La régulation de l’expression génétique est essentielle afin qu’un organisme puisse s’adapter aux changements environnementaux. Chez les bactéries, la régulation peut s’effectuer à plusieurs étapes de l’expression des gènes (transcription, stabilité de l’ARN, traduction, maturation et dégradation des protéines) et par des mécanismes impliquant différents types de molécules (ADN, ARN, protéines, métabolites ou ions inorganiques). Traditionnellement, les protéines se situaient au centre de ces mécanismes de régulation. On sait maintenant que certains ARN, dont les riborégulateurs, ont également un grand rôle à jouer dans ce processus. Un riborégulateur est un élément génétique retrouvé dans une région non-codante de certains ARN messagers (ARNm), qui peut lier directement un ligand spécifique afin de réguler l’expression de son transcrit. Chez Escherichia coli (E. coli), trois riborégulateurs lient la thiamine pyrophosphate (TPP). Un d’entre eux, le riborégulateur thiB, n’a toujours pas été étudié. On croit qu’il contrôlerait, au niveau de l’initiation de la traduction, l’expression de l’opéron thiBPQ encodant un transporteur ABC de la thiamine. De plus, un petit ARN nommé SroA a précédemment été identifié grâce à des techniques de séquençage d’ARN. SroA correspond à l’aptamère du riborégulateur thiB, mais aucun rôle ne lui a été attribué à ce jour. Le présent mémoire porte sur la caractérisation du riborégulateur thiB d’E. coli. Dans un premier temps, nous avons démontré que le riborégulateur est fonctionnel. Le mécanisme permettant la régulation génétique en cis est cependant plus complexe que seulement la régulation prédite au niveau traductionnel. Dans un second temps, nous avons utilisé deux approches différentes à l’échelle transcriptomique afin de vérifier si SroA régule l’expression de certains ARNm en trans. Plusieurs cibles potentielles découlent de cette étude. Une caractérisation préliminaire de certaines d’entre elles est présentée ici et devra être poursuivie par des travaux subséquents. Les résultats présentés ici suggèrent que le riborégulateur thiB régulerait l’expression de l’opéron thiBPQ (en cis) et d’autres gènes en trans.

DsrA est un petit ARN régulateur que l'on retrouve chez plusieurs espèces bactériennes, notamment Escherichia coli non-pathogène et pathogène. DsrA est exprimé principalement lorsque la bactérie est dans un environnement température suboptimale (<37 [degrés Celsius]). En conditions d'expression de DsrA, on retrouve une forme pleine longueur de 85 nucléotides et une forme tronquée de 60 nucléotides. Il a été montré que DsrA, dans sa forme pleine longueur ou tronquée, peut diminuer l'initiation de la traduction de l'ARNm hns , codant pour la protéine H-NS, un régulateur majeur de la transcription qui module près de 5% des gènes chez E. coli . Toutefois, les mécanismes impliqués dans la répression traductionnelle d'hns par DsrA n'ont pas été caractérisés. Les travaux présentés dans ce mémoire démontrent que DsrA bloque l'initiation de la traduction d'hns en s'appariant immédiatement en aval du codon d'initiation de la traduction. De plus, DsrA provoque la dégradation de l'ARNm hns en recrutant le complexe dégradosome ARN. La RNase E, qui fait partie de ce complexe, va cliver l'ARNm au nucléotide 131 dans la région codante du gène, soit 80 nucléotides en aval de l'appariement entre hns et DsrA. Ce clivage va provoquer la dégradation rapide de l'ARNm hns par les exoribonucléases de E. coli . Mes travaux de maîtrise ont abouti à un modèle d'action de DsrA sur hns qui pourrait inclure les autres cibles négatives de DsrA. De plus, ils suggèrent que les sRNA semblent partager le même mécanisme général de dégradation des ARNm. Ces travaux démontrent également que l'extrémité 5' de DsrA tronqué est monophosphate ce qui suggère un clivage par une ribonucléase. Toutefois aucune ribonucléase connue d' E. coli ne semble produire la forme tronquée de DsrA, bien que l'exoribonucléase PNPase semble influencer sa dégradation. Ces travaux démontrent également l'impact des protéines RppH et CsdA dans la dégradation de l'ARNm hns à 25 [degrés Celsius], c'est-à-dire lorsque DsrA est naturellement exprimé. Ces protéines sont importantes pour la stabilité de hns et pour sa dégradation en présence de DsrA. Toutefois, le mécanisme d'action de ces protéines n'a pas été déterminé.

