L'endoribonucléase de restriction RegB est une enzyme produite par le bactériophage T4. Elle est impliquée dans la transition phase précoce-phase moyenne durant le cycle lytique du virus. RegB coupe avec une spécificité quasi absolue la séquence GGAG impliquée notamment dans l'initiation de la traduction chez la bactérie Escherichia coli. Nous avons caractérisé dans cette thèse de façon précise la toxicité de RegB dans la bactérie et nous avons proposé des outils pour contourner cette toxicité tels la manipulation du nombre de copies du vecteur d'expression ou l'atténuation de l'efficacité du site d'initiation de la traduction. Nous avons, par ailleurs, proposé une application de RegB pour la construction d'un vecteur de clonage à sélection positive et à expression duale dans les systèmes procaryotes et eucaryotes. L'étude par RMN du 31P de la cinétique de clivage d'un ARN par RegB a permis de définir RegB comme une "transphosphorylase libérant un phosphodiester 2', 3'-cyclique". Des études de mutagenèses dirigées et aléatoires combinées à l'évolution du gène regB dans un virus apparenté au phage T4 (le virus RB49) ont mis en évidence le rôle des résidus Glutamate 19, Histidine 48, Arginine 52 et Histidine 68 dans l'activité de RegB. Le mutant RegB H48A a été choisi pour construire un modèle structural du site actif de RegB. L'attribution séquentielle de cette protéine par RMN hétéronucléaire 1H/15N/13C a été entreprise avec succès.

Âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) são estruturas essenciais para a ancoragem de glicoconjugados e proteínas na superfície celular de protozoários. Trypanosoma cruzi produz uma gama de estruturas únicas de GPI, as quais ancoram mucinas e trans-sialidases, que participam de processos envolvidos na interação entre parasita e hospedeiro. Afim de estudar a biossíntese de âncora de GPI de T. cruzi e possivelmente utilizá-la como um potencial alvo anti-T.cruzi, este trabalho visa sintetizar análogos de âncoras de GPI e analisar o potencial destas moléculas como substratos da via biossintética de GPIs. Neste contexto, um pseudo-dissacarídeo 31 foi sintetizado através de O-glicosilação entre os doadores derivados de azido-glicopiranosídeo (32 ou 33a-d) e o acceptor de mio-inositol (34), preparados a partir de cloridrato de glucosamina (35) e metil-?-D-glucopiranósido (36), respectivamente, usando proteção/desproteção ortogonais. Cinco diferentes dadores de glicosídicos (32 e 33a-d) foram preparados para investigar a influcia dos seus grupos protetores na estereoselectividade da reações de O-glicosilação na presença de diferentes solventes para estudar o favorecimento da configuração ?, presente em GPIs. Ademais, a síntese do aceptor de mio-inositol 34 foi realizada em 12 etapas pela estratégia do rearranjo Ferrier para formar um derivado de ciclitol, além de diversas proteções/desproteções, funcionalizado que permite a introdução regiosselectiva da unidade de azido glicose (32-33a-d) e uma porção de fosfolípido no seu C-1 e posições C-6, respectivamente. Assim, O-glicosilação entre doador 33c e o acceptor 34, foi realizada utilizando TMSOTf como promotor para originar o composto 31c com boa estereoseletividade para ?, com elevado rendimento (~70%). Após a dealilação de 31c, a porção fosfodiéster contendo uma cadeia C-8 (87), preparada pela abordagem do H-fosfonato, foi anexada ao pseudo-dissacarídeo para gerar, após desprotecção global, o composto alvo 30a. A mesma estratégia sintética foi aplicada ao preparo do composto 91 contendo uma cadeia lateral alquil-naftil (90) que está em últmas etapas de desproteção para gerar o composto final 30c. Atualmente, o composto 30a está sendo testado como substrato da biossíntese de âncoras de GPI em membranas microssomais de Euglena gracilis, uma alga unicelular não patogênica, que pode potencialmente ser utilizada como modelo para parasitas humanos filogeneticamente relacionados. Após a incubação do potencial substrato de GPI 30a com membranas microssomais de E. gracilis para geração de metabólitos, será realizada análise do extrato por LC-MS e, eventualmente, isolamento dos produtos formados para posterior caracterização. Os produtos que apresentarem atividade como substrato ou como inibidores da biossíntese de GPI em E. gracilis serão também ensaiados na membrana microsomal do T. cruzi. / Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors are essential molecules to attach glycoconjugates and proteins in protozoan\'s cell surface. Trypanosoma cruzi produces a range of unique GPI structures that anchor mucins and trans-sialidases which participate in important processes involved in the interaction between parasite and host. As an effort to study T. cruzi GPI anchor biosynthesis and possibly use it as a potential target for an antichagasic drug, this work aims to synthesize GPI anchor analogs (labelled or not) and analyze the potential of these molecules as substrates in the GPI biosynthetic pathway. In this context, a pseudo-disaccharide 31 was synthesized by O-glycosylation reaction between azide glycosyl donors (32 or 33a-d) and myo-inositol acceptor (34), prepared from glucosamine (35) hydrochloride and methyl ?