Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-10T08:33:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2551787 bytes, checksum: 71ddb0374c66aab0bc01094fd2206080 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-10T08:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2551787 bytes, checksum: 71ddb0374c66aab0bc01094fd2206080 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A enzima mio-inositol-1-fosfato sintase (MIPS1) (E.C.5.5.1.4) catalisa a conversão irreversível de D-Glicose-6-P para 1-L-mio-inositol-1-P. O mio-inositol desempenha papel de destaque no metabolismo vegetal, fornecendo inositol e inositídeos em processos metabólicos essenciais à formação do vegetal. Dentre as várias vias nas quais o mio-inositol está envolvido algumas são alvo do melhoramento vegetal, a exemplo a manipulação do conteúdo de ácido fítico e de oligossacarídeos em sementes e açúcares estruturais na parede celular. Até o presente momento, plantas MIPS silenciadas não foram caracterizadas em detalhes, principalmente em suas estruturas vegetativas. Com isso, o presente trabalho objetivou caracterizar tomateiros ‘Moneymaker’ com diferentes níveis de silenciamento de MIPS1. Para a indução do silenciamento utilizou- se tranformação genética via Agrobacterium tumefaciens contendo plasmídeo pCambia com construção tipo intron hairpin de fragmentos do gene MIPS de Glycine max (∆GmMIPS) sob controle do promotor CaMV 35S. Avaliou-se o efeito do silenciamento de MIPS1 em plantas transgênicas matrizes T0 e progênies T1 e T2 quanto ao desenvolvimento de frutos e sementes, conteúdos de ácido fítico, açúcares, pigmentos fotossintéticos, respostas fisiológicas mediante a avaliação das trocas gasosas, fluorescência da clorofila a, atividade de enzimas do estresse oxidativo e caracterização do perfil metabólico e constituintes de parede celular. Os resultados apontaram eficiência da construção transgênica na indução do silenciamento. O silenciamento ocasionou redução do conteúdo de ácido fítico em sementes, redução da quantidade de sementes por fruto e redução no desenvolvimento do fruto; redução na germinação e desenvolvimento de plântulas provindas de sementes normais nas progênies T0 e T1. O silenciamento também ocasionou alterações no conteúdo de açúcares, em folhas e sementes nas progênies T0 e T1 e reduziu a firmeza da epiderme e do pericarpo em frutos da progênie T1. Tal redução na firmeza pode estar relacionada à composição ou estrutura das paredes celulares; porém não foram identificadas reduções no conteúdo de açúcares de parede celular e celulose em pericarpos e folhas de plantas T2, mas sim acumúlo de ácidos urônicos, tanto em pericarpo quanto em folhas. Em relação ao aparato fotossintético, o silenciamento não causou alterações. O conteúdo de pigmentos fotossintéticos, parâmetros de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a foram semelhantes aos apresentados pelas plantas não transformadas, Outra evidência que o silenciamento de MIPS não causa distúrbios no corpo vegetativo foi a atividade de enzimas do estresse oxidativo que, em condições ótimas, não apresentou diferenças. As alterações encontradas no corpo vegetativo tiveram estreito envolvimento com o metabolismo de inositol, como conteúdo de açúcares (glicose-6P, glicose e sacarose) em horários de intensa atividade fotossintética. A metabolômica possibilitou uma análise mais integrativa em que ficou evidenciada a redução de alguns aminoácidos, acúmulo de açúcares e redução de açúcares alcoóis, todos estreitamente relacionados ao metabolismo de inositol em folhas. Em frutos, verificou-se influência mais expressiva da MIPS, com alterações em todas as quatro idades avaliadas (10, 15, 50 e 60 dias após a antese), tanto no pericarpo quando nas sementes. O maior número de alterações foi encontrado nas sementes, caracterizadas pela redução do conteúdo de aminoácidos, de intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA), de ácidos orgânicos e de açúcares alcoóis. Os açúcares, por sua vez, apresentaram comportamento variado, dependendo da sua relação com o metabolismo de inositol, onde a frutose e a trealose apresentam acúmulo, enquanto a glicose e a sacarose apresentam padrão mais variado em decorrência do envolvimento em uma rede mais complexa de regulação. Em pericarpos, o perfil metabólico foi respondente as variações de desenvolvimento, porém apresentando alterações no conteúdo de açúcares. Com esse estudo podemos afirmar que a construção tipo intron hairpin de fragmentos do gene MIPS de Glycine max (∆GmMIPS), sob controle do promotor CaMV 35S, ocasiona silenciamento em tomateiros e as plantas