L’avancement des connaissances sur la biologie de l’ARN progresse à un rythme effréné. En effet, les découvertes des dernières années ont confirmé l’importance de l’ARN comme régulateur. Par exemple, de courtes molécules d’ARN, appelées sRNA (small RNA), ont été identifiées comme régulateurs post-transcriptionnels majeurs, capables de moduler l’expression des ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Généralement, le mode d’action de ces sRNA consiste à s’attacher de manière anti-sens à leurs ARNm cibles, au site de la liaison du ribosome située dans la région 5′ non traduite de l’ARNm. L’inhibition de la traduction par le sRNA conduit, dans la majorité des cas, à la dégradation rapide de l’ARNm. Dans le cadre de mes travaux de recherche, j’ai participé à modéliser, à partir de données biologiques, certains mécanismes de régulation de cibles ARNm. Plus précisément, deux des sRNA, parmi les mieux caractérisés chez E. coli, soient RyhB et Spot42, ont été analysés. Cette étude a montré qu’un sRNA peut réguler ses cibles selon différents régimes (efficace ou modéré) en fonction du mode de régulation priorisé par le sRNA, et ce, indépendamment de son abondance relative. Ces résultats permettront d’améliorer notre compréhension et notre capacité à prédire l’efficacité d’un sRNA à réguler ses cibles ARNm. Par des recherches subséquentes, il m’a été possible de démontrer que l'expression de l’ARNm encodant pour la protéine aconitase B était régulée de manière antagoniste à la fois par le sRNA RyhB et par la protéine aconitase B et ce, dans une condition de carence en fer. Par la suite, j’ai pu mettre en évidence un deuxième mécanisme de régulation similaire pour l’ARNm grxD, encodant pour la glutharédoxine D. Jusqu'à ce jour, le sRNA RyhB démontrait une efficacité infaillible pour dégrader ses ARNm cibles. Les résultats obtenus durant ce projet démontrent sans équivoque une nouvelle voie de protection permettant à l’ARNm d'éviter la dégradation par un petit ARN régulateur. Ce mécanisme de protection de l'ARNm ouvre la porte à un tout nouveau processus cellulaire de régulation post-transcriptionnelle qui s'étend sûrement à un groupe plus important d’ARN.

Le concept d’opéron, défini en 1960 par Jacob et Monod comme étant un groupe de gènes transcrits ensemble et dont les produits concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique, est resté jusqu’à tout récemment pratiquement inchangé. Selon ce modèle, toute régulation génétique a lieu au niveau transcriptionnel et est médiée par des facteurs protéiques. Cependant, au cours de la dernière décennie, une révolution a eu lieu alors qu’il fut démontré que des petites molécules d'ARN, appelés sRNAs (small RNAs), sont capables de réprimer de manière post-transcriptionnelle l’expression d’ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Leur mécanisme d'action consiste généralement à inhiber la traduction d'un ARNm en compétitionnant avec la liaison des ribosomes sur le site de liaison des ribosomes (SLR) situé dans la région 5' non traduite d’un ARNm. Cette inhibition de la traduction s’accompagne généralement d'une dégradation rapide de l’ARNm cible. Les recherches que j'ai effectuées au cours de mes études de 2e et 3e cycle ont permis de découvrir des mécanismes alternatifs par lesquels les sRNAs peuvent réprimer l’expression d’ARNm cibles. J'ai tout d’abord démontré que l’expression du petit ARN RyhB lors d'une carence en fer entraîne la dégradation seulement partielle de l’ARNm polycistronique iscRSUA. De plus, j'ai participé à l’élucidation du mécanisme de dégradation d'un ARNm par l’action d'un sRNA. En effet, nous démontrons que le site de clivage de la RNase E se situe plusieurs centaines de nucléotides en aval dans le cadre de lecture de la cible et que l'arrêt de la traduction n'est pas suffisant à l’obtention d'une dégradation rapide d'un ARNm cible. Finalement, j'ai caractérisé un nouveau mécanisme par lequel un sRNA peut réprimer la traduction d’un ARNm en s’appariant loin en amont du SLR par le recrutement de la protéine chaperon Hfq. Nous démontrons que c'est la protéine qui joue le rôle principal dans la compétition avec les ribosomes.

