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Reproduction de : Thèse de doctorat : Chimie organique : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f.

Reproduction de : Thèse doctorat : Microbiologie industrielle : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f.192-214.

The interconversion of sugars in nature has for long been a source of interest and speculation. Many attempts were made to postulate a mechanism for the smooth and facile transformations but until 1933 the theories were unsupported by any experimental evidence. The first direct conversion of one aldose to another by means of changes involving a Walden inversion was achieved by Irvine and Hynd who obtained either d-glucose or d-mannose from d-glucosamine, according to the experimental procedure. It was obvious that in one case Walden inversion took place on C₂, but an interpretation of reaction was complicated by the removal of the nitrogen atom. Later, by the action of ammonia on methylglucoside-2-bromohydrin, Fischer et al. obtained “methylepiglucosamine” which was later shewn to be 2-amino-methylaltroside. The research which is now to be described was undertaken with a view to extending to the pentose series the application of the general principles which had been worked out for the hexoses. Although the research was incomplete, in the sense that no interconversion was achieved, many interesting facts emerged in the course of the work and some important derivatives of arabinose were prepared for the first time.

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-06T18:26:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1197506 bytes, checksum: 9193cadcda46986559ce00d7fba20538 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T18:26:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1197506 bytes, checksum: 9193cadcda46986559ce00d7fba20538 (MD5) Previous issue date: 2015-07-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A produção economicamente viável de etanol de segunda geração, depende principalmente de microrganismos capazes de fermentar a xilose, sendo o principal açúcar presente na fração hemicelulósica. A levedura Saccharomyces cerevisiae, não pode utilizar a xilose, uma vez que não possui transportador específico e os genes do metabolismo são expressos em baixos níveis. Neste sentido, as leveduras Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum e Sheffersomyces stipitis, tornam-se promissoras para a fermentação industrial de hidrolisados lignocelulósicos, por naturalmente converterem de maneira eficiente xilose em etanol. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar fisiologicamente essas linhagens e definir as melhores condições de fermentação. Foi realizado experimentos de fermentação em batelada com diferentes concentrações de xilose (4, 8 e 10%) e temperaturas (28, 32 e 35 °C). Posteriormente as melhores condições desta etapa para cada levedura, foram avaliadas em cofermentação com glicose (2 e 4%). O processo fermentativo foi realizado durante 70 horas, e amostras da cultura foram recolhidas para avaliação dos parâmetros cinéticos e fermentativos. Todas as leveduras crescem com velocidades similares em diferentes concentrações de açúcar, mostrando a tolerância a altas concentrações de xilose. Em relação às diferentes temperaturas avaliadas, S. arborariae, S. passalidarum e S. stipitis apresentam um bom crescimento em uma faixa de temperatura de 28 a 35°C. Ao avaliar o rendimento de etanol, S. arborariae apresentou o maior rendimento em 10% de xilose na temperatura de 28°C (27,6 g/L), S. passalidarum e S. stipitis apresentaram maior rendimento em 10% de xilose em 32°C (38,4 g/L e 37,8 g/L, respectivamente). Nos ensaios de cofermentação, estas leveduras consomem preferencialmente a glicose. A viabilidade celular não foi alterada durante as 70 horas de fermentação. A adição de HMF não representou efeito inibitório no crescimento destas leveduras, o furfural inibiu apenas o crescimento de S. arborariae, enquanto o ácido acético apresentou efeito inibitório para todas as leveduras. S. passalidarum cresceu em 6% de etanol, enquanto as demais não. S. passalidarum demonstrou ser promissora para a produção de etanol por produzir as maiores