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Avaliação do efeito vascular da terapia fotodinâmica empregando derivados de porfirina e clorina na membrana corioalantóica / Evaluation of vascular effect of photodynamic therapy using porphiryn and chlorin derivates in the chorioallantoic membrane

Buzzá, Hilde Harb 10 February 2012 (has links)
A Terapia Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Therapy - PDT) é uma técnica indicada para o tratamento local de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos. A PDT consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, resultando na transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula, levando à destruição do tecido. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM) é uma opção para o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia, além de permitir o estudo na variação de diversos parâmetros associados com a PDT e seus efeitos. Nesse estudo foram investigados um composto derivado de porfirina e um derivado de clorina. Esses fotossensibilizadores foram administrados topicamente e por via intravenosa, sendo variados diversos parâmetros. No primeiro caso, o tempo de incubação foi variado entre 20 e 80 minutos e a concentração de área da droga foi variada entre 0,1 e 100 g/cm2. Quanto à dose de luz, o intervalo foi entre 4,8 e 60 J/cm2, empregando lasers de diodo em 635 nm para Photogem&reg e 660 nm para Photodithazine&reg. Depois de estabelecido 30 J/cm² para a aplicação tópica, foi usada a aplicação intravenosa com essa dose, a fim de comparar os resultados. Após iluminação, foram feitas imagens da membrana imediatamente após a iluminação até 300 minutos pós-terapia. Com ajuda de softwares de processamento de imagem, foi feita a transformação da imagem: os pixels referentes aos vasos sanguíneos foram transformados em preto e o restante (clara, gema e embrião) em branco. Esse processo levou à obtenção de um valor relacionado à área de vasos sanguíneos em função do tempo pós-terapia, quantificando e mostrando o comportamento do efeito vascular da PDT. A comparação entre os dois fotossensibilizadores mostrou que o uso da mesma concentração (1 g/cm²) pode levar à destruição da rede vascular tratada para a porfirina e à dilatação dos vasos periféricos com destruição dos vasos mais calibrosos, para a clorina. Entretanto, variando as concentrações de ambos, obtemos respostas contrárias. A análise dos resultados obtidos, observando a diferença de ação dos fotossensibilizadores, permitiu a obtenção de uma relação quantitativa do comportamento vascular além do estudo individualizado do efeito da terapia fotodinâmica para análise do dano tecidual induzido. / Photodynamic Therapy is a local treatment of cancer that has great advances over the years. To obtain an efficient process that leads to tissue destruction, a dynamic interaction of three factors is required: photosensitizing agent, light, and molecular oxygen. When there is the appropriate illumination of tissue with photosensitizer, this molecule is excited and produces singlet oxygen. This product is reactive and cytotoxic, and it results in cell death. In this context, the CAM model allows studies with variation in many parameters linked with PDT and its effects and it is an option to study of vascular effects. A compound of porphyrin (Photogem&reg) and a compound of chlorine (Photodithazine&reg) were investigated in this study. These fotosensitizers were topically administrated and the parameters were ranged between 20-80 minutes for incubation, and 0.1-100 g/cm2 for concentration. About light dose, the range was between 4.8-60 J/cm2, with diode laser at 635 nm (Photogem&reg) and 660 nm (Photodithazine&reg). After established that light dose of 30J/cm² as ideal for topical application, intravenous application was used with that dose in order to compare the results. After illumination, the membrane images were made from zero to 300 minutes. At image processing, the pixels corresponding to vessels were defined as black and the remaining structures as white pixels. Calculating the percentage area of the black pixels as a function of the treatment time, it is possible to quantify the vascular effect of this therapy. The comparison between two fotosensitizers (1 g/cm²) can lead to vascular network destruction to porphyrin and can lead to dilation of peripheral vessels with destruction to larger vessels, for chlorine. However, increasing the porphyrin concentration and decreasing the chlorine concentration, we have opposite responses. With varying PDT parameters, it was possible to obtain the best assay for PDT. The results obtained by observing the difference of action of photosensitizers, allows obtaining a quantitative relationship of vascular behavior in addition to individual study of the effect of photodynamic therapy for analysis of tissue damage induced.