-D-glucopyranoside (36), respectively, using orthogonal protection/ deprotection. Five different glycosyl donors (32 and 33a-d) were prepared to investigate the influence of their protective groups on the stereoselectivity of the O-glycosylation reaction in the presence of different solvents to afford the required GPI ?-linkage. In addition, the synthesis of the myo-inositol acceptor 34 was achieved using several protection/deprotection steps, besides the Ferrier rearrangement, to form a functionalized cyclitol derivative that enables the regioselective introduction of the azide glycoside unit and phospholipid moiety on its C-1 and C-6 positions, respectively. Then, O-glycosylation of acceptor 34 with donor 33c was accomplished in diethyl ether, using TMSOTf as promoter to give exclusively ?-anomer 31c in high yield. After deallylation of 31c, the phosphodiester moiety bearing an octyl chain (87), prepared by the H-phosphonate approach, was appended to the pseudo-disaccharide to yield, after deprotection, target compounds 30a. The same synthetic strategy was applied to the preparation of 30c, even though in the protective form, compound 91 bearing an alkyl-naphthyl side chain (90). Currently, compound 30a is being tested as substrates of GPI anchor biosynthesis in Euglena gracilis cell membranes, a non-pathogenic unicellular algae, which may potentially be used as a model for phylogenetically related human parasites. After incubation of the potential GPI substrate 30a with E. gracilis microsomal membranes for generation of metabolites, the analysis by LC-MS and, eventually, isolation of the products will be performed for further characterization. Products that show any substrate or inhibitory activities will be also assayed in T. cruzi microsomal membrane.

Les polymères à empreintes moléculaires (MIP) sont des matériaux synthétiques capables de mimer les anticorps biologiques. En effet, ils possèdent deux des principales caractéristiques de ces derniers, à savoir : la capacité de reconnaître et de se lier spécifiquement à des molécules cibles. De plus, leur synthèse facile, leur bas coût de production, leur haute spécificité et stabilité par rapport aux anticorps naturels font des MIP une alternative intéressante. En effet, les propriétés de reconnaissance moléculaire des MIP permettent d'envisager leur utilisation dans une vaste gamme d’applications. Ils sont ainsi largement exploités dans les sciences séparatives pour l'analyse d'échantillons environnementaux ou agro-alimentaires, ou comme élément de reconnaissance dans des biocapteurs. Récemment, des applications de ces matériaux dans les domaines biologiques et biomédicaux ont émergé comme pour la détection, l'extraction et l"élimination de molécules indésirables dans l'organisme, la vectorisation ou l'administration contrôlée des médicaments. Dans nos recherches, nous avons développé des MIP dégradables par voie biochimique ou enzymatique, ayant une application potentielle en tant que système de libération contrôlé de molécules. En général, les MIPs sont synthétisés par polymérisation radicalaire libre en utilisant une formulation composée de monomères fonctionnels, d'agents de réticulation, et d'une molécule cible servant à réaliser l'empreinte moléculaire. Dans ce travail de thèse, nous avons utilisé pour la synthèse de MIP dégradable des agents de réticulation clivables contenant, soit une fonction chimique dégradable par voie chimique ou enzymatique (ponts disulfures et phosphatediester), soit un disaccharide issus d'agro-ressources et pouvant être naturellement hydrolysé par des enzymes. En présence d'un réactif spécifique (agent réducteur ou enzyme), les liaisons dites "sensibles" aux réactifs chimiques ou enzymatiques peuvent être clivées, ce qui entraîne une dégradation de la matrice polymérique. Le polymère perdra alors sa capacité de reconnaissance et de liaison à la molécule cible et permettra la libération de celle-ci. Nous pensons donc, que les nouveaux MIP dégradables pourraient avoir un énorme potentiel comme vecteurs "intelligents" dans des applications médicales tels que les systèmes de libération contrôlée de médicament. Finalement, nous avons étudié la dégradation par des microorganismes de la structure de base de ce type de polymères, en utilisant comme modèles des chaines linéaires et réticulées. / Molecularly imprinted polymers (MIPs) are biomimetic synthetic receptors that possess two of the most important features of biological antibodies – the ability to recognize and bind specific target molecules. Owing to their easier preparation, lower cost, higher specifity and stability compared to antibodies, they have the potential to be widely applied for environemental and food analysis. Recently, MIPs also emerged in the biochemical field as diagnostic tools, chemicals traps to remove undesirable substance from the body, or drug delivery systems, where usually the combination of biocompatibility and degradability after its use is desirable. Here, we developed biochemically or enzymatically degradable MIPs, which have potential applications as activation-modulated drug delivery systems. In general, MIPs are prepared by radical polymerization of functional monomers and cross-linkers in the presence of a target molecule acting as template. Degradable MIPs were synthesized using cleavable cross-linkers containing a degradable group (disulfide bond or phosphate ester bond) or derived from a natural disaccharide. In the presence of a cleaving reagent (reducing agent or enzyme), the chemo or enzyme-sensitive bond could be cleaved, resulting in the degradation of the polymer matrix. The degraded polymers looses the binding sites structure resulting in the loss of recognition and binding capacity towards the target molecules, and thus in the release of bound molecules. These degradable MIPs provide new opportunities as “smart” vectors for controlled delivery of active molecules in biomedical applications. Finally, the biodegradation of the polymer backbone by bacteria was investigated.

Récemment, la chimie des phosphoramidites s’est montrée efficace et polyvalente en tant que plateforme pour accéder à des poly(phosphodiester)s à séquence définies abiotiques. Grâce à cette stratégie, les monomères peuvent être placés dans la chaîne à des positions choisies, ouvrant la voie à de nombreuses possibilités pour la préparation de macromolécules fonctionnelles. Ici, la méthode phosphoramidite a été explorée pour la synthèse de polymères dits numériques, qui contiennent des séquences de monomères encodées binairement. Des polymères dont les longueurs de chaînes et les séquences numériques sont contrôlées ont été préparés en utilisant une stratégie phosphoramidite classique impliquant des groupements protecteurs diméthoxytrityles, ou bien un procédé photocontrôlé faisant intervenir des groupements nitrophénylpropyloxycarbonyles clivables à la lumière. En outre, plusieurs stratégies pour modifier l’information contenue dans les chaînes latérales ont été étudiées dans cette thèse. Une modification binaire post-polymérisation à travers deux cycloadditions alcyne-azoture catalysées par le cuivre(I) consécutives a été examinée pour optimiser les chaînes latérales des poly(phosphodiester)s à séquences définies. De plus, la libération photocontrôlée de différents motifs éthers ortho-nitrobenzyliques latéraux a été étudiée. Ces fonctions ont permis la conception d’oligo(phosphodiester)s numériques dont les séquences d’information peuvent être effacées ou révélées grâce à la lumière. / Phosphoramidite chemistry has recently been evidenced to be an efficient and versatile platform to access sequence-defined abiotic poly(phosphodiester)s. Using this strategy, monomers can be placed at defined positions positions in a chain, thus opening up wide possibilities for the preparation of functional macromolecules.Here, the phosphoramidite platform was explored to synthesize so-called digital polymers, which contain monomer-coded binary sequences. Polymers with controlled chain lengths and digital sequences were prepared using either a standard phosphoramidite strategy involving dimethoxytrityl protective groups or a photo-controlled process involving light-cleavable nitrophenylpropyloxycarbonyl protective groups. Additionally, several strategies to modify the side chain information were investigated in this thesis. A binary post-polymerization modification by means of sequential copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloadditions was investigated for tuning the side chain functionality of sequence-defined poly(phosphodiester)s. Moreover, the photo-controlled release of several ortho-nitrobenzylic ether side chain motifs was studied. These moieties allowed the design of digital oligo(phosphodiester)s whose sequence information can be erased or revealed with light as a trigger.