La régulation de l’homéostasie du fer est cruciale chez les bactéries. Chez Salmonella, l’expression des gènes d’acquisition et du métabolisme du fer au moment approprié est importante pour sa survie et sa virulence. Cette régulation est effectuée par la protéine Fur et les petits ARN non codants RfrA et RfrB. Le rôle de ces régulateurs est d’assurer que le niveau de fer soit assez élevé pour la survie et le métabolisme de Salmonella, et assez faible pour éviter l’effet toxique du fer en présence d’oxygène. Les connaissances concernant le rôle de ces régulateurs ont été principalement obtenues par des études chez S. Typhimurium, un sérovar généraliste causant une gastro-entérite chez les humains. Très peu d’informations sont connues sur le rôle de ces régulateurs chez S. Typhi, un sérovar humain-spécifique responsable de la fièvre typhoïde. Le but de cette étude était de déterminer les rôles de Fur, RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella, et de démontrer qu’ils ont une implication distincte chez les sérovars Typhi et Typhimurium. Premièrement, Fur, RfrA et RfrB régulent l’homéostasie du fer de Salmonella. Les résultats de cette étude ont démontré que Fur est requis pour la résistance au stress oxydatif et pour une croissance optimale dans différentes conditions in vitro. La sensibilité du mutant fur est due à l’expression des petits ARN RfrA et RfrB, et cette sensibilité est beaucoup plus importante chez S. Typhi que chez S. Typhimurium. Également, Fur inhibe la transcription des gènes codant pour les sidérophores en conditions riches en fer, tandis que les petits ARN RfrA et RfrB semblent être importants pour la production d’entérobactine et de salmochélines chez S. Typhi lors de conditions pauvres en fer. Ensuite, ces régulateurs affectent la virulence de Salmonella. Fur est important pour la motilité de Salmonella, particulièrement chez S. Typhi. Fur est nécessaire pour l’invasion des deux sérovars dans les cellules épithéliales, et pour l’entrée et la survie de S. Typhi dans les macrophages. Chez S. Typhimurium, Fur ne semble pas impliqué dans l’interaction avec les macrophages. De plus, les petits ARN RfrA et RfrB sont importants pour la multiplication intracellulaire de Salmonella dans les macrophages pour les deux sérovars. Finalement, la protéine Fur et les petits ARN RfrA et RfrB régulent l’expression de l’opéron fimbriaire tcf, absent du génome de S. Typhimurium. Un site de liaison putatif de la protéine Fur a été identifié dans la région promotrice de tcfA chez S. Typhi, mais une régulation directe n’a pas été confirmée. L’expression de tcf est induite par le fer et par Fur, et est inhibée par les petits ARN RfrA et RfrB. Ainsi, ces régulateurs affectent des gènes de virulence qui sont retrouvés spécifiquement chez S. Typhi. En somme, ce projet a permis de démontrer que les régulateurs de l’homéostasie du fer de Salmonella peuvent affecter la résistance de cette bactérie pathogène à différents stress, notamment le stress oxydatif, la croissance en conditions de carence en fer ainsi que la virulence. Ces régulateurs jouent un rôle distinct chez les sérovars Typhi et Typhimurium. / Regulation of iron homeostasis is crucial for bacteria. For Salmonella, proper timing of the expression of iron acquisition and metabolism genes is important for survival and virulence. This regulation is mediated by the protein Fur and the small non-coding RNAs (sRNAs) RfrA and RfrB. The role of these regulators is to assure that the iron level is high enough for survival and metabolism of Salmonella, and low enough to avoid the toxic effect of iron in the presence of oxygen. Thus far, information on the role of these regulators was principally obtained by studying S. Typhimurium, a generalist serovar causing gastro-enteritis in humans. Very little is known about the role of these regulators in S. Typhi, a human-specific serovar which causes typhoid fever. The goal of this study was to determine the roles of Fur, RfrA and RfrB in iron homeostasis and virulence of Salmonella, and to determine if they have a distinct implication in the serovars Typhimurium and Typhi. First, Fur, RfrA and RfrB regulate iron homeostasis in Salmonella. The results of this study have shown that Fur is required for resistance to oxidative stress and for optimal growth in different in vitro conditions. The sensitivity of the fur mutant is due to the expression of the sRNAs RfrA and RfrB, and this sensitivity is worse in S. Typhi than in S. Typhimurium. Also, Fur represses the transcription of the genes encoding siderophores in high-iron conditions, and the sRNAs RfrA and RfrB are required for enterobactin and salmochelins production in S. Typhi in low-iron conditions. Secondly, these regulators affect the virulence of Salmonella. Fur is important for the motility of Salmonella, especially in S. Typhi. Fur is required for the invasion of both serovars in epithelial cells, and for the uptake and survival of S. Typhi in macrophages. In S. Typhimurium, Fur is not required for the interaction with macrophages. Moreover, the sRNAs RfrA and RfrB are important for the intracellular multiplication of Salmonella within macrophages for both serovars. Finally, the Fur protein and the sRNAs RfrA and RfrB regulate the expression of the tcf fimbrial operon, absent from the genome of S. Typhimurium. A putative Fur binding site was identified in the tcfA promoter region of S. Typhi, but direct regulation has not been confirmed. tcf expression is activated by iron and Fur, and is inhibited by the sRNAs RfrA and RfrB. Therefore, these regulators affect virulence genes that are found specifically in S. Typhi. To conclude, this project demonstrates that the iron homeostasis regulators of Salmonella can affect the bacterial resistance to different stresses, espacially oxidative stress, the growth in iron-limiting conditions and virulence. These regulators have a distinct role in the serovars Typhi and Typhimurium.

OCL1 (Outer Cell Layer 1) est le membre fondateur, chez le maïs, de la famille multigénique regroupant les facteurs de transcription HD-ZIP IV. La plupart de ces gènes s’exprime préférentiellement dans l’épiderme, et chez Arabidopsis l’étude de mutants a montré que certains HD-ZIP IV étaient essentiels pour la différenciation de cette couche cellulaire. Lors de ma thèse je me suis intéressée à la régulation du gène OCL1 par un petit ARN non codant. En effet, la conservation au sein des 3’UTR de plusieurs gènes HD-ZIP IV d’un motif de 21 nucléotides (nt) suggérait l’existence d’un tel mécanisme. J’ai mis en évidence que ce motif de 21 nt était conservé des Bryophytes aux Angiospermes et qu’il était toujours couplé à un second motif conservé d’une taille de 19 nt avec lequel il peut s’apparier pour former une structure secondaire de type tige-boucle. J’ai démontré l’existence d’un petit ARN ayant une séquence (quasi) complémentaire au site de 21 nt. La biogenèse de ce petit ARN de 24 nt que nous avons nommé small1, dépend de RDR2/ MOP1, DCL3 et Pol IV/ RMR6, composants normalement requis pour le mécanisme de RdDM. A l’aide d’un système GFP sensor, j’ai cependant mis en évidence que small1 régulait l’expression de son gène cible par inhibition de la traduction et non par RdDM. Ces expériences ont par ailleurs démontré qu’OCL1 n’est pas régulé uniquement par small1, mais également via un second mécanisme dans lequel pourrait intervenir la structure secondaire de type tige-boucle. Enfin, j’ai montré que small1 possède une extrémité 5’modifiée, expliquant ainsi son absence des banques de données et définissant aussi une nouvelle classe de petits ARN chez les plantes. / Small non-coding RNAs are versatile riboregulators that control gene expression at the transcriptional or post-transcriptional level, governing many facets of plant development and stress responses. We previously suggested the possible regulation of OCL1 (Outer Cell Layer1) by a small RNA based on the intriguing presence of two conserved motives of 19 and 21nt in its 3’UTR. ZmOCL1 is a founding member of the HD-ZIP IV gene family encoding plant specific transcription factors mainly involved in epidermis differentiation and specialization. Here we present evidence for the existence of a 24 nt small RNA complementary to ZmOCL1 3’UTR which accumulates preferentially in maize reproductive organs but also in Arabidopsis flowers and inflorescences. The biogenesis of this 24 nt small RNA (that we named small1) depends on MOP1/RDR2 and RMR6/POLIV and DCL3, components normally required for RNA-dependent DNA-methylation. Unexpectedly GFP-sensor experiments showed that small1 may regulate its target at the post-transcriptional level, mainly through translational inhibition. These experiments further highlighted the importance of additional 3’UTR sequences required for efficient target repression, possibly implicating a secondary stem-loop structure. Finally, we showed that small1 is modified at its 5’ end, which not only explains its absence from the current databases but also defines a novel class of plant small RNAs.

L'étude qu'on a entreprise a pour but d'analyser les facteurs de virulence des espèces "Classiques" et "nouvelles" de Brucella. Dans cette perspective, on a analysé les génomes des espèces récemment découvertes : Brucella inopinata BO1 et Brucella inopinata-like BO2, isolés pour la première fois de patients humains sans réservoir animal connu. On a découvert que ces deux espèces possèdent des profils de restriction uniques. De plus, BO2 possède deux chromosomes de taille identique, un profil jamais décrit pour une autre espèce de Brucella. L'analyse de la réplication intracellulaire de ces deux espèces révèle que BO2 ne se réplique pas dans les macrophages humains et murins alors que BO1 se réplique d'une façon similaire à Brucella suis 1330, ce qui confirme la potentielle implication de BO1 dans la pathogenèse chez l'homme. Sur un autre niveau d'analyse, on a été à la recherche de facteurs de virulence potentiels dans d'autres espèces de Brucella notamment Brucella microti et Brucella suis sur les niveaux génomique et post-transcriptionnel. Sur le niveau génomique, on a découvert que le système GAD (glutamate decarboxylase) confère une résistance à l'acidité à Brucella microti lors de son passage dans l'estomac. Sur le niveau post-transcriptionnel, on a isolé, séquencé et identifié les petits ARNs noncodant associés à la protéine chaperone Hfq, qui joue un rôle important dans la virulence de Brucella. / We have undertaken in this study a multidimensional analysis of the virulence factors of "Classical" and new "Brucella species". In this objective, we have analysed the genomes of newly described species Brucella inopinata BO1 and Brucella inopinata-like BO2 isolated for the first time from human patients with no known animal reservoir. We found that these two species have unique restriction profiles. In addition, BO2 has a unique chromosomal distribution with two chromosomes of the same size, never seen before in Brucella. Analysis of the intracellular replication of these strains reveals that BO2 is unable to replicate in neither human nor mouse macrophages while BO1 successfully entered and replicated as efficiently as Brucella suis 1330 confirming the potential virulence of this species for humans. On an other level of analysis, we looked for potential virulence factors in other Brucella species including Brucella microti and Brucella suis at the genomic and post-transcriptional level. At the genomic level we discovered that the glutamate decarboxylase system confers resistance to acidity to Brucella miroti during its transit in the stomach. On the post-transcriptional level, we isolated, sequenced and identified small noncoding RNAs associated to the chaperone protein Hfq, known to play a role in the virulence of Brucella.