Dans ce travail de thèse, nous avons étudié la variabilité (ou stochasticité) de l’expression des gènes en considérant que le signal stochastique que produit cette expression est porteur d’information quant au processus d’expression lui-même. Cette stochasticité de l’expression génique peut être caractérisée par la variation observée du nombre de protéines produites soit entre différentes cellules isogéniques (portant le même génome) à un instant donné, soit au sein d’une même cellule au cours du temps. Dans un premier temps, nous avons montré expérimentalement que le niveau de stochas- ticité de l’expression d’un gène change suivant son locus (sa position sur le génome). De plus, nous avons montré que, à locus constant, le niveau de stochasticité peut être influencé par des agents modificateurs globaux de l’état chromatinien. Ensuite, nous avons analysé comment la dynamique chromatinienne peut influencer la stochasticité de l’expression génique d’un gène. Pour ce faire, nous avons utilisé une ap- proche de modélisation et simulation que nous avons ensuite confrontée à des données biologiques. L’utilisation d’un modèle à deux états nous a permis de montrer que l’acti- vité du promoteur est caractérisée par de longues périodes durant lesquelles la chromatine empêche la transcription, entrecoupées par de brèves périodes où la transcription est à nouveau rendue possible sous forme de « bursts » de forte intensité. Pour finir, nous avons identifié, par des approches statistiques et par l’utilisation de bases de données génomiques, des éléments caractéristiques de la séquence génomique qui, lors- qu’ils sont présents dans le voisinage d’un gène, peuvent influer sur la stochasticité de celui-ci. Nous avons en particulier montré que, lorsque le gène rapporteur est inséré à proximité d’un autre gène, sa stochasticité augmente de manière significative. Ce travail nous a permis de mettre en évidence un lien entre la dynamique chromatinienne, l’environnement génomique et la stochasticité de l’expression génique. Ce lien offre à la cellule des perspectives évolutives en lui permettant de réguler cette stochasticité, ouvrant ainsi la porte à la sélection d’un niveau approprié de variabilité. / During my PhD, we have studied the variability (or stochasticity) of gene expression assuming that the stochastic signal it produces carries information about the process of gene expression itself. The stochasticity of gene expression can be characterized by the observed variation in the number of proteins produced either by different isogenic cells (cells that have the same genome) at a given time or within a single cell over time. First, we showed experimentally that the level of stochasticity of a gene changes according to its locus (its position on the genome). We have also shown that, for a given locus, the level of stochasticity could be influenced by global chromatin-state modifier agents. Then, we analyzed how the chromatin dynamics can influence the stochasticity of gene expression. This analysis was conducted by using a modeling and simulation approach, the results of which being in turn compared to biological data. Using a two-states model allowed me to show that the activity of a promoter is characterized by long periods during which the chromatin prevents transcription, interspersed by brief periods when transcription can occur in the form of intense bursts. Finally, we identified characteristic genomic elements that, when in the neighbourhood of a gene, may influence its level of stochasticity. In particular, we have shown that when the reporter gene is integrated close to a neighbour gene, its stochasticity is significantly increased. This work allowed me to unravel a link between the chromatin dynamics, the genomic environment and the stochasticity of gene expression. This link confers evolutionary pers- pectives to the cell by allowing it to regulate stochasticity, which allows for the selection of an appropriate level of stochasticity.