concentrações em um período curto de tempo e baixos rendimentos de xilitol e glicerol, em todas as condições avaliadas e por ser mais tolerante aos inibidores. / The economically viable production of second generation ethanol depends mainly on the ability of microorganisms to ferment xylose, the main sugar present in the hemicellulose fraction. Sacchamomyces cerevisiae cannot utilize xylose since it does not have any specific carrier, and the genes of xylose metabolism are expressed at low levels. In this regard, the yeasts Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum and Sheffersomyces stipitis have been considered promising for industrial fermentation of lignocellulosic hydrolysates because they naturally convert xylose to ethanol efficiently. This study aimed to physiologically characterize these lines and set the best conditions for fermentation. Fermentation was performed in batch experiments with different xylose concentrations (4, 8 and 10%) and temperatures (28, 32 and 35 ° C). Then, the best conditions for each one of the yeasts were evaluated in co-fermentation with glucose (2 and 4%). The fermentation process was carried out for 70 hours and culture samples were collected for further evaluation of kinetic and fermentation parameters. All yeast strains grown at similar rates in the different sugar concentrations tested, showing tolerance to high concentrations of xylose. Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum and Sheffersomyces stipitis had important development at 28 - 35 °C temperature range. To assess ethanol yield, S. arborariae showed the highest rate in 10% xylose concentration at 28 °C (27.6 g/L), while S. passalidarum and S. stipitis showed the highest yields in 10% xylose treatment, but at 32 °C (38.4 g/L and 37.8g/L, respectively). In the co- fermentation assays, these yeasts preferentially consume glucose. Cell viability was not affected during the 70 hour fermentations. The addition of 5-hydroxymethylfurfural did not present inhibitory effect on the yeasts development; furfural only inhibited S. arborariae growth, and acetic acid showed inhibitory effects in all yeasts. S. passalidarum grew in 6% ethanol, while the others did not. S. passalidarum showed to be promising for ethanol production because it had the highest ethanol concentration rates in a short period of time, showed low yields of xylitol and glycerol in all tested conditions, and proved to be more tolerant to inhibitors.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1984Bitstream added on 2014-06-13T19:12:33Z : No. of bitstreams: 1 barraviera_b_me_botfm.pdf: 3231026 bytes, checksum: b87b77290330969de4b3219f300b44e1 (MD5) / Com o objetivo de contribuir para o esclarecimento de alguns pontos ainda obscuros nas relações existentes entre o metabolismo da via das pentoses e a ação de drogas em doentes com malária causada pelo Plasmodium falciparum , foi proposta a padronização do método para pesquisa da atividade da via das pentoses, menos lesivo para os eritrócitos, menos dispendioso e que fosse tão eficiente quanto o do BREWER et alii. Estudou-se “in vitro”, com o método padronizado, a ação da clindamicina em hemácias humanas normais. Procedeu-se, ainda, a inquérito com a finalidade de avaliar a prevalência da eficiência de G6PD em habitantes de área endêmica de malária... / Not available.

La levure Candida shehatae est le microorganisme modèle d’étude choisi. Cette levure peutconvertir le xylose et le glucose en éthanol, contrairement à Saccharomyces cerevisiae, levuretraditionnellement utilisée dans les procédés industriels, qui ne peut convertir le xylose.L’optimisation des performances de production d’éthanol à partir de xylose passe par unemaximisation des trois critères suivants : la productivité volumique, le titre final et lerendement éthanol/xylose. Pour diriger le flux de carbone vers la production d'éthanol defaçon optimale, le paramètre majeur qu’il faut contrôler est le degré de limitation en oxygène.Les cultures sont réalisées sur milieu minéral en mode fed-batch et conduites en deux phases :aérobie puis limitation en oxygène. Une valeur moyenne de la vitesse spécifique derespiration (qO2) de 1,19 mmolO2/gX/h permet de maximiser les trois critères