos, sendo um grupo de linhagens comensais (AFEC - stgla em inglês para "Avian Fecal Escherichia co/i") e três grupos de linhagens patogêmcas, causadoras de três sindromes diferentes em seus hospedeiros (septicemia, síndrome da cabeça inchada e onfalite). Para o trabalho, as características biológicas estudadas foram: adesão em células eucarióticas, formação de biofilme, produção de molécula sinalizadora de quorum sensing, presença de genes de ilhas de patogenicidade, dose de letalidade (LD50), grupo filogenético e presença de genes de virulência. A comparação entre as diferentes linhagens com base nestes traços genotípicos e fenotípicos, por meio de diferentes ferramentas de estatística multivariada além de redes complexas, permitiu inferir a estrutura populacional do grupo estudado. Os resultados indicam que APEC não constitui um grupo homogêneo, mas um conjunto estruturado de diferentes subgrupos, cada um associado a uma síndrome infecciosa específica causada no hospedeiro, possivelmente definindo diferentes patótipos ou subpatótipos dentro de linhagens APEC. Assim, sugerimos a existência de um subpatótipo associado à onfalite, com características de letal idade semelhantes as de linhagens AFEC, mas com um padrão de adesão diferente, que pode ser atribuído a uma especialização do grupo relacionada a colonização de um nicho particular, o saco da gema do ovo. E um subpatótipo associado à síndrome da cabeça inchada, igualmente adaptado à patogenicidade, mas com características mais "agressivas" evidenciadas pelos altos índices de letalidade, grande número de genes de virulência e altos índices de adesão. Linhagens associadas à septicemia, contudo, não constituem um grupo coeso, sugerindo tratar-se de uma miscelânea de linhagens que podem pertencer a diferentes subpatótipos e que em última instância geram a síndrome sistêmica (septicemia), devido à evolução do quadro clínico e/ou às condições imunológicas do hospedeiro. Este trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de subpatótipos dentro de linhagens APEC, relacionando diferentes síndromes infecciosas com grupos específicos de linhagens as quais possuem características fenotípicas e genotípicas particulares. Tais resultados abrem novas possibilidades no estudo de genes responsáveis pelos diferentes processos de patogênese em APEC, bem como no desenvolvimento de vacinas. Talvez seja importante considerar estes subgrupos no desenvolvimento de vacinas, com o intuito de produzir vacinas com proteção cruzada, o que ainda não foi atingido com sucesso para linhagens APEC. / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause different types of systemic extraintestinal infections in poultry, which are collectively termed colibacillosis, imposing significant economic casses for the avian industry Among these diseases are septicaemia, omphalitis, cellulites and swollen head syndrome. However, to the date, there is no description of genes or characteristics which allow us to classify avian strains in pathotypes responsible for causing specific diseases in their hosts, as there are for human pathogenic E. co/i strains. In this study we aimed to characterize avian pathogenic E. co/i strains representing 4 groups, one of commensal strains (AFEC - Avian Fecal Escherichia co/i) and 3 groups of pathogenic strains responsible for causing 3 different syndromes in their hosts (septicaemia, omphalitis and swollen head syndrome). The biological characteristics studied were: adhesion to eukaryotic cells, biofilm formation, capacity of synthesizing quorum sensing s1gnaling molecule, presence of pathogenicity island, pathogenicity levels according to lethal dose (50%) assay, phylogenetic group and presence of virulence genes. The comparison between strains based on these genotypic and phenotypic traits, by different multivariate statistics tools and complex network, allowed us to infer. the population structure of the studied group. The results indicate that APEC do not constitute a unique homogeneous group, but a structured set of different subgroups, each one associated to a specific infectious syndrome inflicted to the host, possibly defining pathotypes or subpathotypes within APEC strains. Thus, we suggest the existence of a subpathotype associated to omphalitis, with lethality characteristics similar to AFEC strains, but with a different adhesion pattem, which may be due to a specialization related to the colonization of a particular niche, the egg's yolk sac. Anda subpathotype associated to the swollen head syndrome, equally adapted to pathogenicity, but with more "aggressive" characteristics demonstrated by the high lethality and adhesion levels. Septicaemic strains, however, do not constitute a cohesive group, which suggests a constellation of strains associated to different subpathotypes and capable of, eventually, cause a systemic syndrome (sepsis), due to the clinical evolution of the illness ami/or host immunological conditions. This work is pioneer in demonstrating the existence of subpathotypes within APEC strains, relating different infectious syndromes to specific groups of strains possessing particular genotypic and phenotypic characteristics. These results offer new possibilities in studying the genes responsible for different pathogenesis processes within APEC and for the vaccine developing. It may be important to consider these subgroups in the process of vaccine developing, in the efforts for obtain cross protection, which had not yet being accomplished successfully concerning APEC strains. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Os objetivos desta pesquisa foram observar a incidência de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica clásssica (EPEC) e E. coli invasora (EIEC) em alimentos e estudar algumas de suas propriedades. Foram estudadas 360 amostras de alimentos, de origem animal e vegetal, das quais foram isoladas 1351 cepas diferentes de E.coli. Todas foram sorotipadas para investigação daquelas pertencentes aos sorogrupos enteropatogênicos clássicos, e as cepas imóveis e lisinadescarboxilase negativas sorotipadas para identificação daquelas pertencentes aos sorogrupos invasores. A capacidade de produção das enterotoxinas LT e ST de todas as cepas de E. coli foi também investigada. As amostras patogênicas isoladas corresponderam a 1,6 do total de cepas de E.coli estudado. Os alimentos de onde foram isolados representaram 4,2% do total de amostras de alimentos estudados e 5,2% das amostras de alimentos contendo E. coli. Não foram isoladas amostras de EIEC nas amostras de alimentos estudadas. As amostras de EPEC isoladas pertenceram aos sorogrupos 026 e 0125. Entre as amostras de ETEC isoladas predominaram aquelas produtoras somente da toxina LT, não tendo sido isoladas amostras capazes de produzir as toxinas LT e ST simultaneamente. Nenhuma das amostras de ETEC pertenceu aos sorogrupos enterotoxigênicos mais frequentes, nem possuiu os fatôres de colonização CFA/I e CFA/II. No teste de resistência a drogas, a maioria das amostras enteropatogênicas mostrou-se sensível às drogas utilizadas. O modelo de fermentação de açúcares foi relativamente uniforme entre estas amostras, e bastante semelhante ao apresentado pelo gênero Escherichia. / The objectives of this research work were to study the incidence of enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic. E.coli (EPEC) and invasive E. coli (EIEC) in foods, and to study some of their properties. 360 food samples, both of animal and plant origin, were studied and 1351 different E. coli strains were isolated. All of them were serotyped in order to identify those belonging to the serogroups enteropathogenic for children (EPEC). The strains which were non-motile and lysine descarboxylase negative were serotyped for the identification of those belonging to invasive serogroups. The capacity of all strains in producing enterotoxins ST and LT was also investigated. The isolated pathogenic strains corresponded to 1,6% of the E. coli strains tested. The foods from which they were isolated represented 4,2% of the total of food samples tested, and 5,2% of the food samples showing contamination with E. coli. No invasive strain was observed in the food samples tested. The isolated EPEC strains belonged to serogroups 026 and 0125. There was a prevalence of enterotoxin LT only producing strains among the ETEC ones, and no strain able to produce both enterotoxins LT and ST simultaneously was observed. None of them belonged to the usual enterotoxigenic serogroups, nor had colonization factors CFA/I and CFA/II. The antibiotic resistence test showed that the majority of pathogenic strains were sensitive to the drugs employed. The sugar fermentation model was relatively uniform among these strains, and very smilar to the one showed by the genus Escherichia.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:45:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rojas_ThaisCabreraGalvao_D.pdf: 2609032 bytes, checksum: 23a0546c76c17eff8087d0160c69308d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A bactéria Escherichia coli coloniza o trato intestinal de aves e humanos, de maneira comensal sem causar processos infecciosos. No entanto alguns clones adquiriram fatores de virulência específicos, permitindo o desenvolvimento de diferentes doenças como infecção do trato urinário, diarréia e meningite em humanos e colibacilose em aves. As linhagens que causam doença em aves são tipicamente denominadas APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). Neste trabalho foram sequenciados e anotados os genomas de quatro linhagens APECs (SCI-07, SEPT362, S17 e O8)que, juntamente com mais nove genomas referentes a linhagens de Escherichia coli patogênicas para aves e patogênicas para humanos foram utilizados para a busca de genes sob seleção positiva. Os genes homólogos foram agrupados,e posteriormente submetidos ao alinhamento de códons e das sequencias protéicas correspondentes. Uma árvore filogenética foi gerada para cada grupo de proteínas homólogas. Testes estatísticos determinaram qual entre os modelos de