No description available.

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie. / The central objective of this doctoral thesis was to investigate the mitochondrial dysfunction that occurs early during the compensated phase of pathological ventricular remodeling and which may play a causal role in the progression to heart failure. Our previous work using a model of chronic volume overload induced by aorto-caval fistula (ACF) in rats WKHA showed that during the ventricular remodeling, mitochondria developed a vulnerability to permeability transition pore opening (PTP: a key component of cell death signaling) [1]. This was observed at the stage of compensated remodeling in the absence of major mitochondrial dysfunction typically observed in the failing heart. These results led us to suggest that the vulnerability to PTP opening could be a mechanism facilitating the progression of the cardiomyopathy. In our first study of this thesis we have attempted to test this hypothesis by inducing ACF in two strains of rats displaying sharp differences in the propensity to develop heart failure: WKHA strains and Sprague Dawley (SD). Our studies in vitro on isolated organelles and in situ on the whole organ have confirmed that, in the ACF heart, mitochondria develop a vulnerability to PTP opening and activation of mitochondrial cell death when exposed to stresses relevant to the pathology (calcium overload, ischemia-reperfusion [I-R]). However, SD animals compared to WKHA showed a more rapid and pronounced ventricular remodeling and early progression to heart failure, no difference was found between the two groups in terms of mitochondrial dysfunction, suggesting that this is not behind the more rapid progression of the disease in the SD strain, at least in response to volume overload. We subsequently determined, using the same experimental approaches, if this vulnerability was observed in mitochondria of heart disease from other etiology more specifically that associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic disease caused by a mutation of the protein dystrophin. Our studies (studies 2-4) on young mdx mice (the mouse model of DMD) free of clinical signs of heart disease showed no difference in basal mitochondrial functions. However, as in the model of ACF, the mitochondria of mdx mice heart were significantly more vulnerable to PTP opening when subjected to I-R (study 2). Furthermore, we demonstrated that acute administration of sildenafil to mdx mice abolished the PTP opening and its signaling consequences, markedly reduced of tissue damage and improved functional recovery following I-R (Study 3). We then tested in mdx mice acute administration of SS31, an antioxidant peptide that targets and accumulates in mitochondria. However, no protective effect was observed, suggesting that the buffering of free radicals have a limited utility if the typical perturbations of the calcium homeostasis in this disease are not treated simultaneously (Study 4). Overall, the work done during this thesis show that the vulnerability to PTP opening is a common and early dysfunction that occurs during pathological ventricular remodeling of different etiologies. Moreover, these studies suggest pharmacological intervention strategies targeting this process, whose effectiveness in preventing heart failure needs to be established.

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.

Le zinc est un métal, membre des éléments trace dont le rôle protecteur contre l’ischémie-reperfusion myocardique a été suggéré. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le mécanisme par lequel le zinc procure cette protection. Nous avons utilisé des cultures cellulaires de cardiomyoblastes de rat, des cardiomyocytes isolés de rat, des mitochondries isolées ainsi qu’un modèle de cœur isolé perfusé de rat. Nous avons montré que l'administration de zinc au début de la reperfusion permet de diminuer la mort cellulaire sur un modèle d’ischémie-reperfusion simulée. Nous avons montré que l’administration de zinc entraine l’activation de la cascade des kinases de survie (PI-3K/Akt), l’inhibition de GSK-3β et celle de l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial. Nous avons ensuite montré qu’en présence de zinc, l’activation d’Akt provenait d’une inhibition de certaines phosphatases et d’une activation du domaine tyrosine kinase du récepteur IGF-1. Nos derniers travaux ont eu pour but de préciser le rôle du zinc suite à l'activation des récepteurs à adénosine. / Zinc is a member of the family of the metal trace elements and its role in the protection against lethal reperfusion injury has been strongly suggested. The aim of the present work was to determine the molecular mechanisms involved in zinc cardioprotection. We have used cultured rat cardiomyoblasts, isolated rat cardiomyocytes, isolated mitochondria and isolated perfused rat heart. We demonstrated that zinc given at reperfusion, limits cell necrosis in a model of simulated ischemia-reperfusion. Administration of zinc results in activation of the reperfusion-injury salvage kinases pathway (PI-3K/Akt), inhibition of GSK-3β and of the opening of the mitochondrial permeability transition pore. We then showed that, in the presence of zinc, activation of Akt is mediated by the inhibition of various phosphatases and by activation of the tyrosine kinase domain of the IGF-1 receptor. Our latest experiments report the action of zinc following activation of adenosine receptors