deperformances sur xylose : le rendement en éthanol (0,327 gETOH/g-xylose), la productivitéspécifique maximale (0,22 gETOH/gX/h) et le titre en éthanol final (48,81 g/L). Pour lafermentation du glucose, le rendement en éthanol le plus élevé (0,411 gETOH/g-glucose) estobtenu lorsque qO2 est faible et a pour valeur moyenne 0,30 mmolO2/gX/h; tandis que laproductivité spécifique et le titre en éthanol final atteignent les valeurs maximales de 0,35gETOH/gX/h et 54,19 g/L pour respectivement qO2 de 1,7 et de 2,5 mmolO2/gX/h.Pour la consommation simultanée des deux substrats, un phénomène de répression du glucosesur le xylose est démontré par expérience en chemostat de pulse glucose en régime stabilisésur xylose. La simple présence intra-cellulaire des enzymes de la voie du xylose (XR andXDH) ne permet pas la co-consommation efficace des deux sucres et le glucose estpréférentiellement consommé.Afin de structurer la connaissance acquise sur le métabolisme de C. shehatae et pouvoiroptimiser par simulation les co-cultures C. shehatae / S. cerevisiae pour la productiond’éthanol à partir de mélanges xylose/glucose, un modèle cinétique de C. shehatae estconstruit. Ce modèle est validé avec des cultures sur substrats purs (xylose et glucoseséparés). Un modèle cinétique de co-culture est ensuite développé de manière à simulerdifférentes stratégies de fermentation pour l’optimisation de la production d’éthanol surmélange xylose/glucose de type hydrolysats de paille de blé / The yeast Candida shehatae was the model microorganism of the study. This yeast canconvert xylose and glucose into ethanol, unlike Saccharomyces cerevisiae traditionally usedin industrial processes, which cannot convert xylose. Performance optimization of ethanolproduction from xylose is performed through maximization of the following three criteria:volumetric productivity, final ethanol titer and yield of ethanol over xylose. To direct thecarbon flux towards ethanol production, the major parameter which must be controlled is thelevel of oxygen limitation. Cultures are carried out in fed-batch in mineral medium andperformed in two phases: the first one is not limited in oxygen and the second one is oxygenrestricted. A mean value of qO2 equal to 1.19 mmolO2/gX/h maximizes the three criteria ofperformance on xylose: ethanol yield (0.327 gETOH/g-xylose), the maximum specificproductivity (0.22 gETOH/gX/h) and the final ethanol titer (48.81 g/L). For glucosefermentation, ethanol yield is the highest (0.411 gETOH/g-glucose) when qO2 is low as anaverage value of 0.30 mmolO2/gX/h, while the specific productivity and the ethanol final titerreach maximum values of 0.35 gETOH/gX/h and 54.19 g/L for respectively qO2 of 1.7 and2.5 mmolO2/gX/h.For the simultaneous consumption of the two substrates, a phenomenon of glucose repressionover xylose is observed in chemostat experiment with glucose pulse on xylose steady state.The presence of intracellular enzymes of the xylose pathway (XR and XDH) is not sufficientfor efficient co-consumption of both sugars and glucose is preferentially consumed.In order to structure the knowledge obtained on the metabolism of C. shehatae and tooptimize by simulation the co-culture C. shehatae / S. cerevisiae to produce ethanol fromxylose/ glucose mixtures, a kinetic model of C. shehatae is built. This model is validated withpure substrate cultures (xylose and glucose separated). A kinetic model of co-culture is thenbuilt in order to simulate several fermentation strategies to optimize the ethanol productionfrom xylose/glucose mixture similar to wheat straw hydrolysates

Hidrolisados hemicelulósicos como o resultante do processamento do bagaço de cana-de-açúcar para obtenção do etanol celulósico, constituem uma fonte rica em açúcares, em particular xilose. Considerando o potencial destes hidrolisados para utilização por micro-organismos fermentadores de pentoses e a disponibilidade de leveduras xilanolíticas isoladas da Antártica, a presente pesquisa tem como objetivo avaliar o cultivo destas leveduras no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com vistas à obtenção de bioprodutos. Os experimentos foram realizados empregando-se 16 leveduras xilanolíticas isoladas de diferentes fontes. Inicialmente