seleção neutra ou seleção positiva melhor explicou os dados existentes (alinhamentos de códons e árvores filogenéticas). Essas análises detectaram duzentas e cinquenta e quatro grupos de genes homólogos com evidência de seleção positiva. Para cada grupo foi realizado um teste de recombinação para verificar se o aumento na variação das sequencias não era devido à conversão gênica, resultando em cento e dezesseis grupos de genes homólogos sob seleção positiva. A proteína correspondente a um gene de cada grupo de genes homólogos foi identificada, por meio da ferramenta Blast. Diversos fatores de virulência, já conhecidos, e proteínas regulatórias puderem ser detectados. Os genes sob seleção positiva, também foram submetidos à anotação considerando o termo GO (Gene Ontology),apenas da categoria processo biológico. Dos cento e dezesseis genes apenas cinquenta e sete puderam ser identificados por meio dessa metodologia. O resultado da classificação dos genes dentro da classe GO, considerando o terceiro nível hierárquico,mostrou que a maioria dos genes anotados (31) tinha relação com o metabolismo primário.As proteínas cuja identificação, por meio do blast, não foi possível (proteínas hipotéticas)foram submetidas à análise de predição de localização subcelular e de peptídeo sinal. Essas análises revelaram que três proteínas desconhecidas (hypothetical proteinECIAI39_1028, hypothetical proteinZ0639e hypothetical proteinEC042_3791) são potenciais alvos para estudos que visam à busca de novos fatores de virulência de Escherichia coli patogênicas / Abstract: The bacterium Escherichia coli colonizesthe intestinal tract of birds and humans, in a commensal relationship without causing infection. However, some clones have acquired specific virulence factors allowing the development of various diseases such as urinary tract infection, diarrhea and meningitis in humans and colibacillosis in poultry. The strains that cause disease in birds are typically named APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). In this study we sequenced and annotated the genomes of four APECs strains (SCI-07, SEPT362, S17 and O8). These genomes and nine others avian pathogenic Escherichia coli and humans pathogenic strains genomes were used for studying genes under positive selection. The homologous genes were grouped and then subjected to codons and corresponding protein sequences alignment. A phylogenetic tree was generated for each group of homologous proteins. Statistical tests determined which among neutral or positive selection models best explains the existing data (codon alignments and phylogenetic trees). This analyzes detected two hundred fifty-four groups of homologous genes with positive selection evidence. For each group a recombination test was conducted to verify if the variation increase in the sequences was not due to gene conversion, resulting in one hundred and sixteen groups of homologous genes under positive selection. The protein corresponding to a gene of each group of homologous genes under positive selection was identified through Blast tool. Genes under positive selection were annotated considering the GO term (Gene Ontology), just for the biological process category. Only fifty-seven genes could be identified using this methodology. The gene classification within the GO classes, considering only the third hierarchical level showed that most of the annotated genes (31) were related with the primary metabolism. Proteins which blast identification was not possible (hypothetical proteins) were subjected to sub cellular localization and signal peptide prediction analyzes. These analyzes revealed that three unknown proteins (hypothetical protein ECIAI39_1028, hypothetical protein Z0639e hypothetical protein EC042_3791) are potential targets for studies, in order to search for new virulence factors of pathogenic Escherichia coli / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Avian pathogenic Escherichia. coli (APEC) and Campylobacter are pathogenic threats to poultry and human health, respectively. In this study, the prevalence of these pathogens in Mississippi broilers and their antimicrobial resistance (AMR) properties were investigated, and a multidrug-resistant APEC strain (APEC-O2-MS1170) was further explored by whole-genome sequencing (WGS). The efficacy of in ovo injection of Lactobacillus in reducing the APEC in broilers was evaluated. Results revealed a high prevalence of APEC and Campylobacter in broilers and broiler products. A lot of isolates were resistant to antibiotics of different sorts. Moreover, the in ovo administration of Lactobacillus did not reduce the incidence of APEC. The WGS of APEC-O2-MS1170 revealed its detailed AMR and virulence properties and alerted a potential zoonotic risk. In conclusion, the Lactobacillus did not reduce the incidence of APEC in broilers, and the prevalence and AMR of APEC and Campylobacter are still challenges faced by the poultry industry.

No description available.

Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.