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Efeitos da Terapia Fotodinâmica mediada por laser de emissão vermelha e azul de metileno em vaginite induzida por Candida albicans / Effects of photodynamic therapy mediated by red laser and methylene blue aplied in induced vaginitis by Candida albicans

Sena, Rosa Maria Machado de 28 November 2013 (has links)
A candidíase vaginal (CV) é uma doença causada por fungos do gênero Candida spp. que acomete milhares de mulheres no mundo. Estima-se que 75% das mulheres sofrerão CV pelo menos uma vez durante a vida fértil, 40 a 50% terão o segundo episódio e 5 a 8% sofrerão a forma recorrente, caracterizada pela ocorrência de quatro ou mais episódios durante um ano. O tratamento ainda permanece um desafio para as candidíases complicadas. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que utiliza substâncias fotossensibilizadoras (FS) e uma fonte de luz, que juntas, produzem espécies reativas de oxigênio, tóxicas para micro-organismos e inofensivas para a célula animal hospedeira. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antifúngicos e anti-inflamatórios da TFD mediada por azul de metileno (AM) e laser de emissao vermelha (LEV) no tratamento da CV em modelo animal. Fêmeas de camundongos BALB/c, com 6 a 10 semanas foram estrogenizadas e, 72h após, receberam via intravaginal 20μL de suspensão contendo 107 UFC/mL de C. albicans ATCC 90028. Cinco dias após, a TFD foi aplicada na vagina das fêmeas, utilizando AM 1000μM e laser (100mW, 660nm, energia de 36J por 6 min ou duas aplicações de 18J por 3min, com intervalo de 24h entre sessões). Após 0, 24 e 96h foram feitas lavagens vaginais para recuperação fúngica, cultivo microbiológico, eutanásia para remoção das vaginas e estudo histológico. Lâminas coradas por hematoxilina e eosina foram utilizadas para contagem da área de células inflamatórias (ACI), utilizando o programa ImageJ. Os resultados mostraram que TFD in vivo reduziu a carga fúngica em aproximadamente 1,6 log UFC/mL e, quando aplicada em duas sessões de 18J por 3min, diminuiu a ACI. A TFD mediada por LEV e AM 1000μM mostra-se como alternativa promissora para o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para vaginites fúngicas. / Vaginal candidiasis (VC) is a disease caused by fungi of the genus Candida spp. that affects thousands of women worldwide. It is estimated that 75% of women in childbearing age will have VC at least once, 40 to 50% will have a second episode and 5 to 8 % will suffer recurrent form, characterized by the occurrence of four or more episodes during one year. Treatment remains a challenge for complicated candidiasis. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality that uses photosensitizing (FS) substances and a light source, which together produce reactive oxygen species, toxic to microorganisms and harmless to host animal cell. The aim of this study was to evaluate antifungal and anti - inflammatory effects of PDT mediated by methylene blue (MB) and red laser (RL) in the treatment of CV in an animal model. Female BALB/c mice 6 to 10 weeks were estrous and 72h after received intravaginally 20μL of suspension containing 107 CFU/mL of C. albicans ATCC 90028. Five days after, PDT was applied in the vagina of females using MB 1000μM and laser (100mW, 660nm, 36J for 6 min or two applications of 18J for 3 min, with an interval of 24h between sessions). Vaginal washes for fungal recovery and microbiological culture, and euthanasia for removal of vaginas and histological study were made after 0, 24 and 96h. Glass slides stained by hematoxylin and eosin were used for counting the area of inflammatory cells (AIC) using ImageJ software. PDT in vivo reduced the fungal burden in approximately 1.6 log CFU/mL, and, when applied in two sessions with 18J for 3min, decreased the AIC. PDT mediated by RL and MB 1000μM shown as a promising alternative for the development of new therapeutic modalities for yeast vaginitis.
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Síntese, caracterização e fotoatividade de fotossensibilizadores derivados de protoporfirina IX e de clorofilina / Synthesis, characterization and photoactivity of photosensitizers derivatived from protoporphyrin IX and chlorophyllin

Fernandes, Adjaci Uchoa 09 November 2007 (has links)
Processos que envolvem sensibilização são extremamente importantes para diversas áreas do conhecimento, incluindo a biologia, a química e a medicina. A aplicação de sensibilização em medicina tem se destacado, especialmente, em face de uma modalidade alternativa de tratamento de câncer denominada terapia fotodinâmica (TFD). Uma das linhas de pesquisas fundamentais para a evolução da terapia fotodinâmica é o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (Fs) com composição definida, que absorvam na janela terapêutica (600- 800nm) e que apresentem maior eficiência na indução de apoptose. Os Fs que apresentam cargas positivas e que são relativamente lipofílicos, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, que tem papel central no controle da vida e da morte celular. Neste trabalho foi realizado um estudo da influência dos grupos funcionais na atividade dos Fs, através da funcionalização da protoporfirina IX (Pp IX). Foram estudadas três diferentes rotas sintéticas. Na rota I (esquema 14), utilizou-se como composto de partida a Hematoporfina IX (Hp IX), a qual foi funcionalizada com grupos aminas e amidas, respectivamente, nas hidroxilas e nas carboxilas. Esta rota forneceu baixo rendimento global (20%), e compostos de difícil purificação, no entanto obteve-se 1 composto puro. Na rota II (esquema 15), utilizou-se como composto de partida a Pp IX, a qual foi funcionalizada nos grupos vinílicos com grupos aminas. Obteve-se 4 compostos, com rendimento global de reação superior a 50%, mas observou-se que ocorre uma reação de eliminação que impede a quartenarização das aminas localizadas nas posições α ao anel porfirínico. Na rota III (esquema 16), os grupos carboxílicos de Pp IX foram transformados em cloreto de ácido, que foram substituídos por compostos bifuncionais, amina primária e um segundo grupo. Esta rota possibilitou a obtenção de 7 compostos, inclusive compostos quaternários com rendimento global de reação superior a 70%. Dois derivados da clorofilina, que apresentam a banda QIV com um ε elevado em 650nm, foram também sintetizados. Todos os compostos, foram caracterizados estruturalmente de forma inequívoca através do espectro eletrônico (UV-vis e fluorescência), vibracional no infravermelho, RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e espectrometria de massa. A série de compostos obtidos permitiu um estudo da relação entre a estrutura química do Fs com a sua fotoatividade. As propriedades fotofísicas