Hypertensive Entgleisungen werden bei Phäochromozytompatienten sowohl intra-/als auch präoperativ beobachtet. Die Wahl der antihypertensiven Therapie ist jedoch Gegenstand einer wissenschaftlichen Kontroverse. Der Stellenwert einzelner Behandlungsregime ist in Abwesenheit randomisierter kontrollierter Studien unklar. Seit den 50er Jahren ist Phenoxybenzamin (POB) das am häufigsten eingesetzte Medikament in der Vorbehandlung. Als Alternativen mit einem geringeren Nebenwirkungsprofil, werden selektive α1-Blocker und Calciumkanalantagonisten diskutiert. In dieser Arbeit wurde in einem Tiermodell geprüft, ob α1-Blocker (Urapidil), Calciumkanalantagonisten (Nitrendipin und Nifedipin) und irreversible α1/α2-Blocker (Phenoxybenzamin) vergleichbar wirkungsvoll in der Prävention hypertensiver Krisen sind. Zur Simulation eines chronischen Katecholaminexzesses wurden die Tiere drei Wochen mit Noradrenalin (NA) via osmotischer Pumpe (50 μg/h) behandelt. Anschließend wurden die Tiere narkotisiert und akute Katecholaminkrisen durch NA-Boli in aufsteigender Dosis simuliert (0,1-1000 µg/kg KG). POB (10 mg/kg KG, n=4), Urapidil (10 mg/kg KG, n=3) und Nitrendipin (600 µg/kg KG, n=6) senkten den systolischen Ausgangsblutdruck von 212 ± 12 mmHg um 52 ± 7%, 31 ± 9% und 50 ± 6%. Die anschließenden Katecholaminkrisen führten zu Druckanstiegen von 138 ± 3 mmHg, 235 ± 29 mmHg, 240 ± 30 mmHg in POB, Urapidil und Nitrendipin-behandelten Tieren (p<0,01). In einer zweiten Studie wurden die Tiere für sieben Tage zusätzlich zu der Noradrenalingabe mit POB (10 mg/kg KG/Tag, n=9), Nifedipin (10 mg/kg KG/Tag, n=10), oder dem Lösungsmittel 10% DMSO/Wasser (n=7) behandelt. Der systolische Ausgangsblutdruck lag bei 167 ± 7 mmHg (POB), 210 ± 7 mmHg (Nifedipin) und 217 ± 7 mmHg (Kontrolle) (p<0,01). Während der folgenden NA-Krisen lag der maximale systolische Blutdruck bei 220 ± 11 mmHg (POB), 282 ± 8 mmHg (Nifedipin) und 268 ± 16 mmHg (Kontrolle) (p<0,001). Anschließend erhielten die Tiere während der Katecholaminstimulation eine zusätzliche kontinuierliche Infusion mit Urapidil (Ebrantil®) oder Nifedipin (Adalat pro infusione®). Durch eine kontinuierliche Infusion mit Nifedipin - zusätzlich zur POB-Vorbehandlung - konnte der Blutdruck am effektivsten stabilisiert werden (137 ± 5 mmHg (POB), 272 ± 5 mmHg (Nifedipin) 225 ± 11mmHg (Kontrolle) (p<0,001). Es konnte gezeigt werden, dass POB verglichen mit Urapidil, Nitrendipin und Nifedipin hypertensive Krisensituationen am effektivsten vorbeugt. / Calcium channel blockers and reversible α1-adrenoceptor blockers have been proposed as alternatives to POB in preoperative antihypertensive treatment of patient with pheochromocytoma. However these drugs were never sufficiently tested for this purpose and there are no consistent recommendations for antihypertensive pretreatment. POB, urapidil, nitrendipine and nifedipine were systemically tested in rats in order to prove effectiveness in controlling blood pressure during acute and chronic catecholamine excess as observed in patients with pheochromocytoma. Rats were treated with norepinephrine (NE) for three weeks via osmotic mini pumps (50 μg/h). Afterwards rats were anaesthetized, catheterized for hemodynamic measurements and acute catecholamine excess was stimulated by increasing doses of NE (0.1-1000 µg/kg BW IV). A single dose of POB (10 mg/kg BW, n=4), urapidil (10 mg/kg BW, n=3) and nitrendipine (600 µg/kg BW, n=6) lowered blood pressure