Les petits ARN (ARNS) sont impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle des voies métaboliques et dans les réponses aux stress et la virulence. Chez Staphyloccus Aureus, RNAIII, l’effecteur principal du système AGR, agit comme un ARN antisens pour réguler l’expression de protéines de parois cellulaires et de nombreux cytotoxines en fin de phase de croissance exponentielle. Une série de petits ARN-RSA, ont été découverts par notre équipe en 2009. Les objectifs de cette étude sont : 1) Construire des outils génétiques pour étudier leurs fonctions, II) Analyser leur expression dans diverses conditions in Vitro et in Vivo. Ainsi, nous avons déterminé le niveau d’expression de 4 ARNS (RSAA, RSAE, RASG et RSAH) et ARNIII, lorsque la bactérie a été exposée à divers antibiotiques ou en contact avec d’autres bactéries comme Pseudomonas. Des concentrations sub-inhibitrices (1/16 et 1/8 MIC) de la lévofloxacine augmentent l’expression de RSAH dans RN6390, mas pas dans HG001. Le niveau d’expression de RSAG et RSAH ont été augmentés en présence de P. Aeruginosa, mais le mécanisme de cet effet n’a pas été élucidé. Les données obtenues à partir d’échantillons humains ont montré que l’expression globale des cinq petits ARN a été extrêmement variable dans les abcès, plus homogène dans les crachats des patients atteints de mucoviscidose, et très homogène dans les échantillons de colonisation nasale. Le modèle d’expression particulier des ARNS associé à la colonisation nasale pourrait refléter le commensalisme de S. Aureus dans cette niche. / Small RNAs (sRNAs) are involved in the post-transcriptional regulation of metabolic pathways and in responses to stress and virulence. In Staphylococcus aureus, RNAIII, the main effector of the Agr system, acts as an antisense RNA to regulate the expression of many cell wall proteins and cytotoxins in late-exponential growth phase. A series of novel sRNAs – Rsa were discovered by our team in 2009. The objective of this study is i) to construct genetic tools to study their functions and ii) to analyze their expression in various conditions in vitro and in vivo. Thus, we determined the expression level of 4 sRNAs (RsaA, RsaE, RsaG and RsaH) and RNAIII, when the bacterium was exposed to various antibiotics or in contact with other bacteria such as Pseudomonas. Subinhibitory concentrations (1/16 and 1/8 MIC) of levofloxacin could enhance the RsaH expression in RN6390, not in HG001. RsaG and RsaH level were increased in the presence of P. aeruginosa, however the mechanism of this effect has not been elucidated. Data obtained from human samples showed that the global expression of the five sRNAs was extremely variable in the abscesses, more homogeneous in the sputa of cystic fibrosis patients, and highly uniform in the nasal carrier samples. The unique expression pattern of sRNA associated with nasal colonization might reflect the commensalism of S. aureus in this niche.