silenciadas tiveram o conteúdo de metabólitos influenciados pelo conteúdo de mio-inositol ou expressão da MIPS alterado, tanto na parte vegetativa quanto na reprodutiva. Registra-se, também, que o silenciamento de MIPS não foi capaz de alterar a atividade fotossintética ou causar direta ou indiretamente estresse oxidativo no corpo vegetativo em plantas MIPS silenciadas. / Myo-inositol phosphate synthase (MIPS1) (E.C.5.5.1.4) catalyzes the irreversible conversion of D-Glucose-6-P to 1-L-myo-inositol-1-P. Myo-inositol plays an important role in plant metabolism, providing inositides and inositol for essential metabolic processes in the formation of the vegetative and reproductive plant body. Among the pathways in which the myo-inositol is closely involved, some are target of plant breeding, such as genetic manipulation of phytic acid and oligosaccharides contents in seeds and structural sugars in the cell wall. To date, MIPS silenced plants have not been characterized in detail, especially in their vegetative structures. Thus, the present study aimed to characterize tomato 'Moneymaker' with different levels of silencing MIPS1. For induction of gene silencing was used transformation via Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pCambia with construct intron-hairpin-RNA type whith MIPS gene fragments of Glycine max (ΔGmMIPS) under control of the CaMV 35S. The effect of MIPS1 silencing in primary transgenic plants T0 and T1 and T2 progenies was evaluated for the development of fruit and seeds, phytic acid and sugar contents, photosynthetic pigments, physiological responses by evaluating gas exchange, chlorophyll a fluorescence, oxidative stress enzyme activity, metabolic profile characterization and cell wall constituents. The results showed the efficiency of the transgenic construct to induce silencing. The silencing resulted in reduction of phytic acid content in seeds, reducing the amount of seeds and a reduction in fruit development, reduction in germination and seedling development stemmed from normal seeds in T0 and T1 progeny. The silencing also induced changes in the content of sugars in leaves and seeds in T0 and T1 progeny and reduced firmness of the epidermis and pericarp in fruits of T1 progeny. This decrease in firmness may be related to the composition or structure of cell walls, but no reductions were identified in the content of sugars and cellulose in cell wall pericarp and leaves of T2 plants, but accumulation of uronic acids, both in pericarp as sheets. In relation to the photosynthetic apparatus, silencing caused no changes. The content of photosynthetic pigments, gas exchange parameters and chlorophyll fluorescence were similar to those presented by the non- transformed plants, Further evidence that silencing of MIPS does not cause disturbances in the vegetative body was the activity of enzymes of the oxidative stress that in optimal conditions, showed no differences. However, the changes found in the vegetative body had close involvement with the metabolism of inositol, as content of sugars (glucose- 6P, glucose and sucrose) in times of intense photosynthetic activity. The metabolomics allowed a more integrative analysis in which there is an evident reduction of some amino acids, accumulation of sugars and sugar alcohols reduction, all closely related to the metabolism of inositol sheets. In fruits, there was more significant influence of MIPS, with changes in all four ages evaluated (10, 15, 50 and 60 days after anthesis), both when the seed pericarp. The largest number of changes were found in the seeds, characterized by the reduction of the content of amino acids, intermediates of the citric acid cycle (TCA), organic acids and sugar alcohols. Sugars, in turn, showed varied behavior depending on their relationship with the metabolism of inositol, where fructose and trehalose accumulation feature, while glucose and sucrose have more varied pattern as a result of being involved in a more complex regulatory network. In pericarp, the metabolic profile was respondent variations in development, but with alterations in sugar content. With this study we can see that the construction type intron hairpin fragment of MIPS Glycine max (ΔGmMIPS) gene under control of the CaMV 35S promoter, causes silencing in tomato plants were silenced and content of metabolites influenced the content of myo-inositol or altered expression of MIPS, both in vegetative and in reproductive part. Join also the silencing of MIPS was not able to change the photosynthetic activity or directly or indirectly cause oxidative stress in the vegetative body MIPS-silenced plants.

Âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) são estruturas essenciais para a ancoragem de glicoconjugados e proteínas na superfície celular de protozoários. Trypanosoma cruzi produz uma gama de estruturas únicas de GPI, as quais ancoram mucinas e trans-sialidases, que participam de processos envolvidos na interação entre parasita e hospedeiro. Afim de estudar a biossíntese de âncora de GPI de T. cruzi e possivelmente utilizá-la como um potencial alvo anti-T.cruzi, este trabalho visa sintetizar análogos de âncoras de GPI e analisar o potencial destas moléculas como substratos da via biossintética de GPIs. Neste contexto, um pseudo-dissacarídeo 31 foi sintetizado através de O-glicosilação entre os doadores derivados de azido-glicopiranosídeo (32 ou 33a-d) e o acceptor de mio-inositol (34), preparados a partir de cloridrato de glucosamina (35) e metil-?-D-glucopiranósido (36), respectivamente, usando proteção/desproteção ortogonais. Cinco diferentes dadores de glicosídicos (32 e 33a-d) foram preparados para investigar a influcia dos seus grupos protetores na estereoselectividade da reações de O-glicosilação na presença de diferentes solventes para estudar o favorecimento da configuração ?, presente em GPIs. Ademais, a síntese do aceptor de mio-inositol 34 foi realizada em 12 etapas pela estratégia do rearranjo Ferrier para formar um derivado de ciclitol, além de diversas proteções/desproteções, funcionalizado que permite a introdução regiosselectiva da unidade de azido glicose (32-33a-d) e uma porção de fosfolípido no seu C-1 e posições C-6, respectivamente. Assim, O-glicosilação entre doador 33c e o acceptor 34, foi realizada utilizando TMSOTf como promotor para originar o composto 31c com boa estereoseletividade para ?, com elevado rendimento (~70%). Após a dealilação de 31c, a porção fosfodiéster contendo uma cadeia C-8 (87), preparada pela abordagem do H-fosfonato, foi anexada ao pseudo-dissacarídeo para gerar, após desprotecção global, o composto alvo 30a. A mesma estratégia sintética foi aplicada ao preparo do composto 91 contendo uma cadeia lateral alquil-naftil (90) que está em últmas etapas de desproteção para gerar o composto final 30c. Atualmente, o composto 30a está sendo testado como substrato da biossíntese de âncoras de GPI em membranas microssomais de Euglena gracilis, uma alga unicelular não patogênica, que pode potencialmente ser utilizada como modelo para parasitas humanos filogeneticamente relacionados. Após a incubação do potencial substrato de GPI 30a com membranas microssomais de E. gracilis para geração de metabólitos, será realizada análise do extrato por LC-MS e, eventualmente, isolamento dos produtos formados para posterior caracterização. Os produtos que apresentarem atividade como substrato ou como inibidores da biossíntese de GPI em E. gracilis serão também ensaiados na membrana microsomal do T. cruzi. / Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors are essential molecules to attach glycoconjugates and proteins in protozoan\'s cell surface. Trypanosoma cruzi produces a range of unique GPI structures that anchor mucins and trans-sialidases which participate in important processes involved in the interaction between parasite and host. As an effort to study T. cruzi GPI anchor biosynthesis and possibly use it as a potential target for an antichagasic drug, this work aims to synthesize GPI anchor analogs (labelled or not) and analyze the potential of these molecules as substrates in the GPI biosynthetic pathway. In this context, a pseudo-disaccharide 31 was synthesized by O-glycosylation reaction between azide glycosyl donors (32 or 33a-d) and myo-inositol acceptor (34), prepared from glucosamine (35) hydrochloride and methyl ?-D-glucopyranoside (36), respectively, using orthogonal protection/ deprotection. Five different glycosyl donors (32 and 33a-d) were prepared to investigate the influence of their protective groups on the stereoselectivity of the O-glycosylation reaction in the presence of different solvents to afford the required GPI ?-linkage. In addition, the synthesis of the myo-inositol acceptor 34 was achieved using several protection/deprotection steps, besides the Ferrier rearrangement, to form a functionalized cyclitol derivative that enables the regioselective introduction of the azide glycoside unit and phospholipid moiety on its C-1 and C-6 positions, respectively. Then, O-glycosylation of acceptor 34 with donor 33c was accomplished in diethyl ether, using TMSOTf as promoter to give exclusively ?-anomer 31c in high yield. After deallylation of 31c, the phosphodiester moiety bearing an octyl chain (87), prepared by the H-phosphonate approach, was appended to the pseudo-disaccharide to yield, after deprotection, target compounds 30a. The same synthetic strategy was applied to the preparation of 30c, even though in the protective form, compound 91 bearing an alkyl-naphthyl side chain (90). Currently, compound 30a is being tested as substrates of GPI anchor biosynthesis in Euglena gracilis cell membranes, a non-pathogenic unicellular algae, which may potentially be used as a model for phylogenetically related human parasites. After incubation of the potential GPI substrate 30a with E. gracilis microsomal membranes for generation of metabolites, the analysis by LC-MS and, eventually, isolation of the products will be performed for further characterization. Products that show any substrate or inhibitory activities will be also assayed in T. cruzi microsomal membrane.