from 212 ± 12 mmHg at baseline by 52 ± 7%, 31 ± 9% and 50 ± 6% resp. Subsequently stimulation of acute catecholamine excess lead to a maximum blood pressure of 138 ± 3 mmHg, 235 ± 29mmHg, 240 ± 30 mmHg in POB, urapidil and nitrendipine treated animals (p<0.01). In a second study animals were additionally treated with POB (10 mg/kg BW/d, n=9), nifedipine (10 mg/kg BW/d, n=10) or vehicle (n=7) for seven days prior to hemodynamic assessment. Baseline blood pressure was 167 ± 7 mmHg (POB), 210 ± 7 mmHg (nifedipine) and 217 ± 7 mmHg (controls) (p<0.01). During the following NE challenge maximum blood pressure was 220 ± 11 mmHg (POB), 282 ± 8 (nifedipine) and 268 ± 16 mmHg (controls) (p<0.001). Subsequently rats received an additional continous infusion with either urapidil (Ebrantil®) or nifedipine (Adalat pro infusione®) during acute NE bolus stimulation. A contious infusion with nifedipine in addition to POB pretreatment showed a significantly better hemodynamic stability 137 ± 5mmHg (POB), 272 ± 5mmHg (nifedipine) 225 ± 11mmHg (controls) (p<0.001). In summary all drugs which were tested in our studies lowered the blood pressure significantly. However only POB prevented recurring severe hypertensive episodes within NE excess. A pretreatment with POB and additional continous infusion with nifedipine provides superior hemodynamic stability.

Die biochemische Diagnostik von Phäochromozytomen und Paragangliomen (PPGL) basiert auf einem gesteigerten Katecholaminmetabolismus in dessen Folge es zu erhöhten Plasmametanephrinkonzentrationen (Normetanephrin NMN und/oder Metanephrin MN) kommt. Die variable endokrine Aktivität der Tumoren sowie Hormonzentrationen im Nanomol-pro-Liter-Bereich stellen hohe Anforderungen an analytische Messmethoden. Nicht oder spät diagnostizierte PPGL können lebensbedrohliche katecholaminerge Krisen verursachen. Demzufolge sind präzise Nachweisverfahren und validierte Messmethoden für die biochemische Diagnostik unerlässlich. Inwiefern die Messverfahren enzymgekoppelter Immunoassay (EIA) und Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Analyse von Plasmametanephrinen in gleichem Maße geeignet sind, ist aufgrund der kontroversen Studienlage unklar. Hierfür wurde eine Substudie im Rahmen der prospektiven monoaminproduzierenden Tumor (PMT)-Studie an fünf europäischen Zentren durchgeführt. Es wurden 341 Patienten (174 Männer, 167 Frauen), darunter 54 Patienten mit PPGL eingeschlossen. Die Blutproben wurden unter Standardbedingungen entnommen und mit beiden Messmethoden in spezialisierten Zentren analysiert. Für den EIA zeigte sich ein negativer Bias von 60% für NMN und 39% für MN. Dieser führte unter Verwendung oberer Grenzwerte nach Herstellerangaben zu einer Sensitivität von 74,1% und einer Spezifität von 98,9%. Für LC-MS/MS wurde eine signifikant höhere Sensitivität von 98,1% und eine Spezifität von 99,7% gezeigt. Die Berechnung der area under the curve (AUC) im Zuge der receiver-operating-characteristic (ROC)-Kurven-Analyse indizierte jedoch eine vergleichbar hohe diagnostische Testleistung für EIA (0,993) und LC-MS/MS (0,985). Durch eine Bias-korrigierte Grenzwertoptimierung stieg die Sensitivität des EIAs auf 96,2% bei einer Spezifität von 95,1% und führte dadurch zu einer vergleichbaren diagnostischen Testqualität wie LC-MS/MS. Fazit: Bei diesem kommerziell erhältlichen EIA resultiert die Verwendung oberer Grenzwerte nach Herstellerangaben in einer insuffizienten