foram caracterizadas por espectro de absorção e de emissão, fotólise de relâmpago a laser, eficiência quântica de fluorescência e de geração de oxigênio singlete. Estas determinações indicaram que as propriedades fotofísicas dos Fs não foram consideravelmente alteradas no processo sintético. Foi determinada a formação de agregados em solução aquosa e o equilíbrio monômero agregado foi deslocado no sentido da formação do monômero na presença de micelas de CTAB e SDS e de soro fetal. Observou-se, que a contribuição para desagregação é mais eficiente quando a carga da micela é oposta à do Fs. Foi determinado o coeficiente de partição octanol/água (logPo/a) em função do pH e constatou-se que os compostos que têm carga líquida apresentam valores de logPo/a entre -1 e 1 na faixa de pH entre 3 e 10. A incorporação destes compostos em lipossomos, seguiu perfil esperado considerando a carga, o logPo/a e a característica anfifílica dos compostos sintetizadas. Genericamente a eficiência de morte celular fotoinduzida seguiu o perfil de incorporação das drogas em células HeLa. Os estudos comparativos da citolocalização foram realizados por co-encubação das porfirinas sintetizadas com rodamina 123 (Rd), que se concentra em mitocôndrias. A localização em organelas citoplasmáticas foi determinada através de imagens obtidas por microscopia de fluorescência confocal. A sobreposição da emissão da Rd foi de 80% e 31% com o composto catiônico PpNpNI e aniônico PpNetPO3, respectivamente, comprovando a localização mitocondrial do composto positivo. / Processes that involve sensitization are extremely important for several areas of knowledge, including biology, chemistry and medicine. The application of sensitization in medicine is especially important, in face of an alternative modality of cancer treatment called Photodynamic Therapy (PDT). One of the lines of basic research important for the evolution of PDT is the development of new photosensitizers (PS) with defined composition, that absorb in the therapeutical window (600-800nm) and that present greater efficiency in the induction of apoptosis. Positively charged PS with the proper lipophilic/hidrophilic balance permeate membranes and are attracted by the negative potential of mitochondria, which is an organelle that has central roles in the control of cell life and death. In this work the influence of the functional groups in the activity of PS was carried out, through the functionalization of protoporphyrin IX (Pp IX). Three different synthetic routes were used. In route I (scheme 14), Hematoporphyrin IX (Hp IX), was used as departure compound and it was modified with amino and amide groups in hydroxyls and carboxyls, respectively. We found low yield in the synthetic (20%) and purification steps. However 1 pure PS was obtained. In route II (scheme 15), Pp IX was used as departure compound, which was modified in the vinilic groups with amino groups. We obtained 4 compounds, with global yield superior than 50%, but it was observed that an elimination reaction occurs that hinders the quarternization of the amino groups located in position α to the porphyrin ring. Into route III (scheme 16), the carboxilic groups of Pp IX had been transformed into chloride acid, which was substituted by bi- functional groups, primary amine in one side and another group in the other. This route made it possible to obtain 7 compounds, including quaternary ammonium compounds with global yield superior than 70%. Two derivatives of chlorophyllin, that present QIV band with large extinction coefficient in 650nm, also were synthesized. All compounds were characterized structurally through the electronic and vibrational spectra (UV-vis and fluorescence, IR), RMN of 1H and 13C (1D and 2D) and mass spectrometry. This series of compounds allowed us to study the relation between the chemical structure of the Fs with its photoactivity. The photophysical properties were characterized by emission and absorption spectra, laser flash photolysis, fluorescence emission in the visible and NIR regions (generation of singlet oxygen). These determinations indicated that the photophysical properties of the PS were not modified in the synthetic process. The formation of aggregates were characterized in aqueous solution and the balance between aggregate and monomer species was dislocated in the direction of the formation of monomers in the presence of CTAB, SDS micelles and fetal serum. It was observed, that the disaggregating efficient is larger with micelles that have the opposite charges to that of the PS. The Octanol water partition coefficient (logPo/a), was determined as a function of pH. logPo/a values between -1 and 1 were observed for charged PS in the pH range of 3-10. The incorporation of these compounds in liposomes, followed the expected profile considering the charge, logPo/a and the amphifilic nature. Generically, the photoinduced cell death efficiency followed the profile of incorporation of the PS in HeLa cells. Comparative studies of cytolocalization were carried out by co-incubation of the cells with porphyrins and Rhodamine 123 (Rd), which localizes in mitochondria. The localization in cytoplasmic organelles was determined through fluorescence confocal microscopy images. The overlapping emission of the Rd was of 80% and 31% with the cationic PpNpNI and the anionic PpNetPO3 compounds, respectively, proving the mitochondrial localization of the positive PS.
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\"Identificação e quantificação de fotossensibilizador em tecido hepático por espectroscopia de fluorescência e sua importância na terapia fotodinâmica\" / \"Photosensitizer identification and quantification in liver tissue by fluorescence spectroscopy and its importance on photodinamic therapy\"

Vollet Filho, José Dirceu 26 February 2007 (has links)