GcvB est un ARN bactérien conservé de 200 nucléotides, qui régule négativement l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l’import et la biosynthèse des acides aminés. Bien que le rôle physiologique de GcvB ne soit pas complètement élucidé, il contribuerait vraisemblablement à équilibrer les ressources nutritionnelles en conditions de croissance rapide. GcvB inhibe la traduction des ARNm cibles en s’appariant avec des séquences à l’intérieur ou en amont du site de liaison du ribosome. Dans cette étude, la caractérisation d’un nouveau locus régulé par GcvB a permis de dévoiler des aspects singuliers du mode de fonctionnement de cet ARN régulateur. Nous avons découvert que GcvB réprime yifK - un gène très conservé, codant pour un transporteur d’acides aminés putatif - en ciblant un élément activateur de la traduction sur l’ARNm. Deux motifs ACA dans la séquence cible sont les déterminants principaux de la fonction activatrice. Le remplacement de l’un ou l’autre avec des triplets aléatoires, provoque une diminution de 10 fois du niveau d’expression de yifK, quelque soit l’allèle de GcvB (délétion ou changement de séquence permettant la reconnaissance de la cible mutante). Il apparait ainsi que l’efficacité de GcvB à réguler négativement sa cible serait liée a sa capacité d’antagoniser l’élément activateur. Lorsque l’activateur est éliminé, l’action de GcvB n’est plus un facteur limitant pour l’expression de yifK. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension de la fonction de GcvB et révèle un nouvel aspect du processus d’initiation de la traduction. En plus du contrôle par GcvB, le locus yifK est régulé au niveau transcriptionnel par Lrp (leucine-responsive regulatory protein) et par HdfR (YifA) un régulateur transcriptionnel peu connu qui requerrait le produit du gène adjacent orienté de façon divergente, yifE, pour son expression ou activité. Enfin, la transcription initiée au niveau du promoteur yifK s’étend dans l’opéron d’ARNt argX-hisR-leuT-proM adjacent, donnant lieu à un transcrit primaire qui est à la fois un lARNm et un précurseur des ARNt. Cet ARN chimère est rapidement maturé par l’ARNase E. / GcvB is a conserved 200 nucleotide RNA that downregulates several genes involved in amino acid uptake or biosynthesis in bacteria. The physiological role of GcvB action is not entirely clear, but it is likely aimed at balancing of nutritional resources under fast growth conditions. GcvB inhibits translation of target messenger RNAs by pairing with sequences inside or upstream of ribosome binding sites. In the present study, characterization of a novel GcvB-regulated locus revealed some unique features in the mode of functioning of this regulatory RNA. We found that GcvB represses yifK - a highly conserved locus encoding a putative amino acid transporter - by targeting a translational enhancer element. Two ACA motifs within the target sequence are the main determinants of the enhancer activity. Replacing either of these motifs with random triplets caused up to a 10-fold decrease in yifK expression regardless of the GcvB allele (deleted or suitably modified to recognize the mutated target). It thus appears that GcvB effectiveness as a regulator results from countering the enhancer activity. When the enhancer is removed, GcvB action no longer constitutes a rate-limiting factor for yifK expression. Overall, this study is relevant not only to a better understanding of GcvB function but it also provides insight into an elusive aspect of the translation initiation process. Besides the GcvB control, the yifK locus is regulated at the transcriptional level by the leucine responsive regulator Lrp, and by HdfR (YifA) a poorly known transcriptional regulator, that appears to require the product of the adjacent, divergently oriented gene, yifE, for expression or activity. Transcription initiating at the yifK promoter extends into the adjacent argX-hisR-leuT-proM tRNA operon yielding an unusual primary transcript which both a messenger RNA and a tRNA precursor. This chimeric RNA si rapidly processed by RNAse E.