Sensitivität. Dies birgt das Risiko, Patienten mit PPGL nicht zu diagnostizieren. Eine Rekalibrierung des EIAs sowie eine Validierung der Referenzintervalle sind erforderlich. / Context: Reports conflict concerning measurements of plasma metanephrines for diagnosis of pheochromocytomas/paragangliomas (PPGL) by immunoassays compared to other methods. Objective: To compare the performance of a commercially available enzyme-linked immunoassay (EIA) with liquid chromatographic tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) measurements of metanephrines to diagnose PPGLs. Design: Sub-study of a prospective, multicenter trial to study the biochemical profiles of monoamine-producing tumors Patients: Patients included 174 males and 167 females with suspected PPGL (median age 54 years), of whom 54 had confirmed PPGL. Interventions: Plasma metanephrines were measured by EIA and LC-MS/MS, each in a specialized laboratory. Results: Plasma normetanephrine and metanephrine were measured 60% and 39% lower by EIA than by LC-MS/MS. Using upper cut-offs stipulated for the EIA, diagnostic sensitivity was only 74.1% at a specificity of 99.3%. In contrast, use of similar cut-offs for metanephrine and overall lower age-adjusted cutoffs for normetanephrine measured by LC-MS/MS returned a diagnostic sensitivity and specificity of 98.1% and 99.7%. Areas under receiver-operating characteristic curves, nevertheless, indicated comparable diagnostic performance of the EIA (0.993) and LC-MS/MS (0.985). Diagnostic sensitivity for the EIA increased to 96.2% with minimal loss in specificity (95.1%) following use of cut-offs for the EIA adapted to correct for the negative bias. Conclusions: EIA underestimates plasma metanephrines and diagnostic sensitivity is poor using commonly stipulated cut-offs, resulting in high risk for missing patients with PPGLs. Correction of this shortcoming can be achieved by appropriately determined cut-offs resulting in comparable diagnostic performance of EIA and LC-MS/MS assays.

In den vergangen Jahren ist durch eine verbesserte Bildgebung die Anzahl der zufällig entdeckten adrenalen Raumforderungen beständig angewachsen. Eine wichtige Differenzialdiagnose sowohl bei adrenalen Inzidentalomen als auch bei der refraktären Hypertonie stellt das Phäochromozytom dar. Aus diesem Hintergrund heraus leitet sich der Wunsch nach Methoden zur sensitiven und spezifischen Bestimmung biochemischer Parameter in der Diagnostik des Phäochromozytoms ab. Derzeit werden hierzu die freien Plasmametanephrine durch High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) als Mittel der Wahl angesehen. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf bzw. zum Ausschluss eines Phäochromozytoms die freien Plasmametanephrine mit Hilfe eines Radioimmunoassays (RIA) untersucht. Ziel war zum einen die Evaluierung der freien Metanephrine im Plasma mittels RIA als auch der Vergleich dieser mit anderen biochemischen Parametern und diagnostischen Verfahren hinsichtlich Sensitivität und Spezifität. Der hier verwendete RIA ist relativ zeitnah durchzuführen, kostengünstig und dadurch breit verfügbar. Er zeigt eine hohe diagnostische Sensitivität und Spezifität bei der Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma und bietet sich somit für den Einsatz in der Routinediagnostik des Phäochromozytoms an, wodurch verbesserte Aussagen zum Ausschluss bzw. zur Bestätigung der Anwesenheit des Tumors möglich werden.