A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que provoca dano celular pela ação de um fotossensibilizador (FS), com seletividade de localização em tecido tumoral; a luz que, absorvida pelo FS, leva-o a um estado tripleto metaestável; e oxigênio molecular, o qual recebe a energia absorvida pelo FS, passando a um estado singleto de alta capacidade oxidativa. A técnica é bem sucedida no tratamento de lesões como câncer, mas enfrenta, entretanto, dificuldades para a determinação de sua dosimetria. Uma delas é a quantificação da distribuição do FS no tecido tratado. Este trabalho tem três objetivos: a obtenção de informação quantitativa por espectros de fluorescência de fluoróforos em meios turvos; a demonstração da distribuição do FS Photogem® em fígados sadios de ratos Wistar e suas implicações na dosimetria; e a melhoria de um dos modelos existentes para previsão da profundidade de necrose (Ynec), importante parâmetro no estudo da TFD. Realizaram-se os experimentos em três fases: na primeira, tentou-se reconstruir o espectro do fígado sadio a partir de uma composição de espectros isolados de fluoróforos endógenos do fígado. Na segunda, realizaram-se estudos com corantes alimentícios Coralim-Mix® nas cores azul, verde e vermelho e com corantes Exciton® (Coumarin-480 e LDS-722) in vitro e in vivo, visando identificar os espectros dos corantes em misturas com meios turvos e entre eles. Na terceira, aplicou-se Photogem® em ratos Wistar e se coletou a fluorescência do FS nos fígados, relacionando-se a variação na intensidade de fluorescência com a concentração de FS presente e com perfis de necrose obtidos por TFD. Aplicou-se, por fim, os resultados obtidos na melhoria do modelo para previsão da Ynec. A reconstrução dos espectros não foi bem sucedida, tal qual a recuperação dos espectros dos corantes. Os resultados mostraram que muitos fatores contribuem para a distorção da fluorescência coletada, e que a informação obtida é prejudicada se estes forem ignorados. Verificou-se que a distribuição do FS não é homogênea num órgão fotossensibilizado. Obteve-se uma função para distribuição do FS no tecido e, através dela, foi possível melhorar o modelo para a previsão da Ynec. Observou-se que a turbidez do meio afeta de maneira complexa a coleta de fluorescência, criando obstáculos para a quantificação direta de fluoróforos nele inseridos. Fica evidente a necessidade do aprofundamento dos estudos sobre a interação da luz com as partículas dos meios turvos para remover as distorções geradas por estas. Demonstrou-se ainda a importância do mapeamento da distribuição do FS num tecido fotossensibilizado como parte da dosimetria da TFD, e que a espectroscopia de fluorescência é forte candidata à técnica mais apropriada para este mapeamento, desde que dominados os obstáculos à coleta de fluorescência. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique that implies in cell damage by the action of a photosensitizer (PS) with tumor tissue localization selectivity; light at PS absorption spectrum wavelengths, which leads the PS to a metastable triplet state; and molecular oxygen, which earns the energy absorbed by the PS, reaching a high oxidative potential singlet state. The technique has found sucess on the treatment of lesions as cancer. However, it finds difficulties for its dosimetry stablishment, like the quantification of PS distribuition in a photosensitized tissue. This work has three purposes: obtainance of fluorophores quantitative information into turbid media through fluorescence spectroscopy; to show the distribution of the PS Photogem® in healthy Wistar rats’ livers and its consequences on dosimetry; and the upgrade of an existing model for depth of necrosis (Ynec) forecast. There were three experimental stages: the first one was an attemp to rebuild a healthy liver spectrum from a composition using mathematical weights for isolate liver endogenous fluorophores spectra. On the second stage, in vitro and in vivo studies were performed using Coralim-Mix® blue, green and red food dyes and the Exciton® dyes Coumarin-480 and LDS-722, aiming to recover dyes spectra from dyes in turbid solutions and dyes mixtures. On the third one, Photogem® was administered to Wistar rats and fluorescence was collected on rats’ livers, and a relationship was stablished between the changes on fluorescence intensity, PS concentration in the tissue and necrosis profiles obtained via PDT. Results were applied to the upgrade of the Ynec forecast model. Spectra rebuilding, as well as dyes spectra recovering, were not completely reached. Results showed that a great deal of factors contribute to distortions at the collected fluorescence. It was verified that PS distribution is inhomogeneous in a photosensitized organ. It was found a function for the PS tissue distribution and it made possible to upgrade the Ynec forecast model. It was showed that medium turbidity affects in a complex manner the collected fluorescence, making difficult to quantify directly fluorophores in such medium. A need to go deeper into the investigation of light interactions with turbid media so that we may remove distortions they introduce into fluorescence spectra became evident. It was also showed how important is to track PS distribuition in a photosensitized tissue as a part of PDT dosimetry, and how fluorescence spectroscopy seems to be appropriate to perform such tracking, as long as the difficulties on fluorescence collection are overcome.
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Efficient photodynamic therapy on human retinoblastoma cell lines

Walther, Jan, Schastak, Stanislas, Dukic-Stefanovic, Sladjana, Wiedemann, Peter, Neuhaus, Jochen, Claudepierre, Thomas 10 July 2014 (has links) (PDF)
Photodynamic therapy (PDT) has shown to be a promising technique to treat various forms of malignant neoplasia. The photodynamic eradication of the tumor cells is achieved by applying a photosensitizer either locally or systemically and following local activation through irradiation of the tumor mass with light of a specific wavelength after a certain time of incubation. Due to preferential accumulation of the photosensitizer in tumor cells, this procedure allows a selective inactivation of the malignant tumor while sparing the surrounding tissue to the greatest extent. These features and requirements make the PDT an attractive therapeutic option for the treatment of retinoblastoma, especially when surgical enucleation is a curative option. This extreme solution is still in use in case of tumours that are resistant to conventional chemotherapy or handled too late due to poor access to medical care in less advanced country. In this study we initially conducted in-vitro investigations of the new cationic water-soluble photo sensitizer tetrahydroporphyrin-tetratosylat (THPTS) regarding its photodynamic effect on human Rb-1 and Y79 retinoblastoma cells. We were able to show, that neither the incubation with THPTS without following illumination, nor the sole illumination showed a considerable effect on the proliferation of the retinoblastoma cells, whereas the incubation with THPTS combined with following illumination led to a maximal cytotoxic effect on the tumor cells. Moreover the phototoxicity was lower in normal primary cells from retinal pigmented epithelium demonstrating a higher phototoxic effect of THPTS in cancer cells than in this normal retinal cell type. The results at hand form an encouraging foundation for further in-vivo studies on the therapeutic potential of this promising photosensitizer for the eyeball and vision preserving as well as potentially curative therapy of retinoblastoma.
