Esticolisinas I e II (S tI e St II), citolisinas pertencentes à família das actinoporinas, da anêmona Stichodactila heliantus, formam poros em membranas biológicas e modelo onde seu receptor putativo é esfingomielina (SM). A ligação das actinoporinas a membranas ocorre pelo ancoramento da proteína à interface lipídio-água, por uma região rica em resíduos aromáticos. Evidências apontam para o papel fundamental da região N-terminal para formação do poro. O mecanismo proposto para a formação do poro consiste na ligação da toxina à interface membrana-água, oligomerização, e dissociação da região N-terminal do corpo da proteína, cuja α-hélice anfipática interaje com a bicamada, levando à formação de um poro toroidal. Estudos com peptídeos correspondentes à região N-terminal de St II e equinatoxina II (Eqt II) mostraram que estes fragmentos adquirem conformação em α-hélice na presença de membranas modelo, possuindo a capacidade de formar poros em membranas biológicas e modelo, mimetizando o comportamento desta região nas proteínas. St I e St II, que possuem 93% de identidade, apresentam atividades hemolíticas distintas, sendo St II mais ativa. Estudos mostraram que fragmentos da região N-terminal de St I e St II possuem atividades hemolíticas diferentes, e que os primeiros dez resíduos de St II tem papel importante na lise, e na agregação. Para compreender a nível molecular a interação entre o N-terminal das toxinas com membranas e sua dependência da composição lipídica, foram realizados estudos de dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) da interação de quatro fragmentos da região N-terminal de St I (St I1-31 e S t I12-31) e St II (St II1-30 e St II11-30) com membranas modelo - bicamadas e micelas. A interação peptídeo-membrana mostrou-ser dependente: da sequência, e da composição lipídica. Espectros de CD mostraram que a ligação dos peptídeos promove aquisição de estrutura helicoidal; em solução os peptídeos possuem essencialmente estrutura ao acaso. O efeito da ligação dos peptídeos sobre a organização molecular dos lipídios foi monitorado por EPR. Os espectros de EPR mostraram que a ligação a bicamadas e micelas leva ao aumento da organização molecular dos lipídios, St II1-30 alterando o empacotamento molecular em maior extensão. A incorporação de lipídios negativamente carregados e de lipídios formadores de microdomínios ordenados aumentou a afinidade dos peptídeos pelas membranas modelo, especialmente em proporções molares onde ocorre a formação desses microdomínios. Os resultados também indicaram que apenas St II1-30 promoveu alterações significativas no espectro de um marcador de spin fosfolipídico marcado em C16 da cadeia acila incorporado em vesículas multilamelares (MLV), sugerindo que apenas este peptídeo penetra na bicamada, enquanto que os demais permanecem preferencialmente na interface. Os peptídeos interagiram de forma diferente com micelas e bicamadas, provavelmente devido a diferenças no empacotamento molecular nos dois sistemas. A interação diferencial dos peptídeos com bicamadas e micelas poderia refletir as interações com a membrana em diferentes etapas da formação do poro toroidal. Considerando a curvatura positiva na parede de um poro toroidal, a interação com micelas poderia estar mimetizando a topografia desse ambiente. / Sticholysins I and II (S tI and St II), belong to the actinoporins family and are produced by the anemone Stichodactila heliantus. The toxins form pores in biological and model membranes, their putative receptor being sphingomyelin (SM). Binding of actinoporins to membranes occurs via anchoring of an aromatic amino acid-rich region to the lipid-water interface. Evidences point to the importance of the N-terminal region for pore formation. The mechanism proposed for pore formation consists of toxin binding to the membrane-water interface, oligomerization, and dissociation of the N-terminus from the body of the protein. Next, the amphipathic α-helix in this region interacts with the bilayer, forming a toroidal pore. Studies of peptides from St II and equinatoxin II (Eqt II) N-terminus showed that they acquire α-helical conformation upon binding to model membranes and form pores in biological and model membranes, thereby mimicking the conformational and functional behavior of this region in the proteins. St I and St II (93% identity) display different hemolytic activity, St II being more active. Studies showed that fragments of St I and St II N-terminus also display different hemolytic activity, and that the first ten residues of St II play are important for lysis and peptide aggregation. In order to understand at the molecular level the N-terminus-membrane interaction, as well as its dependence on lipid composition, circular dichroism (CD) and electron paramagnetic resonance (EPR) studies of the interaction between four fragments of St I (St I1-31 and S t I12-31) and St II (St II1-30 and St II11-30) with model membranes bilayers and micelles - were performed. The interaction was found to depend on peptide sequence, and lipid composition. CD spectra showed that peptide binding promotes acquisition of helical structure. The effect of binding on lipid molecular organization was monitored by EPR. EPR spectra showed that peptide binding to bilayers and micelles leads to an increase of membrane molecular organization, St II1-30 being more effective. Incorporation of negatively charged lipids and of lipids that ordered microdomains increased peptide affinity for model membranes, especially when they were present at molar proportions known to originate such microdomains. It was found that only St II1-30 promoted significant alterations in the spectra of a phospholipid spin-labeled at C16 incorporated in multilamellar vesicles, (MLV), suggesting that while this peptide penetrates in the bilayer, the others remain preferentially at the interface. The peptides interaction with micelles was both qualitatively and quantitatively different than that with bilayers, electrostatic interactions playing a lesser role in this case. One important reason for the observed differences is probably due to differences in molecular packing in both types of aggregates. The differential interaction with bilayers and micelles could reflect the interaction with membranes indifferent steps of toroidal pore formation. Taking into account the positive curvature of a toroidal pore, the interaction with micelles could represent a model for peptide and lipid organization in the toroidal pore