Phäochromozytome und Paragangliome (PPGL) sind seltene, katecholaminproduzierendeTumore des chromaffinen Gewebes. Die Erkrankung ist durch die Überproduktion von Katecholaminen gekennzeichnet und kann lebensbedrohliche Folgen haben. Die dieser Arbeit zugrunde liegende Studie untersuchte die interindividuellen Unterschiede im Metabolitenprofil bei Patient*innen mit PPGL im Vergleich zu Kontrollen mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und einem Targeted Metabolomic Ansatz. Targeted Metabolomics beschreibt die Messung und Quantifizierung von im Voraus definierten Metaboliten in einer Probe. Von den 188 gemessenen Metaboliten zeigten vier Metabolite eine signifikanten Veränderung zwischen den Gruppen (Histidin, Threonin, LysoPC a C28:0 und Summe der Hexosen). Für alle vier Metabolite wurde ein Zusammenhang mit Katecholaminen im Urin beziehungsweise Metanephrinen im Plasma nachgewiesen. Subgruppenanalysen zeigten weitere Hinweise auf geschlechts- und phänotypspezifische Unterschiede im Metabolitenprofil zwischen Patient*innen mit PPGL und Kontrollen. / Pheochromocytomas and paragangliomas (PPGL) are rare, catecholamine-producing tumors arising from chromaffin cells. The disease is characterized by the overproduction of catecholamines and can have life-threatening consequences. The study on which this work is based investigated the interindividual differences in metabolite profiles in patients with PPGL compared to controls using liquid chromatography-mass spectrometry and a targeted metabolomics approach. Targeted metabolomics describes the measurement and quantification of predefined metabolites. Of the 188 metabolites measured, four metabolites showed a significant change between groups (histidine, threonine, LysoPC a C28:0 and sum of hexoses). A significant correlation with urinary catecholamines and/ or plasma metanephrines was identified for this metabolites. Subgroup analyses showed further evidence of sex- and phenotype-specific differences in metabolite profiles between patients with PPGL and controls.

In den vergangen Jahren ist durch eine verbesserte Bildgebung die Anzahl der zufällig entdeckten adrenalen Raumforderungen beständig angewachsen. Eine wichtige Differenzialdiagnose sowohl bei adrenalen Inzidentalomen als auch bei der refraktären Hypertonie stellt das Phäochromozytom dar. Aus diesem Hintergrund heraus leitet sich der Wunsch nach Methoden zur sensitiven und spezifischen Bestimmung biochemischer Parameter in der Diagnostik des Phäochromozytoms ab. Derzeit werden hierzu die freien Plasmametanephrine durch High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) als Mittel der Wahl angesehen. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf bzw. zum Ausschluss eines Phäochromozytoms die freien Plasmametanephrine mit Hilfe eines Radioimmunoassays (RIA) untersucht. Ziel war zum einen die Evaluierung der freien Metanephrine im Plasma mittels RIA als auch der Vergleich dieser mit anderen biochemischen Parametern und diagnostischen Verfahren hinsichtlich Sensitivität und Spezifität. Der hier verwendete RIA ist relativ zeitnah durchzuführen, kostengünstig und dadurch breit verfügbar. Er zeigt eine hohe diagnostische Sensitivität und Spezifität bei der Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma und bietet sich somit für den Einsatz in der Routinediagnostik des Phäochromozytoms an, wodurch verbesserte Aussagen zum Ausschluss bzw. zur Bestätigung der Anwesenheit des Tumors möglich werden.