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Avaliação do efeito vascular da terapia fotodinâmica empregando derivados de porfirina e clorina na membrana corioalantóica / Evaluation of vascular effect of photodynamic therapy using porphiryn and chlorin derivates in the chorioallantoic membrane

Hilde Harb Buzzá 10 February 2012 (has links)
A Terapia Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Therapy - PDT) é uma técnica indicada para o tratamento local de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos. A PDT consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, resultando na transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula, levando à destruição do tecido. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM) é uma opção para o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia, além de permitir o estudo na variação de diversos parâmetros associados com a PDT e seus efeitos. Nesse estudo foram investigados um composto derivado de porfirina e um derivado de clorina. Esses fotossensibilizadores foram administrados topicamente e por via intravenosa, sendo variados diversos parâmetros. No primeiro caso, o tempo de incubação foi variado entre 20 e 80 minutos e a concentração de área da droga foi variada entre 0,1 e 100 g/cm2. Quanto à dose de luz, o intervalo foi entre 4,8 e 60 J/cm2, empregando lasers de diodo em 635 nm para Photogem&reg e 660 nm para Photodithazine&reg. Depois de estabelecido 30 J/cm² para a aplicação tópica, foi usada a aplicação intravenosa com essa dose, a fim de comparar os resultados. Após iluminação, foram feitas imagens da membrana imediatamente após a iluminação até 300 minutos pós-terapia. Com ajuda de softwares de processamento de imagem, foi feita a transformação da imagem: os pixels referentes aos vasos sanguíneos foram transformados em preto e o restante (clara, gema e embrião) em branco. Esse processo levou à obtenção de um valor relacionado à área de vasos sanguíneos em função do tempo pós-terapia, quantificando e mostrando o comportamento do efeito vascular da PDT. A comparação entre os dois fotossensibilizadores mostrou que o uso da mesma concentração (1 g/cm²) pode levar à destruição da rede vascular tratada para a porfirina e à dilatação dos vasos periféricos com destruição dos vasos mais calibrosos, para a clorina. Entretanto, variando as concentrações de ambos, obtemos respostas contrárias. A análise dos resultados obtidos, observando a diferença de ação dos fotossensibilizadores, permitiu a obtenção de uma relação quantitativa do comportamento vascular além do estudo individualizado do efeito da terapia fotodinâmica para análise do dano tecidual induzido. / Photodynamic Therapy is a local treatment of cancer that has great advances over the years. To obtain an efficient process that leads to tissue destruction, a dynamic interaction of three factors is required: photosensitizing agent, light, and molecular oxygen. When there is the appropriate illumination of tissue with photosensitizer, this molecule is excited and produces singlet oxygen. This product is reactive and cytotoxic, and it results in cell death. In this context, the CAM model allows studies with variation in many parameters linked with PDT and its effects and it is an option to study of vascular effects. A compound of porphyrin (Photogem&reg) and a compound of chlorine (Photodithazine&reg) were investigated in this study. These fotosensitizers were topically administrated and the parameters were ranged between 20-80 minutes for incubation, and 0.1-100 g/cm2 for concentration. About light dose, the range was between 4.8-60 J/cm2, with diode laser at 635 nm (Photogem&reg) and 660 nm (Photodithazine&reg). After established that light dose of 30J/cm² as ideal for topical application, intravenous application was used with that dose in order to compare the results. After illumination, the membrane images were made from zero to 300 minutes. At image processing, the pixels corresponding to vessels were defined as black and the remaining structures as white pixels. Calculating the percentage area of the black pixels as a function of the treatment time, it is possible to quantify the vascular effect of this therapy. The comparison between two fotosensitizers (1 g/cm²) can lead to vascular network destruction to porphyrin and can lead to dilation of peripheral vessels with destruction to larger vessels, for chlorine. However, increasing the porphyrin concentration and decreasing the chlorine concentration, we have opposite responses. With varying PDT parameters, it was possible to obtain the best assay for PDT. The results obtained by observing the difference of action of photosensitizers, allows obtaining a quantitative relationship of vascular behavior in addition to individual study of the effect of photodynamic therapy for analysis of tissue damage induced.
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\"Identificação e quantificação de fotossensibilizador em tecido hepático por espectroscopia de fluorescência e sua importância na terapia fotodinâmica\" / \"Photosensitizer identification and quantification in liver tissue by fluorescence spectroscopy and its importance on photodinamic therapy\"

José Dirceu Vollet Filho 26 February 2007 (has links)
A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que provoca dano celular pela ação de um fotossensibilizador (FS), com seletividade de localização em tecido tumoral; a luz que, absorvida pelo FS, leva-o a um estado tripleto metaestável; e oxigênio molecular, o qual recebe a energia absorvida pelo FS, passando a um estado singleto de alta capacidade oxidativa. A técnica é bem sucedida no tratamento de lesões como câncer, mas enfrenta, entretanto, dificuldades para a determinação de sua dosimetria. Uma delas é a quantificação da distribuição do FS no tecido tratado. Este trabalho tem três objetivos: a obtenção de informação quantitativa por espectros de fluorescência de fluoróforos em meios turvos; a demonstração da distribuição do FS Photogem® em fígados sadios de ratos Wistar e suas implicações na dosimetria; e a melhoria de um dos modelos existentes para previsão da profundidade de necrose (Ynec), importante parâmetro no estudo da TFD. Realizaram-se os experimentos em três fases: na primeira, tentou-se reconstruir o espectro do fígado sadio a partir de uma composição de espectros isolados de fluoróforos endógenos do fígado. Na segunda, realizaram-se estudos com corantes alimentícios Coralim-Mix® nas cores azul, verde e vermelho e com corantes Exciton® (Coumarin-480 e LDS-722) in vitro e in vivo, visando identificar os espectros dos corantes em misturas com meios turvos e entre eles. Na terceira, aplicou-se Photogem® em ratos Wistar e se coletou a fluorescência do FS nos fígados, relacionando-se a variação na intensidade de fluorescência com a concentração de FS presente e com perfis de necrose obtidos por TFD. Aplicou-se, por fim, os resultados obtidos na melhoria do modelo para previsão da Ynec. A reconstrução dos espectros não foi bem sucedida, tal qual a recuperação dos espectros dos corantes. Os resultados mostraram que muitos fatores contribuem para a distorção da fluorescência coletada, e que a informação obtida é prejudicada se estes forem ignorados. Verificou-se que a distribuição do FS não é homogênea num órgão fotossensibilizado. Obteve-se uma função para distribuição do FS no tecido e, através dela, foi possível melhorar o modelo para a previsão da Ynec. Observou-se que a turbidez do meio afeta de maneira complexa a coleta de fluorescência, criando obstáculos para a quantificação direta de fluoróforos nele inseridos. Fica evidente a necessidade do aprofundamento dos estudos sobre a interação da luz com as partículas dos meios turvos para remover as distorções geradas por estas. Demonstrou-se ainda a importância do mapeamento da distribuição do FS num tecido fotossensibilizado como parte da dosimetria da TFD, e que a espectroscopia de fluorescência é forte candidata à técnica mais apropriada para este mapeamento, desde que dominados os obstáculos à coleta de fluorescência. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique that implies in cell damage by the action of a photosensitizer (PS) with tumor tissue localization selectivity; light at PS absorption spectrum wavelengths, which leads the PS to a metastable triplet state; and molecular oxygen, which earns the energy absorbed by the PS, reaching a high oxidative potential singlet state. The technique has found sucess on the treatment of lesions as cancer. However, it finds difficulties for its dosimetry stablishment, like the quantification of PS distribuition in a photosensitized tissue. This work has three purposes: obtainance of fluorophores quantitative information into turbid media through fluorescence spectroscopy; to show the distribution of the PS Photogem® in healthy Wistar rats’ livers and its consequences on dosimetry; and the upgrade of an existing model for depth of necrosis (Ynec) forecast. There were three experimental stages: the first one was an attemp to rebuild a healthy liver spectrum from a composition using mathematical weights for isolate liver endogenous fluorophores spectra. On the second stage, in vitro and in vivo studies were performed using Coralim-Mix® blue, green and red food dyes and the Exciton® dyes Coumarin-480 and LDS-722, aiming to recover dyes spectra from dyes in turbid solutions and dyes mixtures. On the third one, Photogem® was administered to Wistar rats and fluorescence was collected on rats’ livers, and a relationship was stablished between the changes on fluorescence intensity, PS concentration in the tissue and necrosis profiles obtained via PDT. Results were applied to the upgrade of the Ynec forecast model. Spectra rebuilding, as well as dyes spectra recovering, were not completely reached. Results showed that a great deal of factors contribute to distortions at the collected fluorescence. It was verified that PS distribution is inhomogeneous in a photosensitized organ. It was found a function for the PS tissue distribution and it made possible to upgrade the Ynec forecast model. It was showed that medium turbidity affects in a complex manner the collected fluorescence, making difficult to quantify directly fluorophores in such medium. A need to go deeper into the investigation of light interactions with turbid media so that we may remove distortions they introduce into fluorescence spectra became evident. It was also showed how important is to track PS distribuition in a photosensitized tissue as a part of PDT dosimetry, and how fluorescence spectroscopy seems to be appropriate to perform such tracking, as long as the difficulties on fluorescence collection are overcome.
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Efeitos da Terapia Fotodinâmica mediada por laser de emissão vermelha e azul de metileno em vaginite induzida por Candida albicans / Effects of photodynamic therapy mediated by red laser and methylene blue aplied in induced vaginitis by Candida albicans

Rosa Maria Machado de Sena 28 November 2013 (has links)
A candidíase vaginal (CV) é uma doença causada por fungos do gênero Candida spp. que acomete milhares de mulheres no mundo. Estima-se que 75% das mulheres sofrerão CV pelo menos uma vez durante a vida fértil, 40 a 50% terão o segundo episódio e 5 a 8% sofrerão a forma recorrente, caracterizada pela ocorrência de quatro ou mais episódios durante um ano. O tratamento ainda permanece um desafio para as candidíases complicadas. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que utiliza substâncias fotossensibilizadoras (FS) e uma fonte de luz, que juntas, produzem espécies reativas de oxigênio, tóxicas para micro-organismos e inofensivas para a célula animal hospedeira. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antifúngicos e anti-inflamatórios da TFD mediada por azul de metileno (AM) e laser de emissao vermelha (LEV) no tratamento da CV em modelo animal. Fêmeas de camundongos BALB/c, com 6 a 10 semanas foram estrogenizadas e, 72h após, receberam via intravaginal 20μL de suspensão contendo 107 UFC/mL de C. albicans ATCC 90028. Cinco dias após, a TFD foi aplicada na vagina das fêmeas, utilizando AM 1000μM e laser (100mW, 660nm, energia de 36J por 6 min ou duas aplicações de 18J por 3min, com intervalo de 24h entre sessões). Após 0, 24 e 96h foram feitas lavagens vaginais para recuperação fúngica, cultivo microbiológico, eutanásia para remoção das vaginas e estudo histológico. Lâminas coradas por hematoxilina e eosina foram utilizadas para contagem da área de células inflamatórias (ACI), utilizando o programa ImageJ. Os resultados mostraram que TFD in vivo reduziu a carga fúngica em aproximadamente 1,6 log UFC/mL e, quando aplicada em duas sessões de 18J por 3min, diminuiu a ACI. A TFD mediada por LEV e AM 1000μM mostra-se como alternativa promissora para o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para vaginites fúngicas. / Vaginal candidiasis (VC) is a disease caused by fungi of the genus Candida spp. that affects thousands of women worldwide. It is estimated that 75% of women in childbearing age will have VC at least once, 40 to 50% will have a second episode and 5 to 8 % will suffer recurrent form, characterized by the occurrence of four or more episodes during one year. Treatment remains a challenge for complicated candidiasis. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality that uses photosensitizing (FS) substances and a light source, which together produce reactive oxygen species, toxic to microorganisms and harmless to host animal cell. The aim of this study was to evaluate antifungal and anti - inflammatory effects of PDT mediated by methylene blue (MB) and red laser (RL) in the treatment of CV in an animal model. Female BALB/c mice 6 to 10 weeks were estrous and 72h after received intravaginally 20μL of suspension containing 107 CFU/mL of C. albicans ATCC 90028. Five days after, PDT was applied in the vagina of females using MB 1000μM and laser (100mW, 660nm, 36J for 6 min or two applications of 18J for 3 min, with an interval of 24h between sessions). Vaginal washes for fungal recovery and microbiological culture, and euthanasia for removal of vaginas and histological study were made after 0, 24 and 96h. Glass slides stained by hematoxylin and eosin were used for counting the area of inflammatory cells (AIC) using ImageJ software. PDT in vivo reduced the fungal burden in approximately 1.6 log CFU/mL, and, when applied in two sessions with 18J for 3min, decreased the AIC. PDT mediated by RL and MB 1000μM shown as a promising alternative for the development of new therapeutic modalities for yeast vaginitis.