estas foram repicadas em ágar Sabouraud e cultivadas em diferentes temperaturas, selecionando-se para o cultivo em hidrolisado hemicelulósico aquelas que cresceram neste meio. Os cultivos no hidrolisado foram realizados em triplicata em frascos Erlenmeyer, a 200 rpm, a 30°C em duas etapas: O primeiro ocorreu por 72 h e as leveduras que cresceram neste período foram as empregadas para avaliação do cultivo no hidrolisado e também em meio semi-definido simulando a composição em açúcares deste hidrolisado por um período de 96h. Neste caso as avaliações ocorreram a cada 24h a partir da determinação da concentração de açúcares, formação de células, xilitol e etanol, pH, concentração dos tóxicos ácido acético, hidroximetilfurfural, furfural e fenólicos. O experimento controle foi empregado utilizando-se Candida guillermondii já bastante pesquisada nas fermentações que empregam hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Foi verificado que 6 das leveduras testadas foram capazes de assimilar os açúcares presentes no hidrolisado, sendo que apenas a Cryptococcus adeliensis (L95) apresentou capacidade de produzir etanol como produto deste metabolismo, enquanto as leveduras Cryptococcus aff laurentii (L62), Candida davisiana (L101 e L107) e Cryptococcus adeliensis (L108) apresentaram indícios de atividade xilanolítica. Com relação aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado verificou-se que em alguns cultivos ocorreu decréscimo na concentração destes e a manutenção da viabiliadade celular ao final do cultivo. Considerando o caráter inovador da presente pesquisa faz-se necessário a continuidade da investigação a fim de se estabelecer as melhores condições de cultivo destas leveduras para fins de aproveitamento biotecnológico de hidrolisados hemicelulosicos, em função do desempenho destas em relação à C. guilliermondii. / Hemicellulose hydrolysates, as the result of sugarcane bagasse processing for obtaining cellulosic ethanol, are a rich source of sugars, especially xylose. Considering the potential of these hydrolysates for the use by pentoses fermenting micro-organisms and the availability of xylanolytic yeasts isolated from Antarctica, this research aims to evaluate the cultivation of these yeasts in hemicellulose hydrolysate of sugarcane bagasse in order to obtain bioproducts. The experiments were performed by employing 16 xylanolytic yeasts isolated from different sources. Initially, they were transferred in Sabouraud agar and grown at different temperatures, and those that grew in this medium were selected for cultivation in hemicellulose hydrolysate. The cultures in the hydrolysate were performed in triplicate in Erlenmeyer flasks at 200 rpm at 30 ° C in two stages: The first one occurred for 72 h and the yeasts that grew in this period were used for the evaluation of growth in the hydrolysate and also in semi-defined medium simulating the sugar composition of this hydrolysate for 96h. In this case, the evaluations occurred every 24 hours from the determination of sugars concentration, formation of cell, xylitol and ethanol, pH, concentration of the toxics acetic acid, hydroxymethylfurfural, furfural and phenols. A control experiment was employed using Candida guillermondii which has been well investigated in fermentations employing sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate. It was verified that 6 of the tested yeasts were able to assimilate the sugars present in the hydrolysate, and only Cryptococcus adeliensis (L95) showed ability to produce ethanol as a product of this metabolism, while the yeasts Cryptococcus aff laurentii (L62), Candida davisiana (L101 and L107) and Cryptococcus adeliensis (L108) showed evidences of xylanolytic activity. With respect to toxic compounds present in hydrolysate, it was verified that, in some cultures, the decrease in their concentration and the maintenance of cell viability at the end of cultivation occurred. Due to the innovative nature of this research, it is necessary to continue the investigation in order to establish the best conditions for this yeasts cultivation with the purpose of biotechnological exploitation of hemicellulose hydrolysates, depending on their performance regarding C. guilliermondii.