Phäochromozytome und Paragangliome (PPGL) sind seltene neuroendokrine Tumore, die von Chromaffinzellen im Nebennierenmark (Phäochromozytome, PCC) oder vom extra-adrenalen Paraganglion (Paragangliome, PGL) ausgehen. Patienten mit PPGL zeigen in der Regel Anzeichen und Symptome, die mit der Biosynthese, Speicherung und Sekretion von Katecholaminen (Dopamin, Noradrenalin, Adrenalin) zusammenhängen. Der Katecholamin-Stoffwechsel bei PPGLs wird durch den genetischen Hintergrund bestimmt. Tumoren, die auf pathogene Varianten (PVs) in Genen zurückzuführen sind, die zur Aktivierung von Hypoxie-Signalwegen führen, sind nicht in der Lage, Epinephrin zu synthetisieren, während solche, die auf PVs in Genen zurückzuführen sind, die Kinase-Signalwege aktivieren, zur Epinephrin-Synthese befähigt sind. Dieser genetisch-biochemisch-klinische Phänotyp wurde in der klinischen Forschung nachgewiesen. Der Mechanismus, der der Regulierung der Katecholamin-Biosynthese durch Tumoren aufgrund von PVs in Kinase-Signalisierungsgenen zugrunde liegt, ist jedoch nicht klar. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der Katecholamin-Biosynthese in PPGLs aufgrund von PVs in HRAS, einem mit Kinase-Signalwegen assoziierten Gen, zu untersuchen. Darüber hinaus wurden klinische Merkmale wie Katecholamin-assoziierte Anzeichen und Symptome, die prächirurgische Diagnose und die Entwicklung einer wiederkehrenden Erkrankung bei Patienten mit PPGL untersucht. Um den Katecholamin-Stoffwechsel bei PPGL zu untersuchen, wurden Katecholamine und PNMT-Enzymaktivitäten in 251 PPGL-Geweben gemessen. Anschließend wurden zwei Hotspot-Varianten von Hras, G13R und Q61R, durch CRISPR/Cas9-basiertes Prime Editing in eine Phäochromozytom-Zelllinie (PC12) der Ratte eingeführt. Katecholamine und nachgeschaltete HRAS-Faktoren, die die Epinephrin-Biosynthese regulieren, wurden in den Zellen mit/ohne Hras-PVs gemessen. Wir fanden heraus, dass PPGLs, die auf HRAS-PVs zurückzuführen sind, einen signifikant höheren Epinephrin-Gehalt und PNMT-Enzymaktivitäten aufweisen als solche, die auf PVs in Genen zurückzuführen sind, die mit Hypoxie-Signalwegen in Verbindung stehen. In Zelllinienversuchen steigerten PVs in Hras die Pnmt-Expression zusammen mit einer erhöhten Epinephrin-Synthese. Weitere Experimente zeigten, dass Hras-PVs die Pnmt-Expression durch Phosphorylierung von SP1 über den MAPK-Signalweg hochregulieren. Darüber hinaus verringerten Hras-PVs die Glukokortikoidrezeptorspiegel, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber der gGukokortikoid-induzierten Expression von Pnmt reduziert wurde. Drei separate klinische Projekte wurden durchgeführt, um die mit Katecholaminen verbundenen klinischen Merkmale zu verstehen. Das erste Projekt untersuchte die Unterschiede in der klinischen Behandlung und die perioperativen Komplikationen bei Patienten mit Harnblasen-Paragangliom (UBPGL), die vor der Operation diagnostiziert oder fehldiagnostiziert wurden. In diesem Projekt wurde mehr als die Hälfte (53,6 %) der Patienten mit UBPGL vor der Operation nicht diagnostiziert. Wie erwartet wurden Patienten, die vor der Operation fehldiagnostiziert wurden, kaum mit einer alpha-adrenergen Blockade behandelt, und mehr dieser Patienten erlitten während der Operation eine Bluthochdruckkrise und perioperative Komplikationen als Patienten, die vor der Operation richtig diagnostiziert wurden. Eine weitere Analyse ergab, dass bei 34,5 % der Patienten mit Katecholamin-assoziierten Symptomen und/oder Bluthochdruck vor der Operation keine UBPGL diagnostiziert wurde. Darüber hinaus wurde Bluthochdruck als unabhängiger Faktor identifiziert, der mit der präoperativen Diagnose von UBPGL assoziiert ist. Das zweite Projekt untersuchte die Unterschiede im Auftreten von Katecholamin-assoziierten Zeichen und Symptomen bei Patienten mit und ohne metastasiertem PPGL (mPPGL). Wir konnten zeigen, dass das Auftreten von Katecholamin-assoziierten Anzeichen und Symptomen bei Patienten mit mPPGL mit der Produktion von Noradrenalin verbunden war, während es bei Patienten ohne mPPGL