Parmi les régulateurs nucléiques, les petits ARN régulateurs sont un moyen rapide d’adaptation. On les retrouve dans tous les domaines du vivant. Chez les bactéries, l’action d’un grand nombre d’entre eux dépend de la protéine chaperonne d’ARN Hfq. Leur mode d’action consiste à d’apparier directement à l’ARNm cible par complémentarité imparfaite de séquence. Il en résulte une régulation positive ou négative, de la traduction et/ou de la stabilité de l’ARNm cible.Au cours de la première partie cette thèse, nous avons essayé de caractériser la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs. Pour ce faire, nous avons étudiés les différents composants de cette régulation et nous avons pu montrer que les sites de fixation à la protéine Hfq sur les ARN devaient être compatibles pour obtenir une régulation optimale des ARNm par les petits ARN régulateurs.Lors de la seconde partie de la thèse, nous avons pu identifier un nouveau type de régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs : la polarité transcriptionnelle. Nous avons pu montrer que la fixation du petit ARN ChiX sur la région 5’UTR de l’ARNm chiPQ entrainer l’inhibition de la traduction de chiP mais également une terminaison prématurée rho-dépendante de la transcription de l’ARNm.Nous avons par la suite cherché à savoir si ce type de régulation pouvait se retrouver dans la régulation d’autre ARNm comme l’opéron dppABCDF et l’opéron pgaABCD. En parallèle de ces études, nous avons également essayé de caractérisé la terminaison Rho-dépendante entre S. Typhimurium et E.coli au sein de l’ARNm chiPQ. / Among the nucleic regulators, small regulatory RNAs are a quick way to adapt. They are found in all areas of life. In bacteria, the action of a large number of them depends on the chaperone protein of Hfq RNA. Their mode of action consists of matching directly to the target mRNA by imperfect complementary sequence. This results in a positive or negative control, translation and/or stability of the target mRNA.During the first part of this thesis, we have tried to characterize the regulation of mRNA by small regulatory RNAs. To do this, we studied the different components of this regulation and we have shown that the binding sites on protein Hfq on RNA should be consistent for optimal regulation of mRNA by small regulatory RNAs.In the second part of the thesis, we identified a new type of mRNA regulation by small RNA regulators: transcriptional polarity. We could show that the fixing of small RNA ChiX on the 5 'UTR region of the mRNA chiPQ cause inhibition of translation of chiP but also a Rho-dependent premature termination of mRNA transcription.We subsequently investigated whether this type of regulation could be in the control of other mRNAs as dppABCDF’s operon and pgaABCD’s operon. In parallel with these studies, we have also tried characterized Rho-dependent termination between S. Typhimurium and E. coli in mRNA chiPQ.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La régulation de l’homéostasie du fer est cruciale chez les bactéries. Chez Salmonella, l’expression des gènes d’acquisition et du métabolisme du fer au moment approprié est importante pour sa survie et sa virulence. Cette régulation est effectuée par la protéine Fur et les petits ARN non codants RfrA et RfrB. Le rôle de ces régulateurs est d’assurer que le niveau de fer soit assez élevé pour la survie et le métabolisme de Salmonella, et assez faible pour éviter l’effet toxique du fer en présence d’oxygène. Les connaissances concernant le rôle de ces régulateurs ont été principalement obtenues par des études chez S. Typhimurium, un sérovar généraliste causant une gastro-entérite chez les humains. Très peu d’informations sont connues sur le rôle de ces régulateurs chez S. Typhi, un sérovar humain-spécifique responsable de la fièvre typhoïde. Le but de cette étude était de déterminer les rôles de Fur, RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella, et de démontrer qu’ils ont une implication distincte chez les sérovars Typhi et Typhimurium. Premièrement, Fur, RfrA et RfrB régulent l’homéostasie du fer de Salmonella. Les résultats de cette étude ont démontré que Fur est requis pour la résistance au stress oxydatif et pour une croissance optimale dans différentes conditions in vitro. La sensibilité du mutant fur est due à l’expression des petits ARN RfrA et RfrB, et cette sensibilité est beaucoup plus importante chez S. Typhi que chez S. Typhimurium. Également, Fur inhibe la transcription des