La maladie coronaire d’origine ischémique reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde industrialisé.Le traitement de l’ischémie aiguë du myocarde est entré dans une nouvelle ère où la mortalité peut être diminuée de moitié en utilisant des procédures qui permettent un retour rapide du débit sanguin dans la zone ischémique du myocarde: la revascularisation.Cette reperfusion entraîne des complications appelées lésions de la reperfusion qui ont été décrites pour la 1ère fois par Jennings et al., en 1960. Le développement de stratégies cardioprotectrices associées à la reperfusion constitue un besoin majeur en clinique afin d’améliorer la fonction myocardique, de diminuer l'incidence des arythmies, de retarder l'apparition de la mort cardiomyocytaire et de limiter la taille de l’infarctus du myocarde lors de l'ischémie/reperfusion (I/R).La découverte de 2 formes principales de mécanismes cardioprotecteurs endogènes, a encouragé la recherche de nouveaux moyens pharmacologiques capables de protéger le myocarde ischémié/reperfusé et a développé nos connaissances sur les bases moléculaires des lésions et de la survie cellulaire au cours des processus d’I/R.L’étude des mécanismes responsables de l’induction de la mort cellulaire a permis de mettre en évidence le rôle joué par la mitochondrie et l’augmentation de la perméabilité de ses membranes, induite par la formation/ouverture d’un pore au niveau des points de contacts entre les membranes mitochondriales;ce pore a été appelé « pore de transition de la perméabilité mitochondriale » (mPTP).L’inhibition de l’ouverture de ce pore apparaît comme une stratégie privilégiée pour protéger le myocarde.Des études ont montré que les espèces réactives d’oxygène (EROs) jouent un rôle majeur dans les lésions de l’I/R et dans l’ouverture du mPTP.Il existe peu d’informations claires sur le seuil et la période de production (ischémie et/ou reperfusion) des EROs qui conduisent à l’ouverture du mPTP.Nous avons mis au point un modèle cellulaire d’hypoxie/réoxygénation (H/R) afin d’établir une relation causale entre la production d’EROs, l’ouverture du mPTP et la mort cellulaire tout en explorant le rôle de différents types d’EROs.Ce modèle d’H/R nous a permis de mesurer en temps réel et simultanément la production des EROs, l’ouverture du mPTP et la mort cellulaire.Nous avons montré que la production des EROs débute pendant la période d’hypoxie et qu’elle est directement liée à l’augmentation du temps d’hypoxie.Cette production d’EROs à l’hypoxie, plus particulièrement de radicaux hydroxyles et de peroxyde d’hydrogène, a été directement relié, à l’ouverture du mPTP et à la mort cellulaire lors de l’H/R.Nous avons utilisé ce modèle pour étudier le mécanisme d’action de deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices, un nouveau ligand de la protéine translocatrice mitochondriale (TSPO), le TRO 40303, et l’activation de la voie RISK par la morphine. Nous avons ainsi montré que (1) les propriétés cardioprotectrices du TRO40303 sont associées à une inhibition de l’ouverture du mPTP, ce qui n’avait pas pu être démontré au moyen d’expériences réalisées ex vivo et (2) l’activation de la voie RISK par la morphine, qui aboutit à une limitation de la taille d’infarctus associée à une amélioration des fonctions respiratoires mitochondriales, entraîne également une inhibition de l’ouverture du mPTP et un retard de la mort cellulaire des cardiomyocytes isolés soumis à une H/R.La suite de ce travail sera de rechercher si l’inhibition du stress oxydant peut constituer un mécanisme commun aux deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices en utilisant notre modèle d’H/R.Il serait possible d’étendre notre modèle à des animaux génétiquement modifiés pour appréhender les phénomènes impliqués dans cette activité antioxydante.A plus long terme, il sera nécessaire d’approfondir nos connaissances sur la production d’EROs pendant l’I/R en recherchant plus spécifiquement l’origine de cette production. / Ischemic coronary artery disease remains one of the main causes of mortality in the industrialized countries. The treatment of acute myocardial ischemia entered a new era where mortality can be reduced by 50% using revascularization procedures that allow a rapid return of blood flow to the ischemic area. However, this reperfusion leads to complications known as lethal reperfusion induced injury that have been described for the first time by Jennings et al., in 1960. It became crucial to develop cardioprotective strategies in combination with early reperfusion in order to improve myocardial function, to reduce the incidence of arrhythmias, to delay the onset of cardiomyocytes death and to limit the extension of infarct size following reperfusion. The discovery of two major forms of endogenous cardioprotective mechanisms, which consist of the realization of short cycles of ischemia/reperfusion (I/R) prior to a long period of ischemia (ischemic preconditioning) or before reperfusion after the long period of ischemia (Ischemic Postconditioning), encouraged the search for new pharmacological tools to protect the ischemic myocardium to develop our knowledge on the molecular mechanisms of lethal reperfusion injury and cell survival in the I/R process.The study of cell death mechanisms has highlighted the crucial role of the mitochondria and more specifically the increase in mitochondrial membrane permeability following I/R.One reason for increasing permeability is the formation/opening of a pore at mitochondrial membranes contact sites at reperfusion.This pore has been called "the mitochondrial permeability transition pore" (mPTP). Inhibition of this pore opening has been presented as a main strategy to protect the myocardium.Many studies have shown that reactive oxygen species (ROS) play a major role in I/R injury and mPTP opening, but there is very few information to date about the threshold and the period of ROS production (ischemia and/or reperfusion) that lead to mPTP opening.We designed a cellular model of hypoxia/reoxygenation (H/R) to establish a causal relationship between ROS production, mPTP opening and cell death while exploring the role of different types of ROS.This H/R model used freshly isolated adult rat cardiomyocytes and allowed us to measure online and simultaneously ROS production, mPTP opening and cell death. We have demonstrated that ROS production starts during the period of hypoxia and thisproduction is directly linked to the increase in the duration of hypoxia.This ROS production during hypoxia has been, for the first time, directly related to mPTP opening and cell death following H/R.We used this model to study the mechanism of action of two cardioprotective strategies, a new ligand of the mitochondrial translocator protein (TSPO), TRO 40303 and a RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) pathway activator, morphine. We have shown that (1) the cardioprotective properties of TRO40303 were associated with inhibition of mPTP opening, a mechanism that could not be demonstrated using ex vivo experiments and (2) morphine that provoked infarct size limitation associated with an improvement of mitochondrial respiratory functions through RISK pathway activation, also inhibited mPTP opening and delayed cell death of isolated cardiomyocytes subjected to H/R.Finally, a question comes into sight whether the inhibition of oxidative stress may be a common mechanism to both cardioprotective pharmacological strategies that we have described using our H/R model. To do this, it would be possible to extend our model to genetically modified animals specifically adapted to understand the phenomena involved in antioxidant activity.On long-term, it will be necessary to develop our knowledge on ROS production during I/R by looking for the origin of this production, more precisely the role of the mitochondria and the effect of other reactive species in order to target the treatment and to develop new cardioprotective strategies.