mit Epinephrin zusammenhing. Allerdings unterschieden sich die Anzeichen und Symptome bei Patienten mit metastasiertem PPGL nicht signifikant von denen mit nicht-metastasiertem PPGL. Das dritte Projekt untersuchte das Wiederauftreten der Krankheit bei Patienten mit sporadischem PPGL. Wir konnten zeigen, dass ein noradrenerger/dopaminerger Phänotyp des Primärtumors bei Patienten mit sporadischem PPGL ein unabhängiger Prädiktor für ein Wiederauftreten der Erkrankung ist. Darüber hinaus zeigten wir, dass bei 14,7 % dieser Patienten ein Rezidiv auftrat, bei einigen sogar noch 10 oder 15 Jahre nach der Resektion des Primärtumors. Diese Arbeit zeigte anhand von klinischen Tumorgewebedaten und in vitro gentechnisch hergestellten Zellmodellen, dass die Epinephrinbiosynthese bei PPGL vorwiegend durch den genetischen Hintergrund aufgrund von PVs in HRAS reguliert wird. Klinische Studien haben gezeigt, dass das Auftreten von Anzeichen und Symptomen, die prächirurgische Diagnose und das Wiederauftreten der Erkrankung mit dem Katecholaminstoffwechsel bei Patienten mit PPGL in Zusammenhang stehen. Daher muss der Katecholaminstoffwechsel bei der klinischen Behandlung von Patienten mit PPGL unbedingt berücksichtigt werden.:Content III Abbreviations: V List of figures and tables VII Zusammenfassung 1 Summary 3 1 Introduction and outline of the thesis 5 1.1 Pheochromocytomas and paragangliomas 5 1.2 Catecholamine metabolism in PPGLs 5 1.3 Pathogenic variants in the susceptibility genes of PPGLs 7 1.4 The association between genetic pathogenic variants and catecholamine metabolism in PPGLs 8 1.5 Catecholamine-associated clinical manifestations in patients with PPGLs 12 1.6 Catecholamine metabolite testing and diagnosis of PPGLs 12 1.7 Clinical treatment of patients with PPGLs 13 1.8 Follow-up for patients with PPGL 14 1.9 Outline of the thesis 15 2 Methods and results 17 2.1 Part 1: Regulation of epinephrine biosynthesis in HRAS-mutant paragangliomas 18 2.2 Part 2: Association of catecholamine metabolism and clinical management of patients with PPGL 67 2.2.1 Publication 1: 67 Differences in clinical presentation and management between pre- and postsurgical diagnoses of urinary bladder paraganglioma: is there clinical relevance? a systematic review 67 2.2.2 Publication 2: 74 Metastatic Pheochromocytoma and Paraganglioma: Signs and Symptoms Related to Catecholamine Secretion 74 2.2.3 Publication 3: 86 Recurrent disease in patients with sporadic pheochromocytoma and paraganglioma 86 3 General discussion 95 4 Conclusion 99 5 References 100 6 Acknowledgements 108 7 List of journal articles and invited presentations 109 8 Appendix 111 / Pheochromocytomas and paragangliomas (PPGLs) are rare neuroendocrine tumors derived from chromaffin cells within the adrenal medulla (pheochromocytomas, PCCs) or extra-adrenal paraganglia (paragangliomas, PGLs). Patients with PPGL normally present signs and symptoms that are associated with catecholamine (dopamine, norepinephrine, epinephrine) biosynthesis, storage, and secretion. Catecholamine metabolism in PPGLs is influenced by the genetic background. Tumors resulting from pathogenic variants (PVs) in genes that lead to activation of hypoxia signaling pathways are unable to synthesize epinephrine, whereas those resulting from PVs in genes that activate kinase signaling are capable of epinephrine synthesis. This genetic-biochemical-clinical phenotype has been revealed in clinical research. However, the mechanism behind the regulation of catecholamine biosynthesis in tumors due to PVs in kinase signaling genes remains unclear. Thus, this thesis aimed to investigate the mechanism of catecholamine biosynthesis in PPGLs due to PVs in HRAS, a gene associated with kinase signaling pathways. In addition, clinical features such as catecholamine-associated signs and symptoms, a presurgical diagnosis, and the development of recurrent disease in patients with PPGL were studied. To investigate the catecholamine metabolism in PPGLs, catecholamines and PNMT enzyme activities of 251 PPGL tissues were