A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica promissora que tem mostrado resultados clínicos efetivos, a lém de custo benefício favorável ao sistema de saúde. Embora a TFD esteja associada à indução de morte celular por necrose e, ou apoptose, pesquisas recentes comprovam a ativação da autofagia. Visando entender a relação entre a quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas após fotoativação dos fotossensibilizadores (FSs), com a indução de morte autofágica, foram utilizados os FSs fenotiazínicos estruturalmente semelhantes, azul de metileno (MB) e 1,9-dimetil azul de metileno (DMMB); as linhagens celulares HeLa e HaCat, como modelos biológicos e LEDs emitindo em 633 nm, como fonte luminosa. Os ensaios de viabilidade em função da dose de luz e da concentração dos FSs verificaram que o aumento de morte celular está diretamente relacionado ao aumento da concentração e ao aumento da dose de luz, para ambos FSs. Verificou-se que nas condições de IC50 a concentração do DMMB (10 nmol/L) é menor que a do MB (2,0 µmol/L) em duas ordens de grandeza, e essa diferença também se reflete no grau de desbalanço oxidativo gerado após fotossensibilização. Foi verificado que para o MB, a elevada geração de EROs está fortemente correlacionada com a perda de viabilidade, enquanto que para o DMMB essa correlação é fraca, uma vez que há perda de sobrevida sem grandes gerações de EROs. No entanto, a diminuição de sobrevida causada pelo DMMB se correlaciona forte e significativamente ao aumento da autofagia, indicando ocorrência de morte celular autofágica tanto em células HaCaT quanto em células HeLa. As análises de dano em organelas indicaram que ambos FSs, após serem fotoativados, causam danos em lisossomas e em mitocôndrias de células HaCaT. E confirmou-se, por ensaio de localização subcelular, que ambos FSs estão nessas organelas. Uma vez que a localização subcelular do FS influencia no mecanismo de morte celular foto desenvolvido, verificou-se que o MB nas mesmas concentrações nanomolares do DMMB não induz autofagia, pois o mesmo encontra-se fotoquimicamente inativo nas mitocôndrias, devido à redução pelas coenzimas presentes nesta organela. O DMMB possui um potencial de redução menor que o MB, o que impede a redução deste FS nas mitocôndrias, e, mesmo em baixas concentrações, o DMMB é capaz de comprometer a integridade de mitocôndrias e lisossomas, e induz ir autofagia como um mecanismo de morte celular. As condições em que o MB não se encontra totalmente reduzido no ambiente celular são em concentrações mais elevadas, nas quais a geração do nível de estresse oxidativo é maior e não se observa resposta autofágica após fotossensibilização. Esses resultados mostram que a eficiência de morte celular causada por TFD não está necessariamente relacionada ao nível de estresse oxidativo gerado, uma vez que o DMMB induziu estresse oxidativo em menor extensão do que MB e, no entanto, induziu morte celular em maior extensão. Confirmou-se o conceito de que, fotossensibilizadores mais eficazes para a TFD devem resultar da melhoria na especificidade das reações de fotossensibilização nos alvos celulares e não apenas em melhoria na eficiência de geração de ERO. / Photodynamic Therapy (PDT) is a promising therapeutic modality that has shown effective clinical outcomes and benefits in terms of costs to the national health system. Although PDT is associated with induction of cell death by necrosis or apoptosis, recent data suggest the activation of autophagy. In order to understand the relationship between reactive oxygen species (ROS), generated after light activation of photosensitizers (PSs), and the autophagic cell death induction, we have used two phenothiazines with similar structure - methylene blue (MB) and 1,9-dimethyl methylene blue (DMMB); HaCaT and HeLa cells were used as biological models and LEDs emitting at 633 nm were used as light source. Cell viability assays as function of light dose and PS concentration showed that the increase in cell death was directly proportional to the PS concentration and light dose, to the both PSs. At IC50 was verified that DMMB concentration (10 nmol/L) is lower than MB concentration (2,0 µmol/L) in two order of magnitude, and this difference is reflected in degree of oxidative stress promoted by photosensitizers . Only for MB the amount of detected ROS is highly correlated with loss of cell viability, while for DMMB this correlation is weak, because there is loss of viability without large generation of ROS. Nevertheless, the viability decreased for DMMB is highly correlated with the increase of autophagy, indicating occurrence of autophagic cell death in both HaCaT cells and in HeLa cells. The analyses of damaged cell organelles indicated that both PSs, after be photoactivated, induce lysosomal and mithochondrial damage in HaCaT cells. And the subcellular localization assay confirmed that DMMB and MB are localized in these organelles. Because the subcellular localization of PSs influences cell death mechanisms, this research identified that MB, in the same nanomolar concentration of DMMB, does not induce autophagy, because it is photochemically inactive in mitochondria due the reducing coenzymes present in this organelle. DMMB has a lower reduction potential than MB, which hinders PS reduction in mitochondria, and possibly generate a mild oxidative stress that compromise the integrity of mitochondria and lysosomes, and justify autophagy induction as a cell death mechanism. The conditions that MB is not fully reduced in the cellular environment are at higher concentrations, in which was detected high level of oxidative stress and autophagic cell death was not observed after photosensitization. These results show that the efficiency of cell death induced by PDT is not necessarily related with oxidative stress level, since the oxidative stress induced by DMMB was lesser than by MB, however, the cell death was greater. This research confirms the concept that more effective photosensitizers for PDT means greater specificity of photosensitization reactions, and not only improvement of the efficiency of ROS generation.