Esticolisinas I e II (S tI e St II), citolisinas pertencentes à família das actinoporinas, da anêmona Stichodactila heliantus, formam poros em membranas biológicas e modelo onde seu receptor putativo é esfingomielina (SM). A ligação das actinoporinas a membranas ocorre pelo ancoramento da proteína à interface lipídio-água, por uma região rica em resíduos aromáticos. Evidências apontam para o papel fundamental da região N-terminal para formação do poro. O mecanismo proposto para a formação do poro consiste na ligação da toxina à interface membrana-água, oligomerização, e dissociação da região N-terminal do corpo da proteína, cuja α-hélice anfipática interaje com a bicamada, levando à formação de um poro toroidal. Estudos com peptídeos correspondentes à região N-terminal de St II e equinatoxina II (Eqt II) mostraram que estes fragmentos adquirem conformação em α-hélice na presença de membranas modelo, possuindo a capacidade de formar poros em membranas biológicas e modelo, mimetizando o comportamento desta região nas proteínas. St I e St II, que possuem 93% de identidade, apresentam atividades hemolíticas distintas, sendo St II mais ativa. Estudos mostraram que fragmentos da região N-terminal de St I e St II possuem atividades hemolíticas diferentes, e que os primeiros dez resíduos de St II tem papel importante na lise, e na agregação. Para compreender a nível molecular a interação entre o N-terminal das toxinas com membranas e sua dependência da composição lipídica, foram realizados estudos de dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) da interação de quatro fragmentos da região N-terminal de St I (St I1-31 e S t I12-31) e St II (St II1-30 e St II11-30) com membranas modelo - bicamadas e micelas. A interação peptídeo-membrana mostrou-ser dependente: da sequência, e da composição lipídica. Espectros de CD mostraram que a ligação dos peptídeos promove aquisição de estrutura helicoidal; em solução os peptídeos possuem essencialmente estrutura ao acaso. O efeito da ligação dos peptídeos sobre a organização molecular dos lipídios foi monitorado por EPR. Os espectros de EPR mostraram que a ligação a bicamadas e micelas leva ao aumento da organização molecular dos lipídios, St II1-30 alterando o empacotamento molecular em maior extensão. A incorporação de lipídios negativamente carregados e de lipídios formadores de microdomínios ordenados aumentou a afinidade dos peptídeos pelas membranas modelo, especialmente em proporções molares onde ocorre a formação desses microdomínios. Os resultados também indicaram que apenas St II1-30 promoveu alterações significativas no espectro de um marcador de spin fosfolipídico marcado em C16 da cadeia acila incorporado em vesículas multilamelares (MLV), sugerindo que apenas este peptídeo penetra na bicamada, enquanto que os demais permanecem preferencialmente na interface. Os peptídeos interagiram de forma diferente com micelas e bicamadas, provavelmente devido a diferenças no empacotamento molecular nos dois sistemas. A interação diferencial dos peptídeos com bicamadas e micelas poderia refletir as interações com a membrana em diferentes etapas da formação do poro toroidal. Considerando a curvatura positiva na parede de um poro toroidal, a interação com micelas poderia estar mimetizando a topografia desse ambiente. / Sticholysins I and II (S tI and St II), belong to the actinoporins family and are produced by the anemone Stichodactila heliantus. The toxins form pores in biological and model membranes, their putative receptor being sphingomyelin (SM). Binding of actinoporins to membranes occurs via anchoring of an aromatic amino acid-rich region to the lipid-water interface. Evidences point to the importance of the N-terminal region for pore formation. The mechanism proposed for pore formation consists of toxin binding to the membrane-water interface, oligomerization, and dissociation of the N-terminus from the body of the protein. Next, the amphipathic α-helix in this region interacts with the bilayer, forming a toroidal pore. Studies of peptides from St II and equinatoxin II (Eqt II) N-terminus showed that they acquire α-helical conformation upon binding to model membranes and form pores in biological and model membranes, thereby mimicking the conformational and functional behavior of this region in the proteins. St I and St II (93% identity) display different hemolytic activity, St II being more active. Studies showed that fragments of St I and St II N-terminus also display different hemolytic activity, and that the first ten residues of St II play are important for lysis and peptide aggregation. In order to understand at the molecular level the N-terminus-membrane interaction, as well as its dependence on lipid composition, circular dichroism (CD) and electron paramagnetic resonance (EPR) studies of the interaction between four fragments of St I (St I1-31 and S t I12-31) and St II (St II1-30 and St II11-30) with model membranes bilayers and micelles - were performed. The interaction was found to depend on peptide sequence, and lipid composition. CD spectra showed that peptide binding promotes acquisition of helical structure. The effect of binding on lipid molecular organization was monitored by EPR. EPR spectra showed that peptide binding to bilayers and micelles leads to an increase of membrane molecular organization, St II1-30 being more effective. Incorporation of negatively charged lipids and of lipids that ordered microdomains increased peptide affinity for model membranes, especially when they were present at molar proportions known to originate such microdomains. It was found that only St II1-30 promoted significant alterations in the spectra of a phospholipid spin-labeled at C16 incorporated in multilamellar vesicles, (MLV), suggesting that while this peptide penetrates in the bilayer, the others remain preferentially at the interface. The peptides interaction with micelles was both qualitatively and quantitatively different than that with bilayers, electrostatic interactions playing a lesser role in this case. One important reason for the observed differences is probably due to differences in molecular packing in both types of aggregates. The differential interaction with bilayers and micelles could reflect the interaction with membranes indifferent steps of toroidal pore formation. Taking into account the positive curvature of a toroidal pore, the interaction with micelles could represent a model for peptide and lipid organization in the toroidal pore