Die Gesamtheit mitochondrialer Gene sowie ein Teil der plastidären Gene photosynthetischer Eukaryoten wird durch kernkodierte Phagentyp-RNA-Polymerasen transkribiert. In der vorliegenden Arbeit wurden unter Verwendung eines homologen in vitro-Transkriptionssystems, die spezifischen Funktionen der Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm, RpoTp und RpoTmp aus Arabidopsis untersucht. Während RpoTmp keine Präferenz für die angebotenen Promotoren zeigte, transkribierten RpoTm und RpoTp eine überlappende Gruppe mitochondrialer und plastidärer Promotoren vielfältiger Architektur. RpoTm und RpoTp präsentierten eine Kofaktor-unabhängige Fähigkeit zur Promotorerkennung bei Angebot superhelikaler DNA-Matrizen. Eine selektive Promotornutzung sowie die Unfähigkeit zur spezifischen Transkription linearer Promotormatrizen in vitro implizieren die Assoziation zusätzlicher, in die Promotorerkennung und/oder DNA-Aufschmelzung involvierter Kofaktoren in vivo. Die in vitro-Erkennung mitochondrialer Promotoren durch eine plastidäre Phagentyp-RNA-Polymerase (und umgekehrt) sowie weitere Ähnlichkeiten der Transkriptionsapparate der Mitochondrien und Plastiden, wie die strukturelle Organisation ihrer Promotoren und die phylogenetische Herkunft ihrer kernkodierten Transkriptasen inspirierte in planta Studien zur spezifischen Transkription eines mitochondrialen Promotors in den Plastiden. Hierzu wurde die Expression des nptII-Reportergens unter Kontrolle des mitochondrialen PatpA-Promotors aus Oenothera in transplastomischen Tabakpflanzen analysiert. Die durchgeführten Studien belegen eine korrekte Transkription des mitochondrialen PatpA-Promotors durch eine plastidäre Phagentyp-RNA-Polymerase in in vitro-Transkriptionsassays sowie in transplastomischen Tabakpflanzen. Diese Resultate enthüllen weitere unerwartete Ähnlichkeiten der organellären Genexpression, die aufschlussreiche evolutionäre Einblicke erlauben und verbesserte Anwendungen zur Manipulation plastidärer Genome ermöglichen könnten. / All mitochondrial and a subset of plastidial genes of photosynthetically active eukaryotes are transcribed by nuclear-encoded, phage-type RNA polymerases. In this study, a homologous in vitro transcription system was used to define the specific functions of Arabidopsis phage-type RNA polymerases RpoTm, RpoTp and RpoTmp in organellar transcription. RpoTmp displayed no significant promoter specificity, whereas RpoTm and RpoTp were able to accurately initiate transcription from overlapping subsets of mitochondrial and plastidial promoters of diverse architecture. RpoTm and RpoTp thereby demonstrated an intrinsic capability to recognize promoters on supercoiled DNA templates without the aid of protein cofactors. A selective promoter recognition by the phage-type RNAPs in vitro and the inability to recognize promoters on linear templates imply that auxiliary factors are required for efficient initiation of transcription and/or DNA melting in vivo. Crosswise recognition of organellar promoters by the phage-type RNA polymerases in vitro as well as other similarities of the mitochondrial and plastidial transcription machineries such as promoter structures and the phylogenetic origin inspired in planta studies to investigate specific transcription of a mitochondrial promoter in plastids. Therefore, the expression of an nptII reporter gene under control of the mitochondrial PatpA promoter from Oenothera was analyzed in transplastomic tobacco plants. The data presented here demonstrate the faithful recognition of the mitochondrial PatpA promoter by a plastid RNA polymerase both in in vitro transcription assays and in transplastomic tobacco plants. These findings disclose further unexpected similarities of the organellar gene expression systems which deliver interesting evolutionary insights and might facilitate improved applications for chloroplast genome engineering.