measured. Subsequently, two hotspot variants of Hras, G13R and Q61R, were introduced into a rat pheochromocytoma cell line (PC12) using CRISPR/Cas9-based prime editing. The levels of catecholamines and downstream factors of HRAS that regulate epinephrine biosynthesis were measured in the cells with/without Hras PVs. We found that PPGLs resulting from HRAS PVs had significantly higher epinephrine content and PNMT enzyme activities compared to those resulting from PVs in genes associated with hypoxia signaling pathways. Furthermore, in our cell line experiments, PVs in Hras increased Pnmt expression, along with increased epinephrine synthesis. Moreover, further experiments indicated that Hras PVs upregulated Pnmt expression through phosphorylation of SP1 via the MAPK pathway. In addition, Hras PVs decreased glucocorticoid receptor levels, thereby reducing sensitivity to glucocorticoid-induced expression of Pnmt. Three separate clinical projects were performed to better understand the clinical features associated with catecholamines. The first project investigated the differences in clinical management and per-operative complications between patients with urinary bladder paraganglioma (UBPGLs) who were correctly diagnosed and those who were misdiagnosed before surgery. In this project, more than half (53.6%) of the patients with UBPGL were not diagnosed before surgery. As expected, patients who were misdiagnosed before surgery received limited treatment with alpha-adrenergic blockade, resulting in a higher incidence of hypertension crisis during surgery and perioperative complications compared to patients diagnosed before surgery. Further analysis indicated that 34.5% of these patients presenting with catecholamine-associated symptoms and/or hypertension were not diagnosed with UBPGL before surgery. In addition, we identified hypertension as an independent factor associated with pre-surgical diagnosis of UBPGLs. The second project analyzed differences in the presentation of catecholamine-associated signs and symptoms in patients with and without metastatic PPGL (mPPGL). We showed that the presentation of catecholamine-associated signs and symptoms was associated with the production of norepinephrine in patients with mPPGL, whereas in non-mPPGL patients, it was associated with epinephrine. However, the signs and symptoms in patients with metastatic PPGLs did not significantly differ from those in patients with non-metastatic PPGL. The third project analyzed recurrent disease in patients with sporadic PPGL. We showed that a noradrenergic/dopaminergic phenotype of primary tumors was an independent predictor of recurrent disease among patients with sporadic PPGL. In addition, we showed that 14.7% of these patients experienced recurrent disease, with some cases occurring even 10 or 15 years after the resection of their primary tumors. This thesis, through the use of clinical tumor tissue data and in vitro genetically engineered cell models, indicated that epinephrine biosynthesis was predominantly regulated by the genetic background in PPGLs with PVs in HRAS. Additionally, clinical studies showed that the presentation of signs and symptoms, a pre-surgical diagnosis, and the presence of recurrent disease were associated with catecholamine metabolism in patients with PPGL. It is therefore imperative to consider catecholamine metabolism in the clinical management of patients with PPGL.:Content III Abbreviations: V List of figures and tables VII Zusammenfassung 1 Summary 3 1 Introduction and outline of the thesis 5 1.1 Pheochromocytomas and paragangliomas 5 1.2 Catecholamine metabolism in PPGLs 5 1.3 Pathogenic variants in the susceptibility genes of PPGLs 7 1.4 The association between genetic pathogenic variants and catecholamine metabolism in PPGLs 8 1.5 Catecholamine-associated clinical manifestations in patients with PPGLs 12 1.6 Catecholamine metabolite testing and diagnosis of PPGLs 12 1.7 Clinical treatment of patients with PPGLs 13 1.8 Follow-up for patients with PPGL 14 1.9 Outline of the thesis 15 2 