Melanoma is a pigmented tumor that originates from the melanocytes; pigmented cells present throughout the body, including skin and iris. The cutaneous form is the most common type, and it represents about 5% of the skin tumors diagnosed in Brazil. Although it does not have a high incidence, it represents about 80% to 85% of all skin tumor deaths. The second most frequent type of melanoma is ocular. It represents 5% of all melanoma cases and is a potentially lethal disease, especially when it causes metastasis. The main therapeutic approach for melanomas, in general, is surgery, with resection of the cutaneous lesion or enucleation in the case of ocular melanoma. Other techniques such as adjuvant immunotherapy, palliative chemotherapy, and radiotherapy are also used. However, they have low efficacy and several side effects. Photodynamic therapy is a therapeutic modality based on the interaction of light at specific wavelength and photosensitizer, in the presence of molecular oxygen, leading the cell to death. As melanoma is a pigmented cancer, it usually does not respond well to photodynamic therapy due to the high absorption of light on the surface of the tumor, making volumetric eradication impossible. This project investigated optical strategies for the diagnosis and treatment of melanoma. For the diagnosis, it was evaluated the fluorescence lifetime technique to differentiate melanoma and normal skin. A sensitivity of 99.4%, specificity of 97.4% and accuracy of 98.4% were achieved using linear discrimination analysis. For the cutaneous melanoma treatment, PDT combined to optical clearing agents (OCAs) was investigated. Vascular and cell-target photosensitizers were evaluated combined or not to OCAs. OCA improved PDT response in all pigmented tumors treated, but the best results were achieved when a dual-photosensitizer treatment combined to OCA was performed. The treatment of conjunctival melanoma was conducted using 2-photon excitation photodynamic therapy. The advantage of this technique is the use of infrared light, in a wavelength that melanin has a low absorption, improving the light penetration into the tumor. The tumor histology shows that apoptosis was induced only at the treatment site, with no damage to the surrounding tissue. Additionally, a single TPE-PDT session could treat the entire tumor. / O melanoma é um tumor pigmentado que surge dos melanócitos, células pigmentadas presentes em todo o corpo, incluindo a pele e a íris. A forma cutânea é a mais comum e representa cerca de 5% dos tumores cutâneos diagnosticados no Brasil. Embora não tenha uma alta incidência, representa cerca de 80% a 85% de todas as mortes por tumor de pele. O segundo tipo de melanoma mais frequente é o ocular. Representa 5% de todos os casos de melanoma e é uma doença potencialmente letal, especialmente em casos de metástase. A principal abordagem terapêutica para melanomas, em geral, é a cirurgia, com ressecção da lesão cutânea ou enucleação no caso do melanoma ocular. Outras técnicas, como imunoterapia adjuvante, quimioterapia paliativa e radioterapia também são usadas, porém, apresentam baixa eficiência e muitos efeitos colaterais. A terapia fotodinâmica é uma modalidade terapêutica baseada na interação da luz em um comprimento de onda específico e um fotossensibilizador, na presença de oxigênio molecular, levando a célula à morte. Como o melanoma é um câncer pigmentado, geralmente não responde bem à terapia fotodinâmica devido à alta absorção de luz na superfície do tumor, impossibilitando a erradicação volumétrica. Este projeto investigou estratégias ópticas para o diagnóstico e tratamento do melanoma. Para o diagnóstico, foi avaliada a técnica de tempo de vida de fluorescência para distinguir melanoma de pele normal. Utilizando análise de discriminação linear, obteve-se uma sensibilidade de 99,4%, especificidade de 97,4% e precisão de 98,4%. Para o tratamento de melanoma cutâneo, a PDT combinada com clareadores ópticos (OCAs) foi investigada. Um fotossensibilizador que tem como alvo vaso sanguíneo e um fotossensibilizador de alvo celular foram avaliados combinados ou não com OCAs. OCAs são soluções hiperosmóticas que desidratam o tecido, diminuindo o espalhamento da luz e melhorando a penetração de luz em profundidade. OCA melhorou a resposta de PDT em todos os tumores melanóticos tratados, mas os melhores resultados foram obtidos quando a PDT foi realizada com a combinação dos fotossensibilizadores e clareador óptico em uma única sessão. O tratamento do melanoma conjuntival foi realizado utilizando a terapia fotodinâmica por excitação de 2 fótons (TPE-PDT). A vantagem desta técnica é o uso de luz na região do infravermelho, em um comprimento de onda que melanina tem baixa absorção, melhorando a penetração de luz no tumor. A histologia do tumor mostrou que a apoptose foi induzida apenas no local do tratamento, sem danos no tecido adjacente. Além disso, uma única sessão de TPE-PDT foi capaz de tratar todo o tumor.

No description available.

This thesis encompasses the development and testing of an interstitial photodynamic therapy (iPDT) system for the treatment of prostate cancer. It begins with the optical characterization of a novel photosensitizer (SL-052) followed by a study of tissue optics as it applies to iPDT. The design and integration of a time-fractionated light delivery system with real-time spectral detection is then examined. An optical phantom test medium is formulated and in vitro system operation and testing is performed. Finally, in vivo experiments are performed on animal models with a focus on canine prostate iPDT. Unique optical results with dosimetric relevance are discovered and investigated. This includes metrics for optically measuring local in vivo SL-052 concentrations in real-time as well as novel oscillatory drug photobleaching and recovery behavior during time-fractionated light delivery. / Photonics and Plasmas

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica promissora que tem mostrado resultados clínicos efetivos, a lém de custo benefício favorável ao sistema de saúde. Embora a TFD esteja associada à indução de morte celular por necrose e, ou apoptose, pesquisas recentes comprovam a ativação da autofagia. Visando entender a relação entre a quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas após fotoativação dos fotossensibilizadores (FSs), com a indução de morte autofágica, foram utilizados os FSs fenotiazínicos estruturalmente semelhantes, azul de metileno (MB) e 1,9-dimetil azul de metileno (DMMB); as linhagens celulares HeLa e HaCat, como modelos biológicos e LEDs emitindo em 633 nm, como fonte luminosa. Os ensaios de viabilidade em função da dose de luz e da concentração dos FSs verificaram que o aumento de morte celular está diretamente relacionado ao aumento da concentração e ao aumento da dose de luz, para ambos FSs. Verificou-se que nas condições de IC50 a concentração do DMMB (10 nmol/L) é menor que a do MB (2,0 µmol/L) em duas ordens de grandeza, e essa diferença também se reflete no grau de desbalanço oxidativo gerado após fotossensibilização. Foi verificado que para o MB, a elevada geração de EROs está fortemente correlacionada com a perda de viabilidade, enquanto que para o DMMB essa correlação é fraca, uma vez que há perda de sobrevida sem grandes gerações de EROs. No entanto, a diminuição de sobrevida causada pelo DMMB se correlaciona forte e significativamente ao aumento da autofagia, indicando ocorrência de morte celular autofágica tanto em células HaCaT quanto em células HeLa. As análises de dano em organelas indicaram que ambos FSs, após serem fotoativados, causam danos em lisossomas e em mitocôndrias de células HaCaT. E confirmou-se, por ensaio de localização subcelular, que ambos FSs estão nessas organelas. Uma vez que a localização subcelular do FS influencia no mecanismo de morte celular foto desenvolvido, verificou-se que o MB nas mesmas concentrações nanomolares do DMMB não induz autofagia, pois o mesmo encontra-se fotoquimicamente inativo nas mitocôndrias, devido à redução pelas coenzimas presentes nesta organela. O DMMB possui um potencial de redução menor que o MB, o que impede a redução deste FS nas mitocôndrias, e, mesmo em baixas concentrações, o DMMB é capaz de comprometer a integridade de mitocôndrias e lisossomas, e induz ir autofagia como um mecanismo de morte celular. As condições em que o MB não se encontra totalmente reduzido no ambiente celular são em concentrações mais elevadas, nas quais a geração do nível de estresse oxidativo é maior e não se observa resposta autofágica após fotossensibilização. Esses resultados mostram que a eficiência de morte celular causada por TFD não está necessariamente relacionada ao nível de estresse oxidativo gerado, uma vez que o DMMB induziu estresse oxidativo em menor extensão do que MB e, no entanto, induziu morte celular em maior extensão. Confirmou-se o conceito de que, fotossensibilizadores mais eficazes para a TFD devem resultar da melhoria na especificidade das reações de fotossensibilização nos alvos celulares e não apenas em melhoria na eficiência de geração de ERO. / Photodynamic Therapy (PDT) is a promising therapeutic modality that has shown effective clinical outcomes and benefits in terms of costs to the national health system. Although PDT is associated with induction of cell death by necrosis or apoptosis, recent data suggest the activation of autophagy. In order to understand the relationship between reactive oxygen species (ROS), generated after light activation of photosensitizers (PSs), and the autophagic cell death induction, we have used two phenothiazines with similar structure - methylene blue (MB) and 1,9-dimethyl methylene blue (DMMB); HaCaT and HeLa cells were used as biological models and LEDs emitting at 633 nm were used as light source. Cell viability assays as function of light dose and PS concentration showed that the increase in cell death was directly proportional to the PS concentration and light dose, to the both PSs. At IC50 was verified that DMMB concentration (10 nmol/L) is lower than MB concentration (2,0 µmol/L) in two order of magnitude, and this difference is reflected in degree of oxidative stress promoted by photosensitizers . Only for MB the amount of detected ROS is highly correlated with loss of cell viability, while for DMMB this correlation is weak, because there is loss of viability without large generation of ROS. Nevertheless, the viability decreased for DMMB is highly correlated with the increase of autophagy, indicating occurrence of autophagic cell death in both HaCaT cells and in HeLa cells. The analyses of damaged cell organelles indicated that both PSs, after be photoactivated, induce lysosomal and mithochondrial damage in HaCaT cells. And the subcellular localization assay confirmed that DMMB and MB are localized in these organelles. Because the subcellular localization of PSs influences cell death mechanisms, this research identified that MB, in the same nanomolar concentration of DMMB, does not induce autophagy, because it is photochemically inactive in mitochondria due the reducing coenzymes present in this organelle. DMMB has a lower reduction potential than MB, which hinders PS reduction in mitochondria, and possibly generate a mild oxidative stress that compromise the integrity of mitochondria and lysosomes, and justify autophagy induction as a cell death mechanism. The conditions that MB is not fully reduced in the cellular environment are at higher concentrations, in which was detected high level of oxidative stress and autophagic cell death was not observed after photosensitization. These results show that the efficiency of cell death induced by PDT is not necessarily related with oxidative stress level, since the oxidative stress induced by DMMB was lesser than by MB, however, the cell death was greater. This research confirms the concept that more effective photosensitizers for PDT means greater specificity of photosensitization reactions, and not only improvement of the efficiency of ROS generation.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2220.pdf: 1450706 bytes, checksum: 0253030468c7f8632d10be1f594463aa (MD5) Previous issue date: 2008-08-08 / Universidade Federal de Sao Carlos / Photodynamic therapy (PDT) is a modality for treatment of tumors, and uses a combination of a drug (photosensitizer) and light in the presence of the molecular oxygen to selectively damage target tissue. In the absent of one of these components, the cytotoxic effect is not observed. Since 1990, many works in the literature studies the topical application of precursors of protoporphyrin IX (PpIX) in PDT, such 5- aminolevulinic acid (ALA) and methyl aminolevulinate (MAL). The purpose of this work was realized an comparative study in vivo between two commercial and available drugs precursors of PpIX, the ALAsense (5-aminolevulinic acid - ALA) from Russian and Metvix (methyl aminolevulinate MAL) from United Kingdom. Experiments were carried out in animals to analyze the performance and the ALA photodynamic MAL in liver of rats. The fluorescence spectra of the liver were collected at pre-determined time. The time of accumulation of PpIX was observed by 2 hours and 45 minutes for the ALA and MAL for 4 hours after application of drugs in the liver. The formation, accumulation and depth of penetration of PpIX in liver tissue were determined by fluorescence spectroscopy. Using a total of 21 animals were the irradiation of the liver fotossensibilizado with ALA or MAL alone with different doses of light (20, 50, 100 and 200J/cm2) or in a combination MAL + ALA to 8%, 16% and 32 dose of 100J/cm2. Thirty hours after the lighting, the animals were killed and livers removed. The area of necrosis of the liver was assessed macroscopically and the samples were prepared for histological study, considering especially the aspects and depth of necrosis. In histological analysis were carried out many aspects of necrosis and the normal liver. The depths of necrosis were measured and the threshold dose obtained using a mathematical model proposed in the literature. Moreover, the monitoring was carried out of O2 consumption of mitochondria isolated from livers of rats, after topical administration of drugs precursors of PpIX (ALA and MAL) in order to check the influence of these substances in mitochondrial bioenergetics. The results showed a higher penetration of MAL in the tissue, as well as greater depth of necrosis when compared to the ALA. These results suggest that MAL has a tendency to better photodynamic response than ALA to the criteria studied. / Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica para tratamento de tumores que provoca a destruição do tecido alvo através da combinação de uma droga (fotossensibilizador) e uma fonte de luz na presença de oxigênio molecular. Na ausência de algum desses componentes, o efeito citotóxico não é observado. Desde 1990, têm-se estudado a aplicação tópica de substâncias precursoras da protoporfirina IX (PpIX) associada à TFD, como o ácido 5-aminolevulínico (ALA) e o metil aminolevulinato (MAL). O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo comparativo in vivo entre duas substâncias precursoras da PpIX , o ALAsense (ácido 5-aminolevulínico - ALA) da Rússia e o Metvix (metil aminolevulinato MAL) do Reino Unido. Foram realizados experimentos em animais para analisar o desempenho fotodinâmico ALA e pelo MAL em fígado de ratos. Os espectros de fluorescência do fígado foram coletados em tempos prédeterminados. O tempo de acúmulo da PpIX observado foi de 2 horas e 45 minutos para o ALA e 4 horas para o MAL após a aplicação da droga no fígado. A formação, acúmulo e a profundidade de penetração da PpIX no tecido hepático foram determinados através da espectroscopia de fluorescência. Utilizando um total de 21 animais foi realizada a irradiação do fígado fotossensibilizado com ALA ou com MAL isoladamente com diferentes doses de luz (20, 50, 100 e 200J/cm2) ou na forma combinada MAL + ALA a 8%, 16 e 32% com dose de 100J/cm2. Trinta horas após a iluminação, os animais foram mortos e os fígados removidos. A área necrosada do fígado foi avaliada macroscopicamente e as amostras foram preparadas para o estudo histológico, considerando, principalmente, os aspectos e a profundidade da necrose. Na análise histológica realizada foram observados vários aspectos da necrose e da região normal do fígado. As profundidades de necrose foram medidas e a dose limiar obtida utilizando-se um modelo matemático proposto na literatura. Além disso, foi realizado o monitoramento do consumo de O2 de mitocôndrias isoladas de fígados de ratos, após administração tópica dos medicamentos precursores da PpIX (ALA e MAL) afim de verificar a influência dessas substâncias na bioenergética mitocondrial. Os resultados obtidos mostraram uma maior penetrabilidade do MAL no tecido, bem como uma maior profundidade de necrose quando comparado ao ALA. Esses resultados sugerem que o MAL possui uma tendência a melhor resposta fotodinâmica que o ALA para os critérios estudados.

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma alternativa promissora de tratamento para lesões pré-cancerosas e para câncer de pele não-melanoma, como o carcinoma espinocelular, agressivo e potencialmente metastático. Visando melhorar a eficiência da terapia fotodinâmica de carcinoma espinocelular de pele, este estudo otimizou o tempo para início da terapia, avaliou a eficácia dos fotossensibilizadores ácido aminolevulínico (ALA- 20%) e o metil-ester aminolevulínico (MEALA-10%) e verificou o coeficiente de atenuação relativo à pele normal dos grupos experimentais, por meio de Tomografia por Coerência Óptica. Para a indução do tumor foi realizada a carcinogênese química (DMBA/TPA) por um período de 28 semanas. A espectroscopia de fluorescência foi utilizada para monitoração da emissão da molécula de protoporfirina IX, induzida pelo ALA e MEALA. A aquisição de dados a cada 30 minutos totalizando um período de 360 minutos, permitiu verificar a máxima incorporação de ALA e MEALA em 300 e 330 minutos após a aplicação, respectivamente. Após a otimização foi realizada a PDT, avaliação clínica, histopatológica e análise por OCT dos grupos experimentais, por meio das quais verificou-se maior eficiência do grupo tratado com MEALA. No período de 20 dias, o percentual de lesões com redução de área maior que 50%, foi de 33% na PDT com ALA e 83% para o MEALA. Os coeficientes de atenuação ópticos para os grupos com neoplasia foram maiores do que os do grupo controle. Os grupos tratados com PDT apresentaram valores de coeficiente de atenuação que se aproximam dos valores obtidos para a pele sadia, evidenciando a resposta ao tratamento. Entretanto para ambos os fotossensibilizadores utilizados, a PDT mostrou-se eficaz quando iniciada nos tempos determinados neste estudo, e a técnica de OCT mostrou-se uma potencial ferramenta na avaliação deste tratamento. / Photodynamic therapy (PDT) is a promising alternative for pre-cancerous lesions and non-melanoma skin cancer treatment as squamous cells carcinoma, which is aggressive and potentially metastatic. Aiming the improvement of photodynamic therapy efficiency for skin squamous cells carcinoma, this study has optimized the time to start the therapy, it also evaluated the effectiveness of the aminolevulinic acid (ALA-20%) and methyl-ester aminolevulinic (MEALA-10%) as photosensitizers as well as verified the optical attenuation coefficient relative to normal skin of the experimental groups by optical coherence tomography (OCT). A chemical carcinogenesis was performed (DMBA/TPA), by a period of 28 days. Fluorescence Spectroscopy was used to monitor the emission of protoporphyrin IX induced by ALA and MEALA. Signal acquisition was performed every 30 minutes for a total period of 360 minutes, showing a maximum incorporation of ALA and MEALA, 300 and 330 minutes after the application. PDT was conducted after the optimization of the irradiation time. Clinical and histopathologic evaluation and OCT analysis of the experimental groups showed higher efficiency of the MEALA-treated group. After 20 days of treatment, the percentage of lesions with area reduction greater than 50%, was 33% for the ALA group and 83% for the MEALA group. The optical attenuation coefficients for groups with cancer were higher than those in the control group. The groups treated with PDT presented attenuation coefficient values that are close to the values obtained for healthy skin, showing the positive response to the treatment. This study showed that PDT was effective for both photosensitizers when initiated at the times determined in this study, and OCT technique proved to be a potential tool in the assessment of this treatment.

Melanoma is a pigmented tumor that originates from the melanocytes; pigmented cells present throughout the body, including skin and iris. The cutaneous form is the most common type, and it represents about 5% of the skin tumors diagnosed in Brazil. Although it does not have a high incidence, it represents about 80% to 85% of all skin tumor deaths. The second most frequent type of melanoma is ocular. It represents 5% of all melanoma cases and is a potentially lethal disease, especially when it causes metastasis. The main therapeutic approach for melanomas, in general, is surgery, with resection of the cutaneous lesion or enucleation in the case of ocular melanoma. Other techniques such as adjuvant immunotherapy, palliative chemotherapy, and radiotherapy are also used. However, they have low efficacy and several side effects. Photodynamic therapy is a therapeutic modality based on the interaction of light at specific wavelength and photosensitizer, in the presence of molecular oxygen, leading the cell to death. As melanoma is a pigmented cancer, it usually does not respond well to photodynamic therapy due to the high absorption of light on the surface of the tumor, making volumetric eradication impossible. This project investigated optical strategies for the diagnosis and treatment of melanoma. For the diagnosis, it was evaluated the fluorescence lifetime technique to differentiate melanoma and normal skin. A sensitivity of 99.4%, specificity of 97.4% and accuracy of 98.4% were achieved using linear discrimination analysis. For the cutaneous melanoma treatment, PDT combined to optical clearing agents (OCAs) was investigated. Vascular and cell-target photosensitizers were evaluated combined or not to OCAs. OCA improved PDT response in all pigmented tumors treated, but the best results were achieved when a dual-photosensitizer treatment combined to OCA was performed. The treatment of conjunctival melanoma was conducted using 2-photon excitation photodynamic therapy. The advantage of this technique is the use of infrared light, in a wavelength that melanin has a low absorption, improving the light penetration into the tumor. The tumor histology shows that apoptosis was induced only at the treatment site, with no damage to the surrounding tissue. Additionally, a single TPE-PDT session could treat the entire tumor. / O melanoma é um tumor pigmentado que surge dos melanócitos, células pigmentadas presentes em todo o corpo, incluindo a pele e a íris. A forma cutânea é a mais comum e representa cerca de 5% dos tumores cutâneos diagnosticados no Brasil. Embora não tenha uma alta incidência, representa cerca de 80% a 85% de todas as mortes por tumor de pele. O segundo tipo de melanoma mais frequente é o ocular. Representa 5% de todos os casos de melanoma e é uma doença potencialmente letal, especialmente em casos de metástase. A principal abordagem terapêutica para melanomas, em geral, é a cirurgia, com ressecção da lesão cutânea ou enucleação no caso do melanoma ocular. Outras técnicas, como imunoterapia adjuvante, quimioterapia paliativa e radioterapia também são usadas, porém, apresentam baixa eficiência e muitos efeitos colaterais. A terapia fotodinâmica é uma modalidade terapêutica baseada na interação da luz em um comprimento de onda específico e um fotossensibilizador, na presença de oxigênio molecular, levando a célula à morte. Como o melanoma é um câncer pigmentado, geralmente não responde bem à terapia fotodinâmica devido à alta absorção de luz na superfície do tumor, impossibilitando a erradicação volumétrica. Este projeto investigou estratégias ópticas para o diagnóstico e tratamento do melanoma. Para o diagnóstico, foi avaliada a técnica de tempo de vida de fluorescência para distinguir melanoma de pele normal. Utilizando análise de discriminação linear, obteve-se uma sensibilidade de 99,4%, especificidade de 97,4% e precisão de 98,4%. Para o tratamento de melanoma cutâneo, a PDT combinada com clareadores ópticos (OCAs) foi investigada. Um fotossensibilizador que tem como alvo vaso sanguíneo e um fotossensibilizador de alvo celular foram avaliados combinados ou não com OCAs. OCAs são soluções hiperosmóticas que desidratam o tecido, diminuindo o espalhamento da luz e melhorando a penetração de luz em profundidade. OCA melhorou a resposta de PDT em todos os tumores melanóticos tratados, mas os melhores resultados foram obtidos quando a PDT foi realizada com a combinação dos fotossensibilizadores e clareador óptico em uma única sessão. O tratamento do melanoma conjuntival foi realizado utilizando a terapia fotodinâmica por excitação de 2 fótons (TPE-PDT). A vantagem desta técnica é o uso de luz na região do infravermelho, em um comprimento de onda que melanina tem baixa absorção, melhorando a penetração de luz no tumor. A histologia do tumor mostrou que a apoptose foi induzida apenas no local do tratamento, sem danos no tecido adjacente. Além disso, uma única sessão de TPE-PDT foi capaz de tratar todo o tumor.

Photodynamic therapy(PDT) has recently emerged as a promising new non-invasive treatment modality for a large number of neoplastic and non-neoplastic lesions. Photoexcitation of a photosensitizing drug in the tumor tissue causes generation of reactive oxygen species which results in cell death. The current porphyrinic photosensitizers suffer a wide range of drawbacks leading to the development of the chemistry of alternative photosensitizing agents in PDT. Among them, the 4d and 5d transition metal-based photosensitizers have been explored extensively with the exception of the 3d metal complexes. The objective of this thesis work is to design and synthesize photoactive iron(III) abd cobalt(III) complexes and evalutate their photonuclease and photocytotoxic potential. Bioessential 3d metal ions provide an excellent platform for metal-based PDT drug designing as because of its varied spectral, magnetic and redox properties, with its complexes possessing rich photochemical behavior in aqueous and non-aqueous media. We have synthesized binary iron(III) complexes as netropsin mimics using amino acid Schiff bases derived from salicylaldehyde/napthaldehyde and arginine/lysine. The complexes were found to be good AT selective DNA binders and exhibited significant DNA photocleavage activity. To enhance the photodynamic potential, we further synthesized iron(III) complexes of phenolate-based ligand and planar phenanthroline bases. The DNA photocleavage activity of these complexes and their photocytotoxic potential in cancer models were studied. ROS generated by these complexes were found to induce apoptotic cell death. Ternary cobalt(III) complexes were synthesized to study the effect of the central metal atom. The diamagnetic cobalt(III) complexes were structurally dissimilar to their iron(III) analogues. Although the Co(III)/Co(II) redox couple is chemically and photochemically accessible but the Co(III)-dppz complex, unlike its iron(III)-dppz analogue, exhibited selective damage to hTSHR expressing cells but not in HeLa cells. A structure-activity relationship study on iron(III) phenolates having modified dppz ligands was carried out and it was found that electron donating group on the phenazine unit and an increase of the aromatic surface area largely improved the PDT efficiency. Finally, SMVT targeted iron(III) complexes with biotin as targeting moiety were synthesized and the in vitro efficacy of the complexes was tested in HepG2 cells over-expressing SMVTs and compared to HeLa amd HEK293 cells. The complexes exhibited higher phytocytotoxicity in HepG2 than in HeLa and cells and HEK293 cells. An endocytotic mode of uptake took place in HepG2 cells whereas in HEK293 cells, uptake is purely by diffusion. This is expected to reduce the side-effects and have less effect on cells with relatively less SMVTs. In summary, the present research work opens up novel strategies for the design and development of primarily iron-based photosensitizers for their potential applications in PDT with various targeting moieties.

In photodynamic therapy a photosensitizer drug is administered and is irradiated with light. Upon absorption of light the photosensitizer goes into its triplet state and transfers energy or an electron to oxygen to form reactive oxygen species (ROS). These ROS react with biomolecules in cells leading to cell damage and cell death. PDT has interested many researchers because of its non-invasiveness as compared to surgery, it leaves little to no scars, it is time and cost effective, it has potential for targeted treatment, and can be repeated as needed. Different photosensitizers such as porphyrines, chlorophylls, and dyes have been used in PDT to treat various cancers, skin diseases, aging and sun-damaged skin. These second generation sensitizers have yielded reduced skin sensitivity and improved extinction coefficients (up to ~ 105 L mol-1 cm-1). While PDT based on small molecule photosensitizers has shown great promise, several problems remain unsolved. The main issues with current sensitizers are (i) hydrophobicity leading to aggregation in aqueous media resulting in reduced efficacy and potential toxicity, (ii) dark toxicity of photosensitizers, (iii) non-selectivity towards malignant tissue resulting in prolonged cutaneous photosensitivity and damage to healthy tissue, (iv) limited light absorption efficiency, and (v) a lack of understanding of where the photosensitizer ends up in the tissue. In this dissertation research program, these issues were addressed by the development of conducting polymer nanoparticles as a next generation of photosensitizers. This choice was motivated by the fact that conducting polymers have large extinction coefficients ( > 107 L mol-1 cm-1), are able to undergo intersystem crossing to the triplet state, and have triplet energies that are close to that of oxygen. It was therefore hypothesized that such polymers could be effective at generating ROS due to the large excitation rate that can be generated. Conducting polymer nanoparticles (CPNPs) composed of the conducting polymer poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyl-oxy)-p-phenylenevinylene] (MEH-PPV) were fabricated and studied in-vitro for their potential in PDT application. Although not fully selective, the nanoparticles exhibited a strong bias to the cancer cells. The formation of ROS was proven in-vitro by staining of the cells with CellROX Green Reagent, after which PDT results were quantified by MTT assays. Cell mortality was observed to scale with nanoparticle dosage and light dosage. Based on these promising results the MEH-PPV nanoparticles were developed further to allow for surface functionalization, with the aim of targeting these NPs to cancer cell lines. For this work targeting of cancers that overexpress folate receptors (FR) were considered. The functionalized nanoparticles (FNPs) were studied in OVCAR3 (ovarian cancer cell line) as FR+, MIA PaCa2 (pancreatic cell line) as FR-, and A549 (lung cancer cell line) having marginal FR expression. Complete selectivity of the FNPs towards the FR+ cell line was found. Quantification of PDT results by MTS assays and flow cytometry show that PDT treatment was fully selective to the FR+ cell line (OVCAR3). No cell mortality was observed for the other cell lines studied here within experimental error. Finally, the issue of confirming and quantifying small molecule drug delivery to diseased tissue was tackled by developing quantum dot (Qdot) biosensors with the aim of achieving fluorescence reporting of intracellular small molecule/drug delivery. For fluorescence reporting prior expertise in control of the fluorescence state of Qdots was employed, where redox active ligands can place the Qdot in a quenched OFF state. Ligand attachment was accomplished by disulfide linker chemistry. This chemistry is reversible in the presence of sulfur reducing biomolecules, resulting in Qdots in a brightly fluorescent ON state. Glutathione (GSH) is such a biomolecule that is present in the intracellular environment. Experimental in-vitro data shows that this design was successfully implemented.