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie. / The central objective of this doctoral thesis was to investigate the mitochondrial dysfunction that occurs early during the compensated phase of pathological ventricular remodeling and which may play a causal role in the progression to heart failure. Our previous work using a model of chronic volume overload induced by aorto-caval fistula (ACF) in rats WKHA showed that during the ventricular remodeling, mitochondria developed a vulnerability to permeability transition pore opening (PTP: a key component of cell death signaling) [1]. This was observed at the stage of compensated remodeling in the absence of major mitochondrial dysfunction typically observed in the failing heart. These results led us to suggest that the vulnerability to PTP opening could be a mechanism facilitating the progression of the cardiomyopathy. In our first study of this thesis we have attempted to test this hypothesis by inducing ACF in two strains of rats displaying sharp differences in the propensity to develop heart failure: WKHA strains and Sprague Dawley (SD). Our studies in vitro on isolated organelles and in situ on the whole organ have confirmed that, in the ACF heart, mitochondria develop a vulnerability to PTP opening and activation of mitochondrial cell death when exposed to stresses relevant to the pathology (calcium overload, ischemia-reperfusion [I-R]). However, SD animals compared to WKHA showed a more rapid and pronounced ventricular remodeling and early progression to heart failure, no difference was found between the two groups in terms of mitochondrial dysfunction, suggesting that this is not behind the more rapid progression of the disease in the SD strain, at least in response to volume overload. We subsequently determined, using the same experimental approaches, if this vulnerability was observed in mitochondria of heart disease from other etiology more specifically that associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic disease caused by a mutation of the protein dystrophin. Our studies (studies 2-4) on young mdx mice (the mouse model of DMD) free of clinical signs of heart disease showed no difference in basal mitochondrial functions. However, as in the model of ACF, the mitochondria of mdx mice heart were significantly more vulnerable to PTP opening when subjected to I-R (study 2). Furthermore, we demonstrated that acute administration of sildenafil to mdx mice abolished the PTP opening and its signaling consequences, markedly reduced of tissue damage and improved functional recovery following I-R (Study 3). We then tested in mdx mice acute administration of SS31, an antioxidant peptide that targets and accumulates in mitochondria. However, no protective effect was observed, suggesting that the buffering of free radicals have a limited utility if the typical perturbations of the calcium homeostasis in this disease are not treated simultaneously (Study 4). Overall, the work done during this thesis show that the vulnerability to PTP opening is a common and early dysfunction that occurs during pathological ventricular remodeling of different etiologies. Moreover, these studies suggest pharmacological intervention strategies targeting this process, whose effectiveness in preventing heart failure needs to be established.

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.

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Le postconditionnement cardiaque est paradoxal chez le rat. Certains auteurs ont montré que cet animal pouvait être protégé par le postconditionnement alors que d’autres ont montré qu’il était inefficace. L’objectif de notre travail était d’éclaircir cette situation et d’établir un lien entre la régulation des fonctions mitochondriales et la réussite ou l’échec du postconditionnement. Nous avons montré sur un modèle in vivo que le rat est sensible au postconditionnement cardiaque sous certaines conditions. Il semble que la réussite de cette thérapie nécessite à la fois une préservation de la phosphorylation oxydative, une inhibition de l’ouverture du mPTP et une diminution de la production de ROS. Nous avons également montré que le complexe I de la chaîne respiratoire régule l’ouverture du mPTP en liaison avec l’état de la Cyp D. L’ensemble de nos résultats montrent que le rat n’est pas réfractaire au postconditionnement, mais pour que celui-ci soit efficace, il est nécessaire de préserver l’intégrité des différentes fonctions mitochondriales. La cardioprotection et la régulation des fonctions mitochondriales sont donc spécifiquement liées au modèle utilisé / Cardiac postconditioning is paradoxical in rat. Certain authors showed that this animal could be protected by postconditioning whereas others showed that it was ineffective. The objective of our work was to clarify this situation and to establish a link between the regulation of the mitochondrial functions and the success or the failure of postconditioning. We showed on an in vivo model that the rat is sensitive to cardiac postconditioning under certain conditions. It seems that the success of this therapy requires at the same time a safeguarding of oxidative phosphorylation, an inhibition of the mitochondrial permeability transition pore opening and a reduction in the ROS production. We also showed that complex I of the respiratory chain controls the opening of the mPTP in relation with the state of Cyp D. Our results show that the rat is not insensitive to postconditioning, but it is necessary to preserve the integrity of the mitochondrial functions to be effective. The cardioprotection and the regulation of the mitochondrial functions are specifically related to the model used

L’I/R et la cardioprotection par PreC et PostC impactent la fonction mitochondriale et plus précisément le mPTP. Le mPTP est non seulement modulé par des protéines qui participent à sa formation comme la CypD mais aussi par l’environnement cellulaire. Le but de ma thèse a été d’étudier la régulation du mPTP par la CypD, le complexe I et le Ca2+ durant l’I/R et la cardioprotection. Nos conclusions sont : 1. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale régule l’ouverture du mPTP et cela de façon CypD-dépendante. 2. Le PostC est un inhibiteur du complexe I, l’Iso, est le seul PostC efficace chez le rat in vivo. 3. L’inhibition pharmacologique ou génétique de la CypD cardioprotège en modulant l’ouverture du mPTP et l’homéostasie calcique. 4. La CypD a un nouveau rôle dans la cardioprotection, indépendamment de son action sur le mPTP. En effet, elle module le transfert calcique au niveau des MAM et plus précisément le transfert de Ca2+ entre les RS et la mitochondrie. Son inhibition prévient la surcharge calcique mitochondriale intervenant lors de l’I/R. L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que le mPTP est régulé par de nombreux facteurs interconnectés. Le Ca2+ est l’effecteur principal de l’ouverture du mPTP. La CypD a une action Ca2+ dépendante et module l’homéostasie calcique au niveau des MAM. Le complexe I régule l’ouverture du mPTP de façon CypD dépendante. Enfin les fonctions mitochondriales cardioprotecteurs mPTP-dépendants englobe la CypD, le Ca2+, le complexe I et les fonctions mitochondriales. Cette vision plus large et intégrée de la régulation du mPTP pourra donner des pistes plus efficaces dans le développement de traitements pharmacologiques cardioprotecteurs / Reperfusion of the heart after an ischemic event leads to the opening of a nonspecific pore in the inner mitochondrial membrane, the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Inhibition of mPTP opening is an effective strategy to prevent cardiomyocyte death. For example, inhibition of mPTP opening via ischaemic preconditioning (PreC) and post-conditioning (PostC) decreased the myocardial infarct size after ischemia–reperfusion. Although the molecular composition of the mPTP remains unclear, the matrix protein cyclophilin-D (CypD) is the best defined regulatory component of mPTP. In this thesis, we demonstrated that Complex I of the respiratory mitochondrial chain also regulates mPTP in a CypD-dependent manner. We also proved that inhibition of Complex I by isoflurane prevents lethal reperfusion injury in an in vivo rat model of ischemia-reperfusion. Finally, we proved that cardioprotective inhibition of CypD modulates calcium homeostasis and fluxes between mitochondria and sarcoplasmic reticulum. In summary, our results suggest that mPTP is regulated by several interconnected factors like calcium, CypD, complex I and mitochondrial functions