Methods and results 17 2.1 Part 1: Regulation of epinephrine biosynthesis in HRAS-mutant paragangliomas 18 2.2 Part 2: Association of catecholamine metabolism and clinical management of patients with PPGL 67 2.2.1 Publication 1: 67 Differences in clinical presentation and management between pre- and postsurgical diagnoses of urinary bladder paraganglioma: is there clinical relevance? a systematic review 67 2.2.2 Publication 2: 74 Metastatic Pheochromocytoma and Paraganglioma: Signs and Symptoms Related to Catecholamine Secretion 74 2.2.3 Publication 3: 86 Recurrent disease in patients with sporadic pheochromocytoma and paraganglioma 86 3 General discussion 95 4 Conclusion 99 5 References 100 6 Acknowledgements 108 7 List of journal articles and invited presentations 109 8 Appendix 111

Background: Medication-related interferences with measurements of catecholamines and their metabolites represent important causes of false-positive results during diagnosis of phaeochromocytomas and paragangliomas (PPGLs). Such interferences are less troublesome with measurements by liquid chromatography with tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) than by other methods, but can still present problems for some drugs. Levodopa, the precursor for dopamine used in the treatment of Parkinson’s disease, represents one potentially interfering medication. Methods: Plasma and urine samples, obtained from 20 Parkinsonian patients receiving levodopa, were analysed for concentrations of catecholamines and their O-methylated metabolites by LC-MS/MS. Results were compared with those from a group of 120 age-matched subjects and 18 patients with PPGLs. Results: Plasma and urinary free and deconjugated (freeþconjugated) methoxytyramine, as well as urinary dopamine, showed 22- to 148-fold higher (P<0.0001) concentrations in patients receiving levodopa than in the reference group. In contrast, plasma normetanephrine, urinary noradrenaline and urinary free and deconjugated normetanephrine concentrations were unaffected. Plasma free metanephrine, urinary adrenaline and urinary free and deconjugated metanephrine all showed higher (P<0.05) concentrations in Parkinsonian patients than the reference group, but this was only a problem for adrenaline. Similar to normetanephrine, plasma and urinary metanephrine remained below the 97.5 percentiles of the reference group in almost all Parkinsonian patients. Conclusions: These data establish that although levodopa treatment confounds identification of PPGLs that produce dopamine, the therapy is not a problem for use of LC-MS/MS measurements of plasma and urinary normetanephrine and metanephrine to diagnose more commonly encountered PPGLs that produce noradrenaline or adrenaline.

Background: Measurement of plasma metanephrine, normetanephrine and 3-methoxytyramine is useful in the diagnosis of phaeochromocytomas, but many assays require a large volume of plasma due to poor assay sensitivity, and often require lengthy sample preparation. Our aim was to develop a method for measurement of plasma metanephrines using a small sample volume with minimal hands-on preparation. Methods: Samples were deproteinised using 10 K spin filters prior to online solid phase extraction using a Waters Acquity UPLC Online SPE Manager (Waters, Manchester, UK) coupled to a Waters Xevo TQ-S mass spectrometer (Waters, Manchester, UK). The assay was validated and results compared to a previously published method. Results: We achieved a limit of quantification of 37.5 pmol/L for metanephrine and 3-methoxytyramine and 75 pmol/L for normetanephrine using only 150 mL of sample. The assay was linear up to 30,000 pmol/L for all analytes and in a method comparison study results showed good agreement with a previously published LC-MS/MS assay. Conclusions: We have developed a simple method for measurement of plasma metanephrine, normetanephrine and 3-methoxytyramine using only 150 mL of sample. There is minimal hands-on sample preparation required and the assay is suitable for routine use in a clinical laboratory.