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Transkription mitochondrialer Gene durch die kernkodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm und RpoTmp der Pflanze Arabidopsis untersucht. Im Mitochondriengenom von Arabidopsis wurden f r 12 Gene Promotoren bestimmt. Diese zeigten verschiedene Sequenzelemente und wichen meist von der f r Dikotyle publizierten Konsensussequenz ab. F r die Mehrheit der Gene wurden multiple Promotoren identifiziert. Es wurden weiterhin Promotoren nachgewiesen, welche die Transkription vermutlich nicht funktioneller Sequenzen aktivieren. Architektur, Lokalisation und Nutzung mitochondrialer Promotoren implizieren eine wenig stringente Kontrolle der Transkriptionsinitiation in Arabidopsis-Mitochondrien. Zur Analyse der Funktionen von RpoTm und RpoTmp wurde ein in vitro-Transkriptionssystem entwickelt. Da RpoT-Enzyme m”glicherweise Kofaktoren ben”tigen, wurde in Arabidopsis nach Genen potentieller mitochondrialer Transkriptionsfaktoren gesucht. Als mitochondriales Protein mit Žhnlichkeit zu mtTFB, einem essentiellen Transkriptionsfaktor in Hefemitochondrien, wurde MetA identifiziert. In in vitro-Assays initiierte RpoTm an verschiedenen Promotoren die Transkription, w„hrend RpoTmp keine signifikante Promotorspezifit„t zeigte. Die spezifische Promotornutzung durch RpoTm erforderte superhelikale DNA. Weder RpoTm noch RpoTmp wurde durch MetA stimuliert. Eine mtTFB-„hnliche Funktion von MetA ist daher unwahrscheinlich. F r MetA wurde ausserdem eine engere phylogenetische Beziehung zu nukle„ren rRNA-Dimethylasen als zu mtTFB ermittelt. Die hier vorgestellten Studien belegen die Transkription mitochondrialer Gene in Arabidopsis durch RpoTm; f r RpoTmp ist eine nicht-redundante Transkriptionsfunktion denkbar. Die Kofaktor-unabh„ngige Spezifit„t von RpoTm f r verschiedene Promotoren und die wenig stringente Initiationskontrolle in vivo legen nahe, dass eine individuelle Regulation mitochondrialer Gene in Arabidopsis auf Transkriptionsebene nicht erfolgt. / Mitochondria depend on a nucleus-encoded transcription machinery to express their genome. The present study examined the transcription of mitochondrial genes by two nucleus-encoded phage-type RNA polymerases, RpoTm and RpoTmp, in the plant Arabidopsis. For selected mitochondrial genes in Arabidopsis, transcription initiation sites were determined. Most genes were found to possess multiple promoters. The identified promoters displayed diverse sequence elements and mostly deviated from a nonanucleotide consensus derived previously for dicot mitochondrial promoters. Several promoters were detected that activate transcription of presumably non-functional sequences. Promoter architecture, distribution and utilization suggest a non-stringent control of transcription initiation in Arabidopsis mitochondria. An in vitro transcription system was set up to elucidate the roles of RpoTm and RpoTmp. Since RpoT enzymes possibly require auxiliary factors, the Arabidopsis genome was screened for potential cofactors of phage-type RNA polymerases. A mitochondrial protein (MetA) with similarity to mtTFB, an essential transcription factor in yeast mitochondria, was identified. In in vitro transcription studies, RpoTm recognized various promoters whereas RpoTmp displayed no significant promoter specificity. Promoter recognition by RpoTm depended on supercoiled DNA templates. Transcription initiation by RpoTm or RpoTmp was not affected by MetA, indicating that MetA is not functionally equivalent to mtTFB. Besides, MetA was found to be more closely related to non-mitochondrial rRNA dimethylases than to mtTFB. The present study establishes RpoTm to transcribe mitochondrial genes; RpoTmp may have a non-overlapping transcriptional role in mitochondria. The cofactor-independent promoter specificity of RpoTm and the apparently non-stringent control of transcription initiation in vivo imply that mitochondrial genes in Arabidopsis may not be regulated individually at the transcriptional level.

Zusätzlich zu der eubakteriellen RNA-Polymerase (RNAP) der Plastiden sind im Zellkern von Arabidopsis thaliana drei weitere, phagentypische RNAP kodiert, die jeweils aus nur einer Einheit aufgebaut sind. Die Enzyme RpoTp und RpoTm werden in die Plastiden, bzw. die Mitochondrien transportiert, während RpoTmp in beiden Organellen zu finden ist. Um die Lichtabhängigkeit der RpoT-Gene zu untersuchen, wurde die lichtinduzierte Akkumulation ihrer Transkripte in 7-Tage alten Keimlingen, sowie 3- bzw. 9-Wochen alten Rosettenblättern mittels quantitativer real-time PCR ermittelt. Die entwicklungsabhängige Regulation der RpoT-Transkript-Akkumulation wurde außerdem während der Blattentwicklung analysiert. Zusätzlich wurde der Einfluss des circadianen Rhythmus untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Transkriptakkumulation aller drei RpoT-Gene stark lichtinduziert war und nur marginalen circadianen Schwankungen unterlag. In weiteren Versuchen mit verschiedenen Lichtrezeptor-Mutanten und unterschiedlichen Lichtqualitäten wurde der Einfluss multipler Rezeptoren auf den Prozess der Lichtinduktion gezeigt. In den Zellen höherer Pflanzen finden sich drei Genome. Die Biogenese von Chloroplasten und Mitochondrien, sowie lebenswichtige Prozesse, wie Atmung und Photosynthese setzen oftmals die Aktivität von Genen auf mindestens zwei dieser Genome voraus. Eine intrazelluläre Kommunikation zwischen den verschiedenen Genomen ist daher unumgänglich für einen funktionierenden Stoffwechsel der Pflanze. In dieser Arbeit wurde herausgestellt, dass die Zahl mitochondrialer Genkopien in photosynthetisch inaktiven Arabidopsis-Keimlingen drastisch erhöht ist. Bei der Untersuchung des DNA-Gehaltes in Proben, die Altersstufen von 2-Tage alten Keimblättern bis hin zu 37-Tage alten, seneszenten Rosettenblättern umfassten, fand sich ein deutlicher Anstieg der Kopienzahlen in älteren Rosettenblättern. Außerdem unterschieden sich die Kopienzahlen der untersuchten Gene zum Teil erheblich voneinander. / In addition to eubacterial-like multi-subunit RNA polymerases (RNAP) localized in plastids and the nucleus, Arabidopsis thaliana contains three phage-like single-unit, nuclear-encoded, organellar RNAPs. The enzymes RpoTp and RpoTm are imported into plastids and mitochondria, respectively, whereas RpoTmp shows dual targeting properties into both organelles. To investigate if expression of the RpoT genes is light-dependent, light-induced transcript accumulation of RpoTm, RpoTp and RpoTmp was analyzed using quantitative real-time-PCR in 7-day-old seedlings as well as in 3- and 9-week-old rosette leaves. To address the question whether RpoT transcript accumulation is regulated differentially during plant development transcript abundance was measured during leaf development. Additionally, effects of the plants circadian rhythm on RpoT transcript accumulation were analyzed. Transcripts of all three RpoT genes were found to be strongly light-induced even in senescent leaves and only marginally influenced by the circadian clock. Further analyses employing different photoreceptor mutants and light qualities revealed the involvement of multiple receptors in the light-induction process. The biogenesis of mitochondria and chloroplasts as well as processes like respiration and photosynthesis require the activity of genes residing in at least two distinct genomes. There have to be ways of intracellular communication between different genomes to control gene activities in response to developmental and metabolic needs of the plant. In this study, it was shown that gene copy numbers drastically increased in photosynthetically inactive Arabidopsis seedlings. Mitochondrial DNA contents in cotyledons and leaves ranging in age from 2-day-old cotyledons to 37-day-old senescent rosette leaves were examined. A common increase in senescing rosette leaves and drastic differences between individual genes were found, revealing the importance of an integrative chondriome in higher plant cells.

In mono- und eudikotylen Pflanzen kodiert eine Genfamilie (RpoT, RNA-Polymerase des T3/T7-Typs) mitochondriale und plastidäre RNA-Polymerasen (RNAP), die den ungeraden T-Phagen-Polymerasen ähneln. RpoT-Gene von Angiospermen sind gut charakterisiert, während aus tiefer abzweigenden Pflanzenspecies bisher lediglich die Gene aus dem Moos Physcomitrella beschrieben wurden. Um einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Evolution der RpoT-Polymerasen im Pflanzenreich zu liefern und um Erkenntnisse über die potentielle Bedeutung von multiplen Phagen-Typ (RNAP) in Pflanzen zu gewinnen, wurden die RpoT-Gene aus dem Lycophyten Selaginella moellendorffii und aus dem basalen Angiosperm Nuphar advena identifiziert und charakterisiert. Selaginella moellendorffii (Moosfarn)-Trace-Sequenzdaten mit hoher Ähnlichkeit zu RpoT-Sequenzen von Angiospermen wurden benutzt, um das full-length SmRpoT-Gen und die entsprechende cDNA zu isolieren. Die SmRpoT-mRNA ist 3542 nt lang und weist einen offenen Leserahmen von 3006 nt auf, der für ein putatives Protein aus 1002 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 113 kDa kodiert. Das SmRpoT-Gen besteht aus 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen aus den Angiosperm- und Physcomitrella-Genen konserviert sind. Mittels Southernblot-Analyse wurde nachgewiesen, dass S. moellendorffii ein single-copy RpoT-Gen kodiert. Für das N-terminale Transitpeptid von SmRpoT konnte gezeigt werden, dass es bei transienter Expression in Arabidopsis- und Selaginella-Protoplasten den Transport von GFP (green fluorescent protein) exclusiv in Mitochondrien vermittelt. In N. advena wurden mittels Screening einer BAC-Bibliothek drei RpoT-Gene identifiziert. Sowohl die genomischen als auch die cDNA-Sequenzen wurden aufgeklärt. Die NaRpoT-mRNAs kodieren putative Polypeptide von 996, 990 und 985 Aminosären. Alle drei Gene besitzen 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen der RpoT-Gene aus Selaginella und allen anderen Landpflanzen konserviert sind. Die kodierten Proteine weisen auf Aminosäureebene einen hohen Konservierungsgrad auf, einschließlich aller essentiellen Regionen und Aminosäurereste, die für die T7-RNAP bekannt sind. Die N-terminalen Transitpeptide zweier der kodierten RNAP, NaRpoTm1 und NaRpoTm2, vermittelten den Import von GFP exclusiv in Mitochondrien, während die dritte Polymerase, NaRpoTp, in Chloroplasten importiert wurde. Interessanterweise muß die Translation der NaRpoTp-mRNA an einem CUG-Codon initiiert werden, um ein funktionelles Protein mit plastidärem Transitpeptid zu erhalten. Die N. advena RpoTp-RNAP ist somit neben AGAMOUS aus Arabidopsis und der RpoTp-RNAP aus Nicotiana, ein weiteres Beispiel für jene selten vorkommenden pflanzlichen mRNAs, deren Translation exclusiv an nicht-AUG-Codons initiiert wird. Die Rekonstruktion von phylogenetischen Bäumen resultierte in unterschiedlichen Positionen für die Selaginella- und Nuphar-Polymerasen: Im Gegensatz zu der RpoT-Polymerase aus S. moellendorffii und denen aus Physcomitrella, die in den phylogenetischen Analysen Schwesterpositionen zu allen anderen Phagentyp-RNAP der Angiospermen einnehmen, clusterten die Nuphar-RpoTs zusammen mit den deutlich separierten mitochondrialen (NaRpoTm1 und NaRpoTm2) und plastidären (NaRpoTp) Polymerasen. Selaginella kodiert eine einzige mitochondriale RNAP, während Nuphar zwei mitochondriale und eine plastidäre RNAP besitzt. Die Identifizierung einer Plastiden-lokalisierten Phagentyp-RNAP in diesem basalen Eudikotylen, die ortholog zu allen anderen RpoT-Enzymen der Blütenpflanzen ist, läßt darauf schließen, daß die Acquisition einer nukleär kodierten plastidären RNAP, die noch in den Lycopoden fehlt, nach der Trennung der Leucopoden von allen anderen Tracheophyten erfolgte. Eine “dual-targeting” RNAP (mitochondrial und plastidär lokalisiert), wie sie in Eudikotylen, nicht jedoch in Monokotylen vorkommt, wurde weder in Selaginella noch in Nuphar nachgewiesen, vermutlich ist sie ein evolutionäres Novum von eudikotylen Pflanzen wie Arabidopsis. / In mono- and eudicot plants, a small nuclear gene family (RpoT, RNA polymerase of the T3/T7 type) encodes mitochondrial as well as chloroplast RNA polymerases homologous to the T-odd bacteriophage enzymes. RpoT genes from angiosperms are well characterized, whereas data from deeper branching plant species until recently were limited to the moss Physcomitrella. To elucidate the molecular evolution of the RpoT polymerases in the plant kingdom and to get more insight into the potential importance of having more than one phage-type RNA polymerase (RNAP) available, we identified and characterized RpoT genes in the lycophyte Selaginella moellendorffii and the basal eudicot Nuphar advena. Selaginella moellendorffii (spikemoss) sequence trace data encoding a polypeptide highly similar to angiosperm and moss phage-type organelle RNA polymerases were used to isolate a BAC clone containing the full-length gene SmRpoT as well as the corresponding cDNA. The SmRpoT mRNA comprises 3452 nt with an open reading frame of 3,006 nt, encoding a putative protein of 1,002 amino acids with a molecular mass of 113 kDa. The SmRpoT gene comprises 19 exons and 18 introns, conserved in their position with those of the angiosperm and Physcomitrella RpoT genes. Using Southern blot analysis, it was shown that S. moellendorffii encodes a single RpoT gene. The N-terminal transit peptide of SmRpoT was shown to confer targeting of green fluorescent protein (GFP) exclusively to mitochondria after transient expression in Arabidopsis and Selaginella protoplasts. In Nuphar advena three RpoT genes were identified by BAC library screening. Both genomic gene sequences and full-length cDNAs were determined. The NaRpoT mRNAs specify putative polypeptides of 996, 990 and 985 amino acids, respectively. All three genes comprise 19 exons and 18 introns, conserved in their positions with those from S. moellendorffii and the RpoT genes of other land plants. The encoded proteins show a high degree of conservation at the amino acid sequence level, including all functional crucial regions and residues known from the phage T7 RNAP. The N-terminal transit peptides of two of the encoded polymerases, NaRpoTm1 and NaRpoTm2, conferred targeting of GFP exclusively to mitochondria, whereas the third polymerase, NaRpoTp, was targeted to chloroplasts. Remarkably, translation of NaRpoTp mRNA has to be initiated at a CUG codon to generate a functional plastid transit peptide. Thus, besides AGAMOUS in Arabidopsis and the Nicotiana RpoTp polymerase, N. advena RpoTp provides another example for a plant mRNA that is exclusively translated from a non-AUG codon. Reconstruction of phylogenetic trees revealed different positions of the RpoTs from the lycophyte Selaginella and the basal eudicot Nuphar. In contrast to the RpoTs of S. moellendorffii and those of the moss Physcomitrella, which are according to the phylogenetic analyses in sister positions to all other phage-type polymerases of angiosperms, the Nuphar RpoTs clustered with the well separated clades of mitochondrial (NaRpoTm1 and NaRpoTm2) and plastid (NaRpoTp) polymerases. Selaginella encodes a single mitochondrial RNAP, whereas Nuphar harbors two mitochondrial and one plastid phage-type polymerases. Identification of a plastid localized phage-type RNAP in this basal eudicot, orthologous to all other RpoTp enzymes of flowering plants, suggests that the acquisition of a nuclear encoded plastid RNA polymerase, not present in lycopods, took place after the split of lycopods from all other tracheophytes. A dual-targeted mitochondrial and plastid RNA polymerase (RpoTmp), as present in eudicots but not monocots, was not detected in Nuphar or Selaginella suggesting that its occurrence is an evolutionary novelty of eudicotyledoneous plants like Arabidopsis.