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Síntese, caracterização e fotoatividade de fotossensibilizadores derivados de protoporfirina IX e de clorofilina / Synthesis, characterization and photoactivity of photosensitizers derivatived from protoporphyrin IX and chlorophyllin

Adjaci Uchoa Fernandes 09 November 2007 (has links)
Processos que envolvem sensibilização são extremamente importantes para diversas áreas do conhecimento, incluindo a biologia, a química e a medicina. A aplicação de sensibilização em medicina tem se destacado, especialmente, em face de uma modalidade alternativa de tratamento de câncer denominada terapia fotodinâmica (TFD). Uma das linhas de pesquisas fundamentais para a evolução da terapia fotodinâmica é o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (Fs) com composição definida, que absorvam na janela terapêutica (600- 800nm) e que apresentem maior eficiência na indução de apoptose. Os Fs que apresentam cargas positivas e que são relativamente lipofílicos, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, que tem papel central no controle da vida e da morte celular. Neste trabalho foi realizado um estudo da influência dos grupos funcionais na atividade dos Fs, através da funcionalização da protoporfirina IX (Pp IX). Foram estudadas três diferentes rotas sintéticas. Na rota I (esquema 14), utilizou-se como composto de partida a Hematoporfina IX (Hp IX), a qual foi funcionalizada com grupos aminas e amidas, respectivamente, nas hidroxilas e nas carboxilas. Esta rota forneceu baixo rendimento global (20%), e compostos de difícil purificação, no entanto obteve-se 1 composto puro. Na rota II (esquema 15), utilizou-se como composto de partida a Pp IX, a qual foi funcionalizada nos grupos vinílicos com grupos aminas. Obteve-se 4 compostos, com rendimento global de reação superior a 50%, mas observou-se que ocorre uma reação de eliminação que impede a quartenarização das aminas localizadas nas posições α ao anel porfirínico. Na rota III (esquema 16), os grupos carboxílicos de Pp IX foram transformados em cloreto de ácido, que foram substituídos por compostos bifuncionais, amina primária e um segundo grupo. Esta rota possibilitou a obtenção de 7 compostos, inclusive compostos quaternários com rendimento global de reação superior a 70%. Dois derivados da clorofilina, que apresentam a banda QIV com um ε elevado em 650nm, foram também sintetizados. Todos os compostos, foram caracterizados estruturalmente de forma inequívoca através do espectro eletrônico (UV-vis e fluorescência), vibracional no infravermelho, RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e espectrometria de massa. A série de compostos obtidos permitiu um estudo da relação entre a estrutura química do Fs com a sua fotoatividade. As propriedades fotofísicas foram caracterizadas por espectro de absorção e de emissão, fotólise de relâmpago a laser, eficiência quântica de fluorescência e de geração de oxigênio singlete. Estas determinações indicaram que as propriedades fotofísicas dos Fs não foram consideravelmente alteradas no processo sintético. Foi determinada a formação de agregados em solução aquosa e o equilíbrio monômero agregado foi deslocado no sentido da formação do monômero na presença de micelas de CTAB e SDS e de soro fetal. Observou-se, que a contribuição para desagregação é mais eficiente quando a carga da micela é oposta à do Fs. Foi determinado o coeficiente de partição octanol/água (logPo/a) em função do pH e constatou-se que os compostos que têm carga líquida apresentam valores de logPo/a entre -1 e 1 na faixa de pH entre 3 e 10. A incorporação destes compostos em lipossomos, seguiu perfil esperado considerando a carga, o logPo/a e a característica anfifílica dos compostos sintetizadas. Genericamente a eficiência de morte celular fotoinduzida seguiu o perfil de incorporação das drogas em células HeLa. Os estudos comparativos da citolocalização foram realizados por co-encubação das porfirinas sintetizadas com rodamina 123 (Rd), que se concentra em mitocôndrias. A localização em organelas citoplasmáticas foi determinada através de imagens obtidas por microscopia de fluorescência confocal. A sobreposição da emissão da Rd foi de 80% e 31% com o composto catiônico PpNpNI e aniônico PpNetPO3, respectivamente, comprovando a localização mitocondrial do composto positivo. / Processes that involve sensitization are extremely important for several areas of knowledge, including biology, chemistry and medicine. The application of sensitization in medicine is especially important, in face of an alternative modality of cancer treatment called Photodynamic Therapy (PDT). One of the lines of basic research important for the evolution of PDT is the development of new photosensitizers (PS) with defined composition, that absorb in the therapeutical window (600-800nm) and that present greater efficiency in the induction of apoptosis. Positively charged PS with the proper lipophilic/hidrophilic balance permeate membranes and are attracted by the negative potential of mitochondria, which is an organelle that has central roles in the control of cell life and death. In this work the influence of the functional groups in the activity of PS was carried out, through the functionalization of protoporphyrin IX (Pp IX). Three different synthetic routes were used. In route I (scheme 14), Hematoporphyrin IX (Hp IX), was used as departure compound and it was modified with amino and amide groups in hydroxyls and carboxyls, respectively. We