Los productos de cereales con grano entero, en particular el pan, son fuentes de fibra dietética, vitaminas, minerales y compuestos fitoquímicos. Sin embargo, la biodisponibilidad de los minerales se afecta principalmente debido a la presencia de fitatos que reducen su absorción. El fitato se encuentra principalmente en los alimentos no procesados, pero puede ser degradado durante la germinación de las semillas o el procesado de alimentos. La hidrólisis del fitato a fosfatos de mio-inositol de menor grado de fosforilación es una manera de reducir su efecto negativo sobre la absorción de minerales. Muchas investigaciones han intentado reducir la cantidad de fitatos en los alimentos mediante diferentes procesos o adición de fitasas exógenas. El objetivo principal de esta investigación fue incrementar el valor nutricional de los productos derivados de cereales a través de nuevas estrategias para la elaboración de productos de panadería de alta calidad, proporcionando más fibra dietética y una mayor biodisponibilidad de minerales. La inclusión de salvado de trigo en diferentes niveles y tamaño de partícula, con ?-amilasa y fitasa; el uso de bifidobacterias productoras de fitasa como nuevos iniciadores panarios; y la utilización de harina integral de amaranto como ingrediente nutritivo en panificación, fueron las estrategias propuestas para alcanzar el objetivo principal. Se evaluó la calidad nutricional, tecnológica y sensorial de los productos desarrollados. Asimismo, se estudió el efecto de la formulación en la relación molar fitato/mineral, la dializabilidad del hierro y la biosíntesis de ferritina en células Caco-2 como una medida de la absorción de este mineral. El salvado de trigo, en combinación con enzimas amilolíticas y fitasa, disminuyó el efecto negativo en la reología del producto y mejoró la hidrólisis de los fitatos. El uso de bifidobacterias productoras de fitasa (GRAS/PQS), tanto en proceso directo como indirecto, produjo panes con características tecnológicas y sensoriales similares a los controles, pero con una cantidad menor de fitatos. Se consiguió una proporción de compromiso de harina de amaranto en la formulación de pan para preservar la calidad del producto e incrementar su valor nutricional. / Sanz Penella, JM. (2012). NUEVAS ESTRATEGIAS PARA INCREMENTAR LA CALIDAD NUTRICIONAL DE PRODUCTOS DE PANADERÍA. EFECTO SOBRE EL CONTENIDO DE FITATOS Y LA BIODISPONIBILIDAD DE HIERRO EN CACO-2 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15151 / Palancia

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2100606 bytes, checksum: 5e91a2b8b12b7ee39c9e424e7736aa78 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The main objectives in this work were: i) to find the optimum conditions to disinfect tomato seeds (Solanum lycopersicum Mill.) and eggplant seeds (Solanum melongena L.); ii) to evaluate the influence of the type of sealing in the obtained seedlings and explants; iii) to evaluate the effect of sonication in the morphogenesis in vitro of the tomato explants and in the viability of Agrobacterium tumefaciens cells; iv) to establish the parameters that allow the genetic transformation mediate by A. tumefaciens aiming the genetic silencing mediate by RNAi from myo-inositol-phosphate synthase, using the GmMPIS1 gene. It was checked that the use of deionized water was more efficient to disinfect eggplant seeds than 0.13% v/v chlorine solution. The use of dry disinfection in chlorine cameras is not appropriate to clean the tomato and eggplant seeds due to the gas toxicity and that it also compromises their germination. It was observed that gas exchange helps the seedlings development and leads to a bigger number of explants and with better quality to be used in the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Using the SAAT technique (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation), the explants and the bacteria suspensions were exposed to ultrasound for 0, 3, 6 and 9 seconds. It was verified that the immersion time from 3 to 6 seconds was appropriate to be used in genetic transformation, since it shown the biggest transient expression areas evaluated by in situ histochemical analysis of the GUS gene, the biggest number of regenerated structures and less mortality in the A. tumefaciens cells. The process was optimized when the immersion of the A. tumefaciens suspension was made 24 hours after the exposition to ultrasound. To make possible to select the transformed plants it was established the dependence of the hygromycin agent lethality and the found concentration of the non-transformed selected cells was 7.5 mg.L-1 in cotyledonary hipocotyledonary and leaf tomato explants. It was found that concentrations above this value were toxic, showing chlorotic and necrotic areas in the explants. A genetic transformation in tomato and eggplant plants was successfully made to check the relation between the MIPS gene and the seeds development by A. tumefaciens containing plasmids with silencing construction by siRNA to the MIPS gene using a conserved sequence of the soy gene GmMIPS. The transgenic nature of the primary regenerators was confirmed by in situ histochemical tests of GUS and by PCR analysis with specific oligonucleotides initiators. The analysis of the genetic expression confirmed the MIPS gene silencing and the morphologic analysis of the fruits confirmed the hypothesis of the relationship between the myo-inositol- phosphate synthase and the seeds development. However, as shown by flow-citometry technique, the process of regeneration in vitro used in the tomato plants transformation protocol changed some transgenic plants to polypoids. This was not observed in eggplant plants. / Este trabalho teve como objetivo: i) a otimização das condições de desinfestação de seentes de tomateiros (Solanum lycopersicum Mill.) e berinjela (Solanum melongena L.); ii) a avaliação da influência do tipo de vedação sobre a qualidade das plântulas e explantes oriundos destas; iii) a avaliação do efeito da sonicação sobre a morfogênese in vitro de explantes de tomateiros e sobre a viabilidade de células de Agrobacterium tumefaciens; iv) o estabelecimento de parâmetros para possibilitar a transformação genética mediada por A. tumefaciens visando ao silenciamento gênico mediado por RNAi da sintase do mio-inositol-fosfato, utilizando-se o gene GmMIPS1. Na desinfestação das sementes de berinjela, comprovou-se que tratamentos utilizando imersão em água deionizada são mais eficientes que imersão em solução de 0,13% v/v de cloro. A utilização de desinfestação a seco, em câmara de gás cloro, não é indicada para a assepsia de sementes de tomate e berinjela, pela toxicidade do gás às sementes, comprometendo sua germinação. Observou-se que as trocas gasosas favorecem o desenvolvimento das plântulas e geram explantes em maior número e de melhor qualidade para utilização de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Ao se utilizar a técnica de SAAT ( Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ), os explantes e a suspensão bacteriana foram expostos a tempos de exposição ao ultra-som (0, 3, 6 e 9 segundos). Verificou-se que o intervalo de 3 a 6 segundos é o indicado para se utilizar em transformação genética, pois resultou nas maiores áreas de expressão transiente avaliada pela análise histoquímica in situ do gene GUS, maior número de estruturas regeneradas e menor mortalidade nas células de A. tumefaciens. O processo foi otimizado quando a imersão em suspensão de A. tumefaciens foi realizado após 24 horas de exposição ao ultra-som. Para ser possível a seleção de transformantes foi estabelecida a curva de letalidade ao agente higromicina e a concentração encontrada para seleção de células não transformadas foi de 7,5 mg.L-1 em explantes cotiledonares, hipocotiledonares e foliares de tomateiro. Dosagens acima de 7,5 mg.L-1 mostratam-se tóxicas, resultando em explantes com áreas cloróticas e necróticas. A fim de verificar a relação do gene MIPS com o desenvolvimento de sementes, a transformação genética foi realizada com sucesso em tomateiro e berinjela, via A. tumefaciens contendo plasmídeo com construção de silenciamento por siRNA para o gene MIPS, utilizando uma seqüência conservada do gene de soja GmMIPS. A natureza transgênica dos regenerantes primários foi confirmada mediante o teste histoquímico in situ de GUS e análise de PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. A análise de expresão gênica confirmou o silenciamento do gene MIPS, e a análise morfológica dos frutos confirmou a hipótese do relacionamento da mio-inositol-fosfato-sintase com o desenvolvimento de sementes. Porém, conforme detectado pela técnica de citometria de fluxo, o processo de regeneração in vitro adotado no protocolo de transformação de tomateiro, ao contrário de berinjela, induziu poliploidia em algumas plantas transgênicas.