Melampsora larici-Populina est un champignon biotrophe qui infecte le peuplier et cause la maladie de la rouille foliaire, entraînant d'importants dégâts dans les peupleraies. Un des objectifs de l'UMR Interactions Arbres/Microorganismes est de caractériser les déterminants moléculaires de ce pathosystème. Au cours de cette thèse, des approches post-Génomiques ont permis de mener à bien quatre projets de recherche. Premièrement, l'analyse du transcriptome des temps précoces de l'interaction peuplier/M. larici-Populina a révélé un transporteur de sulfate de peuplier fortement induit par l'infection (chapitre II). Deuxièmement, l'analyse phylogénomique de la famille des thaumatin-Like proteins (TLP) a entre autres mis en évidence certains clades spécifiquement associés aux réponses aux stress chez le peuplier (chapitre III). Troisièmement, le gène codant la petite protéine sécrétée Risp de fonction inconnue est fortement induit lors des réponses de défense du peuplier et n'a pas d'homologue chez les autres plantes. La protéine recombinante est intrinsèquement désordonnée et présente une double activité de protéine antifongique envers M. larici-Populina et d'éliciteur endogène des réponses de défense chez le peuplier (chapitre IV et V). La combinaison de ces deux propriétés n'a jamais été rapportée chez une protéine de plante. Enfin, les gènes MlpP4.1 et MlpH1.1 de M. larici-Populina codent des petites protéines sécrétées riches en cystéines et de fonction inconnue, considérées comme des effecteurs candidats (chapitre VI). L'expression de MlpP4.1 et MlpH1.1 est très fortement induite lors de l'infection des feuilles de peupliers et des activités de virulence ont été observées chez Arabidopsis thaliana. Les analyses biochimique et structurale des protéines recombinantes sont en cours et ont déjà permis de démontrer la forte stabilité de MlpP4.1, probablement liée à la présence de plusieurs ponts disulfures. A l'aide des protéines recombinantes, plusieurs partenaires protéiques ont été identifiés chez les plantes permettant d'établir des hypothèses quant à leur rôle / Melampsora larici-Populina is a biotrophic fungus that infects poplar and causes the foliar rust disease, leading to severe damages in plantations. A major aim of the Tree- Microbe Interactions department is to characterize molecular determinants of the pathosystem. During this thesis, four research projects were achieved through post-Genomic approaches. First, transcriptome analysis of the early interaction between poplar and M. larici-Populina revealed a fungal-Induced host sulfate transporter (chapter II). Secondly, the phylogenomic analysis of the thaumatin-Like protein (TLP) family uncovered some clades specifically associated with stress responses in poplar (chapterIII). Thirdly, the gene encoding the small secreted protein of unknown function Risp is strongly induced during poplar defense reponses and has no homolog in other plants. The recombinant protein is intrinsically disordered and presents a dual activity as an antifungal protein against M. larici-Populina and as an endogenous elicitor of defense responses in poplar (chapter IV and V). The combination of both properties in a single protein has never been reported in plants. Finally, M. larici-Populina MlpP4.1 and MlpH1.1 genes encode cysteine-Rich small-Secreted proteins of unknown fonction, considered as candidate effectors (chapter VI). MlpP4.1 and MlpH1.1 expression is strongly induced during poplar leaf colonization, and virulence activities were observed in Arabidopsis thaliana. Biochemical and structural analyses of recombinant proteins are ongoing and already revealed the strong stability of MlpP4.1, likely due to the presence of several disulfide bridges. Several plant partners of the recombinant proteins were identified and have allowed for setting hypotheses about their role

PA1b (Pea Albumin 1 sous-unité b), une knottine toxique de 37 acides aminés, présente un grand intérêt dans la lutte contre les charançons des céréales (Sitophilus spp.), principaux ravageurs des céréales stockées.<br />Afin de mieux connaître la nouvelle famille peptidique de PA1b, sa variabilité tant structurale que d'activité biologique a été étudiée au sein des Légumineuses. Après avoir validé notre approche sur 4 espèces végétales "test", nous avons caractérisé 24 gènes homologues chez 18 espèces de Papilionoideae. De plus, l'activité insecticide d'extraits de graines de 60 espèces des trois sous-familles de Légumineuses a été déterminée sur charançons de souche sensible et résistante à PA1b. Afin de relier variations de structure et d'activité, une approche par mutagenèse dirigée a été envisagée. Un système d'expression bactérienne et de purification de PA1b a été mis au point. Bien que de masse conforme (cystéines oxydées), le peptide recombinant ne présente pas d'activité biologique.

Les peptides Albumines 1 b sont des membres de la famille structurale des knottines et présentent un potentiel intéressant en tant que composés insecticides. À ce jour, leur diversité parmi les Fabacées a été essentiellement étudiée en utilisant des approches biochimiques et moléculaires. Les ressources bioinformatiques (le séquençage complet du génome, les bases de données transcriptomiques (EST…), les atlas d’expression...) de l’espèce modèle des légumineuses, Medicago truncatula Gaertn. (Mtr), nous a permis de développer une approche génomique de cette biodiversité. Deux objectifs principaux nous ont guidé à : 1) déchiffrer l'histoire évolutive de la famille A1 dans cette espèce et 2) explorer la biodiversité naturelle afin de découvrir de nouvelles molécules bioactives. L'exploration du génome de Mtr a révélé une remarquable expansion, à travers des duplications en tandem, des loci A1 qui retiennent presque toutes la même structure génique canonique (2 exons et 1 intron). L'analyse phylogénétique nous a permis de comprendre l’évolution des gènes A1 intraspécifique et l’analyse de leur expression (EST, puces à ADN) a révélé la distribution de la famille des gènes A1 dans les organes de la plante (tissus) : Cette dernière s’est révélée bien plus diverse que celle connue chez les autres espèces examinées de légumineuses, où la famille était jusque-là principalement graine-spécifique. Selon plusieurs critères, certains peptides ont été sélectionnés puis chimiquement synthétisés et repliés in vitro et testés pour leur activité biologique. Parmi eux, un peptide, nommé AG41, isoforme MtrA1013 et issu de l’EST orpheline TA24778_3880, a révélé un pouvoir insecticide élevé et inattendu. L’analyse à grande échelle en présence d’homologues d’A1 des légumineuses a montré l’ancestralité de la fonction insecticide et l’âge de la famille est estimé à plus de 58 million d’années. Notre étude s’est aussi orientée vers l’analyse de cette famille peptidique chez des légumineuses originaires du Liban. Cette approche par biologie moléculaire nous a permis de caractériser 9 nouveaux gènes chez 6 espèces de Papilionoideae. L’étude plus approfondie de ces gènes au niveau structural et fonctionnel est envisagée. Afin de relier les variations de structure et d'activité, un système d'expression hétérologue (baculovirus/cellules d’insectes Sf9) a été mis au point. Le peptide recombinant de référence PA1b (Pea Albumin 1 sub-unit b), même exprimé en faible quantité, présente une activité biologique et une masse bien conforme ainsi qu’une structure bien repliée. Ce système a permis, de même, de produire la proprotéine PA1, forme intermédiaire entre la préproprotéine et le peptide PA1b mature. Cette proprotéine, identifiée pour la première fois, ne présente aucune toxicité envers les cellules Sf9. / Albumin 1 b peptides are members of the knottin structural family and display an interesting potential as insecticidal compounds. To date their diversity among Fabaceae was essentially investigated using biochemical and molecular approaches. The bioinformatic resources (full-genome sequencing, EST database, gene expression atlas…) of the Legume model, Medicago truncatula Gaertn. (Mtr), prompted us to develop a large-scale approach in two ways: 1) to decipher the evolutionary history of A1 family in this species and 2) to explore the natural biodiversity to uncover new bioactive molecules. Exploring Mtr genome revealed a remarkable expansion, through tandem duplications, of A1 loci that retain nearly all the primary structure (2 exons and 1 intron) . Phylogenetic analysis has allowed us to understand the evolution of intraspecific A1 genes and the analysis of their expression (EST, microarrays), and revealed the distribution of the A1 gene family in plant organs (tissue): the latter proved to be much more diverse than that seen in other examined legumes species, where the family until then was mainly seed-specific. Selected upon several criteria some peptides were chemically synthezised, folded in vitro and assayed for their biological activity. Among them one peptide, named AG41: isoform MtrA1013 (orphan EST : TA24778_3880), revealed a high and unexpected insecticidal power. The large-scale analysis in the presence of legumes A1 homologous showed the ancestry of the isecticidal function and the age of this family is estimated to be more than 58 million years. Our study is also directed towards the analysis of this family of peptide in legumes from Lebanon. This approach based on molecular biology has allowed us to characterize nine new genes in six species of Papilionoideae. The further study of these genes at the structural and functional level is considered. To link changes in structure and activity, a heterologous expression system (baculovirus / insect Sf9 cells) was developed. The reference recombinant peptide PA1b (Pea Albumin 1 sub-unit b), even expressed in small quantities, was biologicaly active and harbouring the expected mass as well as a well-folded structure. This system has enabled also to produce the proprotein PA1, intermediate form between the preproprotein and the mature peptide PA1b. This proprotein, identified for the first time, has no toxicity towards Sf9 cells.