Un contexte réglementaire de plus en plus strict en évaluation du risque écotoxicologique des milieux aquatiques exige de renforcer les outils d’évaluation. A ce titre, l’étude des biomarqueurs de génotoxicité doit être privilégiée, compte tenu du rôle central de l’ADN dans le fonctionnement du vivant. L’exposition à des agents génotoxiques peut générer des dommages par interaction directe avec l’ADN, mais aussi indirectement, en modulant l’efficacité des mécanismes de réparation de l’ADN, ou la régulation épigénétique de l’expression des gènes. Aujourd’hui, la plupart des biomarqueurs de génotoxicité visent les dommages primaires à l’ADN ou la mutagènicité mais les effets indirects sur sa fonctionnalité sont encore peu étudiés. Dans ce contexte, à l’issue d’une analyse bibliographique comprenant la rédaction d’une revue sur les mécanismes de réparation des dommages à l’ADN chez le poisson, ce travail visait au développement méthodologique de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité à l’aide de trois lignées cellulaires pisciaires (RTL-W1, RTGill-W1 et PLHC-1). Pour ce faire, l’essai des comètes en conditions alcalines a été décliné sous plusieurs versions dans l’objectif d’utiliser une technique de base unique permettant la mesure complémentaire de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité : les dommages primaires à l’ADN, les activités de réparation et le niveau de méthylation des cytosines du génome. Les résultats soulignent l’intérêt des trois lignées en évaluation de la génotoxicité 1) pour détecter in vitro de manière sensible des atteintes primaires à l’ADN de natures variées à de faibles concentrations grâce à un essai des comètes modifié par une étape de digestion enzymatique avec une glycosylase (Fpg), 2) pour évaluer l’influence des contaminants sur l’activité de réparation par excision de bases (BER) via la mesure de la capacité d’incision d’un ADN substrat porteur de lésions de type 8-oxoGua par des extraits cellulaires (essai BERc). Le niveau de méthylation des cytosines (5-meCyt) des lignées RTgill-W1et RTL-W1 a été mesuré par HPLC-MS-MS, leur valeur élevée permet d’envisager le paramètre méthylation comme biomarqueur potentiel. Ce volet nécessitera cependant des étapes de validations ultérieures car il n’a pas été techniquement possible de mettre au point un essai des comètes modifié pour la mesure du niveau de méthylation de l’ADN. Plusieurs activités de réparation des lignées RTgill-W1 et RTL-W1 ont été caractérisées et révèlent de bonnes aptitudes de réparation de type « Base Excision Repair » (BER) et « Photo Enzymatic Repair » (PER) et une plus faible capacité au « Nucleotide Excision Repair » (NER), soit un profil proche de celui décrit in vivo et sans différence marquée entre les deux lignées. Les biomarqueurs développés sur les lignées cellulaires de poisson au cours de ce travail ont également été appliqués à la mesure des effets génotoxiques d’effluents issus du lessivage de revêtements routiers. / In a context of growing awareness of aquatic pollution impacts, there is an increasing need to develop methods for hazards and risk assessment of pollutants. In this context, genotoxicity endpoints are of a great concern since even when evaluated at a sub-cellular or cellular level, impaired DNA structure, repair and/or functions can have delayed (long term) consequences at higher level of organization such as individual and population. Some genotoxicant can have direct effect on DNA, but they can also interact indirectly, by modulating the repair mechanism efficiency or by acting on epigenetic mechanism such as DNA méthylation level. An unrepaired DNA damage and epigenetic modification can both lead to functional alteration and/or genetic structure at the population level. However, most of the existing genotoxicity test only measure primary DNA damage induces by genotoxicant; thus there is a real need to develop new tools to investigate those different kinds of genotoxicity. For this purpose, this work aims at developing knowledge in DNA repair capacities of to fish cell lines, RTL-W1 and RTG-W1, in order to develop new genotoxicity biomarker, measuring primary DNA damage by means of modified version of the comet assay. The results highlights the interest of in vitro biological models such as fish cell lines for the assessment of environmental genotoxicity, especially using a Fpg-modified comet assay allowing a sufficient increase of the assay sensibility to detect genotoxicity at environmentally relevant concentration. Results also characterize BER and PER capacities as being efficient repair mechanism in those fish cell lines, whereas NER, although also present, seems less efficient. A new biomarker based on the BER incision capacities of cellular extracts has also been developed and used to assess the genotoxicity of environemental effluent.

Les peptides Albumines 1 b sont des membres de la famille structurale des knottines et présentent un potentiel intéressant en tant que composés insecticides. À ce jour, leur diversité parmi les Fabacées a été essentiellement étudiée en utilisant des approches biochimiques et moléculaires. Les ressources bioinformatiques (le séquençage complet du génome, les bases de données transcriptomiques (EST…), les atlas d’expression...) de l’espèce modèle des légumineuses, Medicago truncatula Gaertn. (Mtr), nous a permis de développer une approche génomique de cette biodiversité. Deux objectifs principaux nous ont guidé à : 1) déchiffrer l'histoire évolutive de la famille A1 dans cette espèce et 2) explorer la biodiversité naturelle afin de découvrir de nouvelles molécules bioactives. L'exploration du génome de Mtr a révélé une remarquable expansion, à travers des duplications en tandem, des loci A1 qui retiennent presque toutes la même structure génique canonique (2 exons et 1 intron). L'analyse phylogénétique nous a permis de comprendre l’évolution des gènes A1 intraspécifique et l’analyse de leur expression (EST, puces à ADN) a révélé la distribution de la famille des gènes A1 dans les organes de la plante (tissus) : Cette dernière s’est révélée bien plus diverse que celle connue chez les autres espèces examinées de légumineuses, où la famille était jusque-là principalement graine-spécifique. Selon plusieurs critères, certains peptides ont été sélectionnés puis chimiquement synthétisés et repliés in vitro et testés pour leur activité biologique. Parmi eux, un peptide, nommé AG41, isoforme MtrA1013 et issu de l’EST orpheline TA24778_3880, a révélé un pouvoir insecticide élevé et inattendu. L’analyse à grande échelle en présence d’homologues d’A1 des légumineuses a montré l’ancestralité de la fonction insecticide et l’âge de la famille est estimé à plus de 58 million d’années. Notre étude s’est aussi orientée vers l’analyse de cette famille peptidique chez des légumineuses originaires du Liban. Cette approche par biologie moléculaire nous a permis de caractériser 9 nouveaux gènes chez 6 espèces de Papilionoideae. L’étude plus approfondie de ces gènes au niveau structural et fonctionnel est envisagée. Afin de relier les variations de structure et d'activité, un système d'expression hétérologue (baculovirus/cellules d’insectes Sf9) a été mis au point. Le peptide recombinant de référence PA1b (Pea Albumin 1 sub-unit b), même exprimé en faible quantité, présente une activité biologique et une masse bien conforme ainsi qu’une structure bien repliée. Ce système a permis, de même, de produire la proprotéine PA1, forme intermédiaire entre la préproprotéine et le peptide PA1b mature. Cette proprotéine, identifiée pour la première fois, ne présente aucune toxicité envers les cellules Sf9. / Albumin 1 b peptides are members of the knottin structural family and display an interesting potential as insecticidal compounds. To date their diversity among Fabaceae was essentially investigated using biochemical and molecular approaches. The bioinformatic resources (full-genome sequencing, EST database, gene expression atlas…) of the Legume model, Medicago truncatula Gaertn. (Mtr), prompted us to develop a large-scale approach in two ways: 1) to decipher the evolutionary history of A1 family in this species and 2) to explore the natural biodiversity to uncover new bioactive molecules. Exploring Mtr genome revealed a remarkable expansion, through tandem duplications, of A1 loci that retain nearly all the primary structure (2 exons and 1 intron) . Phylogenetic analysis has allowed us to understand the evolution of intraspecific A1 genes and the analysis of their expression (EST, microarrays), and revealed the distribution of the A1 gene family in plant organs (tissue): the latter proved to be much more diverse than that seen in other examined legumes species, where the family until then was mainly seed-specific. Selected upon several criteria some peptides were chemically synthezised, folded in vitro and assayed for their biological activity. Among them one peptide, named AG41: isoform MtrA1013 (orphan EST : TA24778_3880), revealed a high and unexpected insecticidal power. The large-scale analysis in the presence of legumes A1 homologous showed the ancestry of the isecticidal function and the age of this family is estimated to be more than 58 million years. Our study is also directed towards the analysis of this family of peptide in legumes from Lebanon. This approach based on molecular biology has allowed us to characterize nine new genes in six species of Papilionoideae. The further study of these genes at the structural and functional level is considered. To link changes in structure and activity, a heterologous expression system (baculovirus / insect Sf9 cells) was developed. The reference recombinant peptide PA1b (Pea Albumin 1 sub-unit b), even expressed in small quantities, was biologicaly active and harbouring the expected mass as well as a well-folded structure. This system has enabled also to produce the proprotein PA1, intermediate form between the preproprotein and the mature peptide PA1b. This proprotein, identified for the first time, has no toxicity towards Sf9 cells.

Bien que de nombreuses séquences génomiques soient maintenant connues, les mécanismes évolutifs qui déterminent la taille des génomes, et notamment leur part d’ADN non codant, sont encore débattus. Ainsi, alors que de nombreux mécanismes faisant grandir les génomes (prolifération d’éléments transposables, création de nouveaux gènes par duplication, ...) sont clairement identifiés, les mécanismes limitant la taille des génomes sont moins bien établis. La sélection darwinienne pourrait directement défavoriser les génomes les moins compacts, sous l’hypothèse qu’une grande quantité d’ADN à répliquer limite la vitesse de reproduction de l’organisme. Cette hypothèse étant cependant contredite par plusieurs jeux de données, d’autres mécanismes non sélectifs ont été proposés, comme la dérive génétique et/ou un biais mutationnel rendant les petites délétions d’ADN plus fréquentes que les petites insertions. Dans ce manuscrit, nous montrons à l’aide d’un modèle matriciel de population que la taille du génome peut aussi être limitée par la dynamique spontanée des duplications et des grandes délétions, qui tend à raccourcir les génomes même si les deux types de réarrangements se produisent à la même fréquence. En l’absence de sélection darwinienne, nous prouvons l’existence d’une distribution stationnaire pour la taille du génome même si les duplications sont deux fois plus fréquentes que les délétions. Pour tester si la sélection darwinienne peut contrecarrer cette dynamique spontanée, nous simulons numériquement le modèle en choisissant une fonction de fitness qui favorise directement les génomes contenant le plus de gènes, tout en conservant des duplications deux fois plus fréquentes que les délétions. Dans ce scénario où tout semblait pousser les génomes à grandir infiniment, la taille du génome reste pourtant bornée. Ainsi, notre étude révèle une nouvelle force susceptible de limiter la croissance des génomes. En mettant en évidence des comportements contre-intuitifs dans un modèle pourtant minimaliste, cette étude souligne aussi les limites de la simple « expérience de pensée » pour penser l’évolution. / Even though numerous genome sequences are now available, evolutionary mechanisms that determine genome size, notably their fraction of non-coding DNA, are still debated. In particular, although several mechanisms responsible for genome growth (proliferation of transposable elements, gene duplication and divergence, etc.) were clearly identified, mechanisms limiting the overall genome size remain unclear. Darwinian selection could directly disadvantage less compact genomes, under the hypothesis that a larger quantity of DNA could slow down the speed of reproduction of the organism. Because this hypothesis was proven wrong by several datasets, non selective mechanisms have been proposed, e.g. genetic drift and/or a mutational bias towards small DNA deletions compared to small DNA insertions. In this manuscript, we use a matrix model to show that genome size can also be limited by the spontaneous dynamics of duplications and large deletions, which tends to decrease genome size even if the two types of rearrangements occur at the same rate. In the absence of Darwinian selection, we prove the existence of a stationary distribution of genome size even if duplications are twice as frequent as large deletions. To test whether selection can overcome this spontaneous dynamics, we simulate our model numerically and choose a fitness function that directly favors genomes containing more genes, while keeping duplications twice as frequent as large deletions. In this scenario where, at first sight, everything seems to favor infinite genome growth, genome size remains nonetheless bounded. As a result, our study reveals a new pressure that could be responsible for limiting genome growth. By illustrating counter-intuitive behaviors in a minimal model, this study also underlines the limits of simple "thought experiments" to understand evolution.