found low yield in the synthetic (20%) and purification steps. However 1 pure PS was obtained. In route II (scheme 15), Pp IX was used as departure compound, which was modified in the vinilic groups with amino groups. We obtained 4 compounds, with global yield superior than 50%, but it was observed that an elimination reaction occurs that hinders the quarternization of the amino groups located in position α to the porphyrin ring. Into route III (scheme 16), the carboxilic groups of Pp IX had been transformed into chloride acid, which was substituted by bi- functional groups, primary amine in one side and another group in the other. This route made it possible to obtain 7 compounds, including quaternary ammonium compounds with global yield superior than 70%. Two derivatives of chlorophyllin, that present QIV band with large extinction coefficient in 650nm, also were synthesized. All compounds were characterized structurally through the electronic and vibrational spectra (UV-vis and fluorescence, IR), RMN of 1H and 13C (1D and 2D) and mass spectrometry. This series of compounds allowed us to study the relation between the chemical structure of the Fs with its photoactivity. The photophysical properties were characterized by emission and absorption spectra, laser flash photolysis, fluorescence emission in the visible and NIR regions (generation of singlet oxygen). These determinations indicated that the photophysical properties of the PS were not modified in the synthetic process. The formation of aggregates were characterized in aqueous solution and the balance between aggregate and monomer species was dislocated in the direction of the formation of monomers in the presence of CTAB, SDS micelles and fetal serum. It was observed, that the disaggregating efficient is larger with micelles that have the opposite charges to that of the PS. The Octanol water partition coefficient (logPo/a), was determined as a function of pH. logPo/a values between -1 and 1 were observed for charged PS in the pH range of 3-10. The incorporation of these compounds in liposomes, followed the expected profile considering the charge, logPo/a and the amphifilic nature. Generically, the photoinduced cell death efficiency followed the profile of incorporation of the PS in HeLa cells. Comparative studies of cytolocalization were carried out by co-incubation of the cells with porphyrins and Rhodamine 123 (Rd), which localizes in mitochondria. The localization in cytoplasmic organelles was determined through fluorescence confocal microscopy images. The overlapping emission of the Rd was of 80% and 31% with the cationic PpNpNI and the anionic PpNetPO3 compounds, respectively, proving the mitochondrial localization of the positive PS.
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Elaboration, caractérisation et évaluation biologique de nanoparticules biocompatibles pour la thérapie photodynamique et l’imagerie IRM / Elaboration, characterization and biological evaluation of biocompatible nanoparticles for photodynamic therapy and MRI

Rigaux, Guillaume 10 June 2015 (has links)
L'objectif poursuivi au cours de ce travail est l'élaboration de nanoparticules biocompatibles à visée diagnostique (IRM) et thérapeutique (PDT). Dans ce but, un protocole de nanoprécipitation a été optimisé pour obtenir de façon quantitative et reproductible, des nanoparticules de PLGA de diamètre compatible avec une injection par voie parentérale. Cette formulation a été employée avec succès pour l'encapsulation d'un chélate lipophile de Gd(III), pour l'encapsulation d'un photosensibilisateur (m-THPC) et pour la co-encapsulation de ces deux substances actives. Les formulations optimales permettent d'obtenir des efficacités d'encapsulation de 7 et 46 % en chélate de gadolinium et m-THPC respectivement. La cytotoxicité et la photocytotoxicité des GdDO3AC12-mTHPC@PLGA ont été testées sur deux lignées cellulaires (C6 et fibroblastes) et les résultats obtenus montrent que les propriétés photocytotoxiques du m-THPC sont maintenues après l'encapsulation. L'efficacité IRM de ces nanoparticules a aussi été évaluée et les mesures NMRD et IRM à 3T montrent que l'encapsulation des chélates de gadolinium améliore leur capacité à générer un contraste en mode T1 et donc la qualité des images. / This work aimed at the synthesis of biocompatible nanoparticles for PDT and MRI applications. To reach this goal, a nanoprecipitation technique was optimized using only biocompatible starting materials. This technique allowed the preparation, in a reproducible and quantitative manner of PLGA nanoparticles, compatible with parenteral injections. This formulation was successfully applied to encapsulate a lipophilic Gd(III) chelate, a photosensitizer (m-THPC) and to co-encapsulate these two substances. Optimal formulations showed encapsulation yields of 7 and 46 % for the gadolinium chelate and m-THPC, respectively. Cytotoxicity and photocytotoxicity experiments performed for two different cell lines (C6 cells and fibroblasts) incubated with GdDO3AC12-mTHPC@PLGA nanoparticles showed that m-THPC photocytotoxicity was maintained after its encapsulation. MRI efficacy of GdDO3AC12-mTHPC@PLGA nanoparticles was also evaluated by NMRD measurements and 3T MRI images. The corresponding results indicated that gadolinium chelate encapsulation improved its tendency to generate an efficient T1 contrast and consequently, enhanced the image contrast.

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