gènes codant pour les sidérophores en conditions riches en fer, tandis que les petits ARN RfrA et RfrB semblent être importants pour la production d’entérobactine et de salmochélines chez S. Typhi lors de conditions pauvres en fer. Ensuite, ces régulateurs affectent la virulence de Salmonella. Fur est important pour la motilité de Salmonella, particulièrement chez S. Typhi. Fur est nécessaire pour l’invasion des deux sérovars dans les cellules épithéliales, et pour l’entrée et la survie de S. Typhi dans les macrophages. Chez S. Typhimurium, Fur ne semble pas impliqué dans l’interaction avec les macrophages. De plus, les petits ARN RfrA et RfrB sont importants pour la multiplication intracellulaire de Salmonella dans les macrophages pour les deux sérovars. Finalement, la protéine Fur et les petits ARN RfrA et RfrB régulent l’expression de l’opéron fimbriaire tcf, absent du génome de S. Typhimurium. Un site de liaison putatif de la protéine Fur a été identifié dans la région promotrice de tcfA chez S. Typhi, mais une régulation directe n’a pas été confirmée. L’expression de tcf est induite par le fer et par Fur, et est inhibée par les petits ARN RfrA et RfrB. Ainsi, ces régulateurs affectent des gènes de virulence qui sont retrouvés spécifiquement chez S. Typhi. En somme, ce projet a permis de démontrer que les régulateurs de l’homéostasie du fer de Salmonella peuvent affecter la résistance de cette bactérie pathogène à différents stress, notamment le stress oxydatif, la croissance en conditions de carence en fer ainsi que la virulence. Ces régulateurs jouent un rôle distinct chez les sérovars Typhi et Typhimurium. / Regulation of iron homeostasis is crucial for bacteria. For Salmonella, proper timing of the expression of iron acquisition and metabolism genes is important for survival and virulence. This regulation is mediated by the protein Fur and the small non-coding RNAs (sRNAs) RfrA and RfrB. The role of these regulators is to assure that the iron level is high enough for survival and metabolism of Salmonella, and low enough to avoid the toxic effect of iron in the presence of oxygen. Thus far, information on the role of these regulators was principally obtained by studying S. Typhimurium, a generalist serovar causing gastro-enteritis in humans. Very little is known about the role of these regulators in S. Typhi, a human-specific serovar which causes typhoid fever. The goal of this study was to determine the roles of Fur, RfrA and RfrB in iron homeostasis and virulence of Salmonella, and to determine if they have a distinct implication in the serovars Typhimurium and Typhi. First, Fur, RfrA and RfrB regulate iron homeostasis in Salmonella. The results of this study have shown that Fur is required for resistance to oxidative stress and for optimal growth in different in vitro conditions. The sensitivity of the fur mutant is due to the expression of the sRNAs RfrA and RfrB, and this sensitivity is worse in S. Typhi than in S. Typhimurium. Also, Fur represses the transcription of the genes encoding siderophores in high-iron conditions, and the sRNAs RfrA and RfrB are required for enterobactin and salmochelins production in S. Typhi in low-iron conditions. Secondly, these regulators affect the virulence of Salmonella. Fur is important for the motility of Salmonella, especially in S. Typhi. Fur is required for the invasion of both serovars in epithelial cells, and for the uptake and survival of S. Typhi in macrophages. In S. Typhimurium, Fur is not required for the interaction with macrophages. Moreover, the sRNAs RfrA and RfrB are important for the intracellular multiplication of Salmonella within macrophages for both serovars. Finally, the Fur protein and the sRNAs RfrA and RfrB regulate the expression of the tcf fimbrial operon, absent from the genome of S. Typhimurium. A putative Fur binding site was identified in the tcfA promoter region of S. Typhi, but direct regulation has not been confirmed. tcf expression is activated by iron and Fur, and is inhibited by the sRNAs RfrA and RfrB. Therefore, these regulators affect virulence genes that are found specifically in S. Typhi. To conclude, this project demonstrates that the iron homeostasis regulators of Salmonella can affect the bacterial resistance to different stresses, espacially oxidative stress, the growth in iron-limiting conditions and virulence. These regulators have a distinct role in the serovars Typhi and Typhimurium.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal