Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T03:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294811.pdf: 4760452 bytes, checksum: fa236ca094f2d6addc744e0ad2b1cb85 (MD5) / A absorção oral de um fármaco é controlada fundamentalmente por dois fatores: a solubilidade aquosa/dissolução e a permeabilidade intestinal. Portanto, a determinação dessas características ainda nas fases de descoberta e desenvolvimento de fármacos pode prover moléculas com ótimo perfil biofarmacêutico. Nesse sentido, esta tese teve dois objetivos: implementar e validar o modelo de avaliação da permeabilidade in vitro com células Caco-2 no Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC, e aplicar esse modelo na determinação da permeabilidade de fármacos e compostos em estudo. Na implementação do modelo Caco-2 foi demonstrada a adequação morfológica das células, através do monitoramento da resistência elétrica transepitelial e da permeabilidade do Lucifer yellow. Através da avaliação da permeabilidade de fármacos marcadores (aciclovir, carbamazepina, hidroclorotiazida, propranolol, vimblastina e verapamil) em experimentos de transporte bi-direcional foi demonstrado que o modelo foi devidamente validado, já que foi estabelecida correlação entre a permeabilidade in vitro e a absorção em humanos. Adicionalmente, uma metodologia por CLAE-UV foi desenvolvida e validada para a determinação concomitante de todos esses fármacos marcadores. Na segunda etapa, avaliou-se o complexo talidomida:hidroxipropil-?-ciclodextrina, desenvolvido e caracterizado no estado sólido por diferentes técnicas, que comprovaram a complexação do fármaco e a redução da sua cristalinidade. Essas alterações culminaram em um leve aumento da solubilidade aparente do fármaco, bem como propiciaram um perfil de dissolução superior, quando comparado ao da talidomida isolada. No entanto, nenhuma alteração na permeabilidade foi detectada. Esses resultados sugerem que esta complexação poderia aumentar a biodisponibilidade oral da talidomida, através do aumento da sua solubilidade nos fluídos gastrointestinais, bem como facilitando a sua dissolução a partir de uma forma farmacêutica sólida. Também foi avaliado o composto anti-herpético galato de pentila, e foi demonstrado que ele apresenta perfis de permeabilidade intestinal e cutânea favoráveis para sua absorção oral e permeação tópica, respectivamente. Assim, após administração oral, sua biodisponibilidade não seria limitada pela permeabilidade intestinal, e no que se refere à administração tópica, ele ficaria restrito às camadas da pele no local de aplicação. Esses dados fornecem informações valiosas para o desenvolvimento de formas farmacêuticas e para a avaliação da atividade antiviral in vivo. Em suma, o modelo com células Caco-2 foi implementado, validado e aplicado satisfatoriamente, o que permitirá a execução de estudos colaborativos, sobretudo com o enfoque do Sistema de Classificação Biofarmacêutica.

Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-10T12:41:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-11T18:47:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-14T11:25:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-14T13:50:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-21T12:31:27Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Approved for entry into archive by Vivian Rosa Storti null (vstorti@reitoria.unesp.br) on 2018-01-05T13:00:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 boni_fi_me_arafcf.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-05T13:00:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 boni_fi_me_arafcf.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) Previous issue date: 2017-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A nanotecnologia farmacêutica é uma relevante ferramenta tecnológica para o desenvolvimento de novos sistemas para a veiculação de fármacos, pois devido às suas dimensões reduzidas são capazes de circular por capilares que irrigam os tecidos, escapar da fagocitose por células do sistema imunológico e permear passivamente células e epitélios. Além disso, esses sistemas possibilitam a encapsulação de fármacos de baixa estabilidade, protegendo-os contra degradação prematura e/ou permitindo a modulação de suas propriedades físico-químicas, bem como a interação biológica na biointerface. O metotrexato (MTX) é um dos fármacos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos e doenças inflamatórias intestinais, no entanto, por ser altamente citotóxico e não seletivo promove diversos efeitos colaterais. Sua eficácia terapêutica é comprometida devido à resistência adquirida pelas células tumorais e por sua baixa permeabilidade intestinal, principalmente por meio do mecanismo de efluxo da forma livre. Nesse trabalho, nanopartículas poliméricas (NPs) orais compostas por quitosana (QS), ácido hialurônico (AH) e ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HP), polímeros que possuem propriedades como solubilidade pH dependente, mucoadesividade e de funcionalização, foram desenvolvidas como plataforma tecnológica para a vetorização do MTX para o cólon, visando o tratamento local de patologias intestinais. As análises de peso molecular e coeficiente viral demostraram a adequação dos polímeros e solventes para a obtenção das nanoestruturas pelo método de complexação polieletrolítica. A avaliação da influência do pH no potencial zeta dos polímeros permitiu a seleção do valor ótimo (pH 5,5) para obtenção das nanoestruturas. O diâmetro médio das NPs sem fármaco, contendo ou não HP variou de 451,73-574,95 nm e a incorporação do MTX reduziu significativamente esses valores para a faixa de 216,83-345,03 nm (p<0,05). A adição do HP, bem como do MTX promoveu a redução do potencial zeta das NPs (p<0,05). O índice de polidispersão das NPs contendo ou não MTX variou de 0,21-0,39 a 0,26-0,33, respectivamente, indicando a homogeneidade de tamanho. A forma esférica das partículas foi também foi demonstrada. Os espectros de absorção na região IV indicaram a formação dos complexos polieletrolíticos e as análises de DRX a formação de estruturas cristalinas. A eficiência de incorporação do MTX variou de 20,06% a 36,18%, sendo as NHP0,5-1 e NHP0,2-5 as que apresentaram as maiores porcentagens (32,21% e 36,18%, respectivamente). Embora o MTX tenha promovido a redução dos valores de mucoadesão (p<0,05), a elevada mucoadesividade (71,22% a 91,53%) de todas as NPs foi evidenciada. De acordo com as isotermas de adsorção, os dados de interação com a mucina apresentaram correlação com o modelo de Freundlich, que indica a adsorção reversível em multicamadas. Em pH 6,8, a interação da mucina com as NPs promoveu a redução do potencial zeta, o que pode estar relacionado a maior capacidade de adsorção nesse valor de pH. A incorporação do MTX nas NPs permitiu a redução da liberação em meio ácido em até 40%, em relação ao fármaco livre, enquanto a adição de HP à matriz das NPs reduziu a liberação em até 10%, neste pH. O mecanismo de liberação do fármaco foi avaliado por diferentes modelos matemáticos. A viabilidade nas linhagens Caco-2 e HT29-MTX para os polímeros e NPs (0,01 - 1 μg.mL-1) foi demonstrada. Para as NPs contendo MTX, nas concentrações de 10 μg.mL-1 e 100 μg.mL- 1, a viabilidade na linhagem Caco-2 após 24 h de incubação foi de aproximadamente 50%. Nos estudos de permeabilidade in vitro, as NPs sem adição de HP permearam aproximadamente 3 vezes mais as monocamadas de Caco-2 e de co-cultura tripla de células, em comparação às amostras contendo HP e ao fármaco livre. A maior associação celular para o fármaco incorporado às NPs, em comparação ao MTX livre, demonstrou a capacidade do sistema em modular a interação biológica. / The pharmaceutical nanotechnology is a relevant technological tool for the development of new drug delivery systems, because of their small size they are able to circulate through capillaries that irrigate tissues, escape from phagocytosis by the immune system cells and passively permeate cells and epithelia. In addition, these systems enable the encapsulation of low stability drugs, protecting them against premature degradation and/or allowing the modulation of their physico-chemical properties, as well as the biological interaction in the biointerface. Methotrexate (MTX) is one of the most used drug in the treatment of solid tumors and inflammatory bowel diseases, however, because MTX highly cytotoxic and nonselectivity promotes several side effects. Its therapeutic efficacy is compromised due to the resistance acquired by tumor cells and it low intestinal permeability, mainly through the efflux mechanism of the free form. In this work, oral nanoparticles composed of chitosan (CS), hyaluronic acid (HA) and hydroxypropylmethylcellulose (HP) phthalate, polymers that have properties such as pH-dependent solubility, mucoadhesiveness and functionalization have been developed as a technological platform for the target of MTX to the colon, aiming the treatment of local pathologies. Molecular weight and second viral coefficient analyzes demonstrated the suitability of polymers and solvents to obtain nanostructures by the polyelectrolyte complexation method. The evaluation of the pH influence on the zeta potential of the polymers allowed to the selection of the optimum value (pH 5.5) to obtain the nanostructures. The mean diameter of the MTX free nanoparticles, containing or not HP ranged from 451.73-574.95 nm and the incorporation of MTX significantly reduced these values for the range of 216.83-345.03 nm (p <0.05). The addition of HP as well as MTX promoted reduction of zeta potential of nanoparticles (p <0.05). The polydispersity index of the nanoparticles containing or not MTX ranged from 0.21-0.39 to 0.26-0.33, respectively, indicating homogeneity of size. The spherical shape of the particles has been demonstrated. The absorption spectra in the IV region indicated the formation of the polyelectrolyte complexes and the DRX analyzes, the formation of crystalline structures. The efficiency of drug incorporation ranged from 20.06% to 36.18%, with the NHP0.5-1 and NHP0.2-5 samples having the highest percentages (32.21% and 36.18%, respectively). Although MTX promoted the reduction of mucoadhesion values (p<0.05), the high mucoadhesiveness (71.22% to 91.53%) of all nanoparticles was evidenced. According to the adsorption isotherms, the interaction data with the mucin presented a correlation with the Freundlich model, which indicates the reversible adsorption in multilayers. At pH 6.8, the interaction of mucin with the nanoparticles promoted the reduction of the zeta potential, which may be related to the higher adsorption capacity at this pH value. The incorporation of MTX in the nanoparticles allowed to the reduction of MTX release in acidic media by up to 40% in relation to the free drug and the addition of HP to the nanoparticle matrix reduced the release by up to 10% at pH 1.2. The mechanism of drug release was evaluated by different mathematical models. The viability of Caco-2 and HT29-MTX lines for polymers and NPs (0.01-1 μg.mL-1) was demonstrated. For nanoparticles containing MTX, at concentrations of 10 μg.mL-1 and 100 μg.mL-1 , the viability of Caco-2 after 24 h incubation was approximately 50%. In the in vitro permeability studies, samples without HP permeated approximately 3- fold more monolayers of Caco-2 and triple co-culture compared to samples containing HP and the free drug. The higher cellular association for the drug incorporated into the nanoparticles, compared to free MTX, demonstrated the ability of the system to modulate the biological interaction / FAPESP: 2015/21176-5 / FAPESP BEPE: 2016/20360-0

A deficiência de vitamina A é um problema global de saúde pública que afeta especialmente crianças com menos de 5 anos, mulheres durante o parto e 1 ano pós-parto e é a principal causa de cegueira evitável em crianças. Biofortificação é uma estratégia que visa reduzir as deficiências de micronutrientes em populações vulneráveis ao redor do mundo através do aumento da concentração de nutrientes nos alimentos básicos. Investigou-se os efeitos de genótipos e estilos de cocção sobre o conteúdo, retenção e biodisponibilidade de ?-caroteno (?C) em mandiocas biofortificadas e batatas-doces de polpa laranja (BDPL). Cinco genótipos de mandioca biofortificada, três acessos parentais, e uma mandioca branca foram fornecidos por dois programas de melhoramento. Adicionalmente, foram avaliados dois genótipos de BDPL e duas marcas de alimentos infantis. Tanto as raízes de mandioca quanto de batatas-doces foram analisadas cruas, cozidas em água a 100°C, e fritas em óleo de soja a 180°C após cozimento. Os carotenoides foram extraídos e analisados por HPLC-DAD. A biodisponibilidade foi determinada utilizando a digestão oral, gástrica e duodenal in vitro e absorção por culturas celulares Caco-2. Somente o ?C foi detectado em todos os genótipos de mandioca, embora os teores tenham variado significativamente dependendo do genótipo. As mandiocas melhoradas continham pelo menos 10 vezes mais ?C do que a branca. O cozimento e a fritura foram associados com a perda e isomerização de ?C na mandioca bem como na BDPL. Houve interação significativa entre genótipo e processamento nos perfis e teores de ?C. Eficiência de micelarização do trans-?C nas mandiocas cozidas foi menor do que nas fritas. As mandiocas biofortificadas prontas para consumo podem fornecer até 28% da IDR de retinol. A absorção pelas células Caco-2 do trans-?C foi analisada em quatro genótipos. Dois deles não foram afetados pela cocção em relação à absorção celular, no entanto, os outros dois genótipos apresentaram aumento com a fritura. Com relação às batatas-doces, o trans-?C foi o principal carotenoide encontrado, embora também tenham sido identificados três isómeros do ?C e ?-caroteno em quantidades menores. O teor do trans-?C em um dos genótipos de BDPL foi duas vezes maior do que nos alimentos infantis. Nos alimentos infantis foi encontrada presença relativa de 13-cis-?C maior do que nas BDPLs. A eficiência de micelarização de trans-?C das batatas-doces foi considerada baixa, e não teve diferença com os processamentos. A absorção por Caco-2 não foi diferente para os genótipos de BDPL e alimentos infantis investigados. A quantidade intracelular acumulada de trans-?C foi proporcional à concentração do material inicial. Em resumo, as culturas biofortificadas estudadas podem aumentar a concentração de ?C na dieta. A mandioca frita apresenta mais ?C biodisponível do que ela cozida. Tanto o genótipo da mandioca quanto o tipo de processamento influenciam a absorção de trans-?C. Por outro lado, não foram encontradas evidências de que a redução de partículas, utilizada no alimento infantil, ofereça maior biodisponibilidade de beta-caroteno das BDPLs / Vitamin A deficiency is a world public health problem that affects especially infants, children less than 5 years of age, women during birthing and 1 year post-partum and is the primary cause of avoidable blindness in children. Biofortification is a strategy aimed at decreasing global micronutrient deficiencies in vulnerable populations by increasing the nutrient density in staple food crops. It was investigated the effects of genotype and cooking styles on the content, retention and bioavailability of ?-carotene (?C) in biofortified cassava and orange fleshed sweet-potatoes (OFSP). Five genotypes of biofortified cassava, three parental accessions, and one white cassava were provided by two different breeding programs. Additionally, two genotypes of OFSP and two brands of high processed baby foods were evaluated. Both cassava and OFSP roots were analyzed raw, after boiling in water at 100°C only or after subsequent frying in soybean oil at 180°C. Carotenoids were extracted and analyzed by HPLC-DAD. Bioavailability was assessed using an in vitro oral, gastric and small intestinal digestion coupled with the Caco-2 human intestinal cell model. Only ?C was detected in all tested genotypes of cassava root, although its content varied markedly depending on genotype. Biofortified genotypes contained at least 10-fold higher ?C than the white variety. Boiling and frying were associated with loss and isomerization of ?C in cassava as well as OFSP. There was an interaction of genotype and cooking style on profile of ?C contents. Efficiency of micellarization of trans-?C in boiled cassava was lower than in fried. Biofortified cassava ready to eat can provide up to 28% of the IDR of retinol. Uptake of trans-?C in micelles generated during digestion by Caco-2 cells was analyzed for the four of the five biofortified genotypes. Cell uptake of ?C from two genotypes were not affected by processing, however the other two genotypes had increased with frying. Regarding sweet-potatoes, trans-?C was the major carotenoid found, although it was identified three ?C isomers and ?-carotene in minimal quantities. The concentration of trans-?C in one genotype of OFSP was two times higher than baby foods and the other genotype. Baby foods had relative presence of the 13-cis-?C higher than in the OFSP. Efficiency of micellarization of trans-?C from cooked OFSP or Baby foods was considered low, and had no statistic differences between boiling and frying. The Caco-2 cells uptake were not different for the genotypes and baby foods investigated. The absolute amount of accumulated trans-?C intracellular was proportional to the concentration of the starting material. In summary, biofortified crops can increase ?C contents in diet. Fried cassava presents more bioavailable ?C than boiled. Cassava genotype and cooking style may influence uptake of trans-?C by absorptive intestinal cells. In contrast, there is no evidence that high processed OFSP has more bioavailability of ?C than homemade boiled or fried OFSP

A deficiência de vitamina A é um problema global de saúde pública que afeta especialmente crianças com menos de 5 anos, mulheres durante o parto e 1 ano pós-parto e é a principal causa de cegueira evitável em crianças. Biofortificação é uma estratégia que visa reduzir as deficiências de micronutrientes em populações vulneráveis ao redor do mundo através do aumento da concentração de nutrientes nos alimentos básicos. Investigou-se os efeitos de genótipos e estilos de cocção sobre o conteúdo, retenção e biodisponibilidade de ?-caroteno (?C) em mandiocas biofortificadas e batatas-doces de polpa laranja (BDPL). Cinco genótipos de mandioca biofortificada, três acessos parentais, e uma mandioca branca foram fornecidos por dois programas de melhoramento. Adicionalmente, foram avaliados dois genótipos de BDPL e duas marcas de alimentos infantis. Tanto as raízes de mandioca quanto de batatas-doces foram analisadas cruas, cozidas em água a 100°C, e fritas em óleo de soja a 180°C após cozimento. Os carotenoides foram extraídos e analisados por HPLC-DAD. A biodisponibilidade foi determinada utilizando a digestão oral, gástrica e duodenal in vitro e absorção por culturas celulares Caco-2. Somente o ?C foi detectado em todos os genótipos de mandioca, embora os teores tenham variado significativamente dependendo do genótipo. As mandiocas melhoradas continham pelo menos 10 vezes mais ?C do que a branca. O cozimento e a fritura foram associados com a perda e isomerização de ?C na mandioca bem como na BDPL. Houve interação significativa entre genótipo e processamento nos perfis e teores de ?C. Eficiência de micelarização do trans-?C nas mandiocas cozidas foi menor do que nas fritas. As mandiocas biofortificadas prontas para consumo podem fornecer até 28% da IDR de retinol. A absorção pelas células Caco-2 do trans-?C foi analisada em quatro genótipos. Dois deles não foram afetados pela cocção em relação à absorção celular, no entanto, os outros dois genótipos apresentaram aumento com a fritura. Com relação às batatas-doces, o trans-?C foi o principal carotenoide encontrado, embora também tenham sido identificados três isómeros do ?C e ?-caroteno em quantidades menores. O teor do trans-?C em um dos genótipos de BDPL foi duas vezes maior do que nos alimentos infantis. Nos alimentos infantis foi encontrada presença relativa de 13-cis-?C maior do que nas BDPLs. A eficiência de micelarização de trans-?C das batatas-doces foi considerada baixa, e não teve diferença com os processamentos. A absorção por Caco-2 não foi diferente para os genótipos de BDPL e alimentos infantis investigados. A quantidade intracelular acumulada de trans-?C foi proporcional à concentração do material inicial. Em resumo, as culturas biofortificadas estudadas podem aumentar a concentração de ?C na dieta. A mandioca frita apresenta mais ?C biodisponível do que ela cozida. Tanto o genótipo da mandioca quanto o tipo de processamento influenciam a absorção de trans-?C. Por outro lado, não foram encontradas evidências de que a redução de partículas, utilizada no alimento infantil, ofereça maior biodisponibilidade de beta-caroteno das BDPLs / Vitamin A deficiency is a world public health problem that affects especially infants, children less than 5 years of age, women during birthing and 1 year post-partum and is the primary cause of avoidable blindness in children. Biofortification is a strategy aimed at decreasing global micronutrient deficiencies in vulnerable populations by increasing the nutrient density in staple food crops. It was investigated the effects of genotype and cooking styles on the content, retention and bioavailability of ?-carotene (?C) in biofortified cassava and orange fleshed sweet-potatoes (OFSP). Five genotypes of biofortified cassava, three parental accessions, and one white cassava were provided by two different breeding programs. Additionally, two genotypes of OFSP and two brands of high processed baby foods were evaluated. Both cassava and OFSP roots were analyzed raw, after boiling in water at 100°C only or after subsequent frying in soybean oil at 180°C. Carotenoids were extracted and analyzed by HPLC-DAD. Bioavailability was assessed using an in vitro oral, gastric and small intestinal digestion coupled with the Caco-2 human intestinal cell model. Only ?C was detected in all tested genotypes of cassava root, although its content varied markedly depending on genotype. Biofortified genotypes contained at least 10-fold higher ?C than the white variety. Boiling and frying were associated with loss and isomerization of ?C in cassava as well as OFSP. There was an interaction of genotype and cooking style on profile of ?C contents. Efficiency of micellarization of trans-?C in boiled cassava was lower than in fried. Biofortified cassava ready to eat can provide up to 28% of the IDR of retinol. Uptake of trans-?C in micelles generated during digestion by Caco-2 cells was analyzed for the four of the five biofortified genotypes. Cell uptake of ?C from two genotypes were not affected by processing, however the other two genotypes had increased with frying. Regarding sweet-potatoes, trans-?C was the major carotenoid found, although it was identified three ?C isomers and ?-carotene in minimal quantities. The concentration of trans-?C in one genotype of OFSP was two times higher than baby foods and the other genotype. Baby foods had relative presence of the 13-cis-?C higher than in the OFSP. Efficiency of micellarization of trans-?C from cooked OFSP or Baby foods was considered low, and had no statistic differences between boiling and frying. The Caco-2 cells uptake were not different for the genotypes and baby foods investigated. The absolute amount of accumulated trans-?C intracellular was proportional to the concentration of the starting material. In summary, biofortified crops can increase ?C contents in diet. Fried cassava presents more bioavailable ?C than boiled. Cassava genotype and cooking style may influence uptake of trans-?C by absorptive intestinal cells. In contrast, there is no evidence that high processed OFSP has more bioavailability of ?C than homemade boiled or fried OFSP

Los productos de cereales con grano entero, en particular el pan, son fuentes de fibra dietética, vitaminas, minerales y compuestos fitoquímicos. Sin embargo, la biodisponibilidad de los minerales se afecta principalmente debido a la presencia de fitatos que reducen su absorción. El fitato se encuentra principalmente en los alimentos no procesados, pero puede ser degradado durante la germinación de las semillas o el procesado de alimentos. La hidrólisis del fitato a fosfatos de mio-inositol de menor grado de fosforilación es una manera de reducir su efecto negativo sobre la absorción de minerales. Muchas investigaciones han intentado reducir la cantidad de fitatos en los alimentos mediante diferentes procesos o adición de fitasas exógenas. El objetivo principal de esta investigación fue incrementar el valor nutricional de los productos derivados de cereales a través de nuevas estrategias para la elaboración de productos de panadería de alta calidad, proporcionando más fibra dietética y una mayor biodisponibilidad de minerales. La inclusión de salvado de trigo en diferentes niveles y tamaño de partícula, con ?-amilasa y fitasa; el uso de bifidobacterias productoras de fitasa como nuevos iniciadores panarios; y la utilización de harina integral de amaranto como ingrediente nutritivo en panificación, fueron las estrategias propuestas para alcanzar el objetivo principal. Se evaluó la calidad nutricional, tecnológica y sensorial de los productos desarrollados. Asimismo, se estudió el efecto de la formulación en la relación molar fitato/mineral, la dializabilidad del hierro y la biosíntesis de ferritina en células Caco-2 como una medida de la absorción de este mineral. El salvado de trigo, en combinación con enzimas amilolíticas y fitasa, disminuyó el efecto negativo en la reología del producto y mejoró la hidrólisis de los fitatos. El uso de bifidobacterias productoras de fitasa (GRAS/PQS), tanto en proceso directo como indirecto, produjo panes con características tecnológicas y sensoriales similares a los controles, pero con una cantidad menor de fitatos. Se consiguió una proporción de compromiso de harina de amaranto en la formulación de pan para preservar la calidad del producto e incrementar su valor nutricional. / Sanz Penella, JM. (2012). NUEVAS ESTRATEGIAS PARA INCREMENTAR LA CALIDAD NUTRICIONAL DE PRODUCTOS DE PANADERÍA. EFECTO SOBRE EL CONTENIDO DE FITATOS Y LA BIODISPONIBILIDAD DE HIERRO EN CACO-2 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15151 / Palancia

A permeabilidade através do epitélio intestinal tem se tornado um importante aspecto a ser determinado nas avaliações biofarmacotécnicas envolvendo fármacos e medicamentos. A técnica mais empregada para essa determinação in vitro é aquela que utiliza a cultura de células Caco-2. Entretanto, ainda são discutíveis as condições para a realização desses experimentos, uma vez que a padronização das mesmas é fator fundamental para a confiabilidade dos resultados. Nesta tese, foram avaliadas as condições para realização dos estudos de permeabilidade através de membranas de células Caco-2 para a rifampicina, principal fármaco utilizado no tratamento da tuberculose. Para tanto, foram investigados fatores tais como a citotoxicidade da rifampicina em diferentes concentrações, a influência da concentração do fármaco sobre a permeabilidade, do pH de realização dos experimentos e da presença de proteínas do muco intestinal, além da influência de proteínas plasmáticas. Foi também investigado o potencial indutor da rifampicina sobre a expressão da glicoproteína-P (Pgp) e seu impacto na permeabilidade da própria rifampicina. Os estudos foram desenvolvidos utilizando membranas de células Caco-2 provenientes da American Type Culture Collection (ATCC) cultivadas em placas Transwel®, a quantificação da fração permeada foi por cromatografia líquida de alta eficiência com métodos validados. A análise da indução da expressão da Pgp foi realizada por PCR-RT. Demonstrou-se que as concentrações da rifampicina (10,0; 25,0 e 50,0 &#181;g/mL) não ocasionaram danos às células Caco-2 no estudo de citotoxicidade pela técnica que emprega o sal do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). As concentrações de rifampicina (5,0; 10,0 e 25,0 &#181;g/mL) não resultaram em valores estatisticamente diferentes de permeabilidade aparente (Papp) em células Caco-2 nas condições do estudo. A rifampicina apresentou valor de Papp significativamente maior em pH 6,8 dentre os valores de pH avaliados (5,8 ; 6,8; 7,4). A presença de muco simulado e de soro fetal bovino não resultou em valores de permeabilidade significativamente distintos do resultado obtido sem a sua adição ao experimento. A expressão da Pgp em células Caco-2 é induzida pela adição da rifampicina (10&#181;g/mL), ocasionando diminuição da sua permeabilidade por mecanismo de efluxo. Pelos resultados de permeabilidade obtidos em todas as condições avaliadas, a rifampicina pode ser considerada um fármaco de alta permeabilidade de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica. / The permeability through the intestinal epithelium has become an important aspect to be determined in evaluations involving drugs and pharmaceutical products. The most common technique for this determination in vitro is one that uses the culture of Caco-2 cells. Nevertheless, the conditions for carrying out such experiments are still questionable, since the standardization of them is essential to the reliability of the results. In this thesis, we evaluate the conditions for the studies of permeability of rifampicin through membranes of Caco-2 cells, the main drug used in the treatment of tuberculosis. To this end, we examined factors such as cytotoxicity of rifampicin at different concentrations, the influence of drug concentration on the permeability, as well as the pH of the experiments, the presence of proteins of intestinal mucus, and the influence of plasma proteins. It was also investigated the potential of rifampicin on the expression of P-glycoprotein (Pgp) and its impact on the permeability of rifampicin itself. The studies were developed using membranes of Caco-2 cells from American Type Culture Collection (ATCC) grown on plates Transwel®, and the quantification of the fraction of drug permeated was obtained by high performance liquid chromatography with validated methods. The analysis of induction of expression of Pgp was performed by RT-PCR. It was demonstrated that the concentrations of rifampicin (10,0; 25,0 and 50,0 &#181;g/mL) did not cause damage to Caco-2 cells in the study of the cytotoxicity technique that uses a bromide salt of 3 - (4,5-dimethyl-2 - thiazol) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT). The concentrations of rifampicin (5,0; 10,0 and 25,0 &#181g/mL) did not result in statistically different values of apparent permeability (Papp) in Caco-2 cells under the conditions of the study. Rifampicin showed a value of Papp significantly higher at pH 6.8 in comparison with other measured pH values (5,8 and 7,4). The presence of mucus simulated and fetal calf serum did not result in permeability values significantly different from the result obtained without its addition to the experiment. The expression of P-gp in Caco-2 cells is induced by the addition of rifampicin (10 &#181;g/ml), decreasing its permeability by efflux mechanism. Taking into account the results of permeability obtained in all conditions, the rifampicin can be considered a high permeability drug according to the biopharmaceutical classification system.

Métodos in vitro utilizando epitélio intestinal animal são importantes ferramentas para avaliar a permeabilidade de fármacos, propriedade que é um importante parâmetro de biodiosponibilidade. Considerando que o maior objetivo na indústria farmacêutica é desenvolver novos fármacos com boa biodisponibilidade oral, o projeto teve como objetivo padronizar o modelo de permeação com membrana de intestino de rã (Rana catesbeiana) em células de Franz, comparando seus resultados com ensaios de células Caco-2. Os fármacos modelo utilizados foram os antivirais zidovudina e aciclovir. A quantidade de fármaco permeado foi determinada por método de eletroforese capilar para o método com intestino de rã touro e por HPLC-UV para os ensaios com células Caco-2. O parâmetro de permeação foi o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) dos fármacos para ambos modelos experimentais. Para estabelecimento do protocolo experimental dos estudos de permeabilidade intestinal de rã, foi proposto um projeto fracionado 24-1 com 4 ensaios adicionais usando o software Minitab, e as variáveis foram: secção intestinal, pH da solução de Ringer e temperatura. A análise do planejamento experimental feita pela estimativa dos parâmetros da regressão obtidos através dos resultados do modelo fatorial possibilitou a determinação dos coeficientes da equação matemática que definiu a influência das variáveis sobre o coeficiente de permeabilidade aparente dos fármacos. Os efeitos das variáveis pH e temperatura interpretados conjuntamente apresentaram interferência leve, porém as variáveis fármaco e secção intestinal interpretados juntos tiveram interferência importante, mostrando maior permeação dos fármacos através da secção inicial do intestino da rã. Os resultados de Papp foram: para o metoprolol, pelo método das células Caco-2 foi de 28 x 10-6 cm/s, valor que está de acordo com demais dados de células Caco-2 na literatura e o valor obtido com células de Franz que mais se adequada a estes resultados e demais disponíveis provenientes de outras técnicas na literatura, foi de 28,1 x 10-6 cm/s, em uma das condições do planejamento estatístico utilizando segmento final da membrana epitelial da rã. No caso do aciclovir, o resultado de Papp de 0,48 x 10-6 cm/s também obtido em uma das condições envolvendo segmento intestinal final da rã foi exatamente igual a o valor 0,48 x 10 - 6 cm/s, encontrado com células Caco-2 no presente estudo e estão de acordo com outros valores disponíveis na literatura por Trapani e colaboradores, 2004 e também com células Caco-2. Para zidovudina o valor de Papp obtido em uma das condições utilizando segmento intestinal inicial da rã, de 13 x 10-6 cm/s, foi a que mais se assemelhou ao obtido pela técnica de células Caco-2, 13,6 x 10-6 cm/s, e também está de acordo com demais dados da literatura. / There are lots of different in vitro technics in the literature using animal intestinal epithelium to estimate permeability of drugs, property that is an important parameter of bioavailabity. Considering that the main objective of Pharmaceutical Companies is the development of new drugs with good oral bioavailabity, the aim of this work was to standardize the permeability of antivirals using in vitro/ex vivo method of intestinal epithelium of Rana catesbeiana in Franz cells and compare these results to those obtained from studies using Caco-2 cells. Zidovudine and Acyclovir were selected as model drugs. The amount of drug permeated will be determined by the method of capillary electrophoresis for assays using Rana Catesbeiana and HPLC-UV for studies with Caco-2 cells. The permeation parameter determined was the apparent permeability coefficient (Papp) of drugs for both experimental models. To establish the experimental protocol to studies of intestinal permeability of frog, it was proposed a fractional 24-1 design with 4 additional tests using Minitab software and the variables were: intestinal section, pH of Ringer solution and temperature. The analysis of the experimental design made by the estimate of the regression parameters obtained from the factorial model results allowed the determination of the coefficients of the mathematical equation that defines the influence of the variables on the apparent permeability coefficient of acyclovir and zidovudine. The effects of pH and temperature interpreted jointly presented a slight interference, but the variables drug and intes tinal section interpreted together had major interference, showing greater permeation of drugs through the initial section of the intestine of the frog . The results of Papp were: for metoprolol, with the method of Caco-2 cells was 28 x 10-6 cm/s, a value which is consistent with other data of Caco-2 cells provided in the literature and the condition obtained with Franz cells that are most suitable for these and other results obtained from other techniques available in the literature, was 28.1 x 10-6 cm/s, provided with the final intestinal segment using frog epithelial membrane. In the case of acyclovir, the result of Papp of 0.48 x 10-6 cm/s obtained in one condition with final frog intestinal segment was exactly equal to the value of 0.48 x 10-6 cm/s, found with Caco-2 cells in the present study and are in agreement with other values available in the literature for Trapani and colegues, 2004 and also with Caco-2 cells. The Papp value for zidovudine obtained with the initial gut segment of frog, 13 x 10-6 cm /s was which more resembled that obtained by the technique of Caco-2 cells, 13.6 x 10-6 cm/s and is also consistent with other literature data.

Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC) que possuem a Ilha de Patogenicidade LEE são importantes patógenos humanos. A habilidade de adesão, invasão e perfil genético têm sido estudados, já que sorotipos que não possuem LEE tem sido isolados de pacientes com doença severa e intracelularmente. Das nove amostras relacionadas com doença, quatro (44.5%) apresentaram stx2+. Todas foram positivas para o gene lpfA e iha, e negativas para toxB. Três (33,3%) apresentaram saa e cinco hly. A maioria apresentou padrão de adesão difusa e invasão negativa em células HEp-2. Em CaCO-2 apresentaram aderência com variados graus de intensidade, e a maioria das amostras testadas apresentou invasão maior que 3,3%. Frente ao inibidor de polimerização de actina citocalasina D, houve significativa redução nos níveis de invasão, sugerindo que estas amostras utilizam um mecanismo da célula hospedeira para internalização, e que provavelmente, fatores de virulência como adesinas, favorecem a adesão das mesmas, compensando a ausência do LEE, e facilitando a instalação da infecção. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) that possess the pathogenic island LEE are important human pathogens. The adhesion ability, invasion and genetic profile have been studied, since serotypes that do not possess LEE have been isolated from humans with severe disease and found intracellular. Nine strains related with SHU, four (44,5%) were stx2+. All strains were positive for IpfA and iha genes and negative for toxB. Three (33,3%) showed saa and five hly. The most strains showed a diffusely adhesion pattern and negative invasion in HEp-2 cells. It presented various degrees of adhesion, and the most tested strains showed invasion high than 3,3% in CaCO-2. That was a significant reduction of invasion in the presence of actin polymerization inhibitor Citochalasin D, suggesting that these strains use a host cell mechanism to invade, and probably virulence factors, like adhesins, favors this adhesion and compensate LEE absence, promoting the installation of infection.

Listeria monocytogenes é uma bactéria transmitida principalmente via alimentos, podendo causar infecções graves em pessoas imunodeprimidas e durante a gestação, devido à sua capacidade de sobreviver intracelularmente. A formação de biofilmes por L. monocytogenes é um fator preocupante para as indústrias de alimentos, pois biofilmes comprometem a sanitização de superfícies, aumentando os riscos de contaminação. Além disso, alguns estudos indicam que a capacidade de formação de biofilme pode estar correlacionada com a capacidade de algumas bactérias causarem doença. O controle de L. monocytogenes representa um desafio, especialmente em alimentos refrigerados e prontos para o consumo, pois esta bactéria é de natureza psicrotrófica, ubíqua e adapta-se rapidamente a diferentes condições ambientais, por meio da modulação da expressão de seus genes. O efeito das condições ambientais na expressão de genes de virulência de L. monocytogenes não é totalmente compreendido. Neste trabalho, isolados de L. monocytogenes de diversas origens foram avaliados quanto à sua capacidade de formar biofilmes, de aderir/invadir em células eucarióticas e também de expressar o gene internalina (int A), que está relacionado com o potencial de virulência. A presença de bacteriocinas de bactérias láticas (BAL) e incubação a 5°C foram os principais fatores que influenciaram a formação de biofilmes por L. monocytogenes, em comparação com caldo BHI (controle). Em geral, a adesão/invasão de células Caco-2 foram significativamente menores em pH baixo (4,5), incubação a 5°C e na presença de 0,3% Oxgall (sais biliares). Entretanto, dois isolados de L. monocytogenes (INCQS 353 e Reg 26c) apresentaram aumento nas taxas de invasão quando cultivados na presença de NaCl a 5% (P<0,05). Um isolado de L. monocytogenes (H-2) obtido de hortaliças apresentou a maior capacidade de formação de biofilme e de invadir células Caco-2, sugerindo que há uma possível relação entre a formação de biofilme e de potencial de virulência. No ensaio para avaliação da expresão do gene inlA, todos os isolados foram regulados negativamente pela presença de bacteriocinas, Oxgall 0,3%, pH 4,5 e incubação a 5°C. No entanto, para um isolado de L. monocytogenes (HU 471), a expressão do gene int A foi oito vezes maior na presença de sacarose, indicando que os componentes de alimentos podem aumentar a virulência e o potencial de infecção de L. monocytogenes. / Listeria monocytogenes is a bacterium transmitted mainly by foods and can cause serious infections in immunocompromised individuals and in pregnant woman due to their ability to survive intracellularly. The biofilm formation by L. monocytogenes is a concern for the food industry because microorganism in biofilms may survive after treatment with sanitizers and increases the risk of food contamination. In addition, some studies indicate that the ability of biofilm formation can be correlated with virulence potential. The control of L. monocytogenes is a challenge, especially in chilled and ready to eat foods since it has psychrotrophic nature, it is ubiquitous and can adapt quickly to different environmental conditions by modulating the expression of its genes.The effect of environmental conditions on gene expression and virulence of Listeria monocytogenes is not fully understood. In this report, L. monocytogenes isolates from diverse sources were evaluated for their ability to form biofilms, for adhesion/invasion of eukaryotic cells and also for differential expression of internalin A gene (int A), which is related to virulence potential. The presence of bacteriocins of latic acid bacteria (BAL) and incubation at 5°C were the main factors that influenced biofilm formation by L. monocytogenes, in comparison with BHI broth (control). In general, adhesion and invasion of Caco-2 cells were significantly lower in low pH (4.5), incubation at 5°C and in presence of Oxgall 0.3% (bile salts). On the other hand, two L. monocytogenes isolates (INCQS 353 and Reg 26c) showed higher invasion rates when cultivated in the presence of NaCl 5% (P<0.05). One L. monocytogenes (H-2) isolated from minimally processed leafy vegetables showed the strongest ability to form biofilm and to invade Caco-2 cells, under selected conditions, suggesting there may be a relationship between biofilm formation and virulence potential. For the vast majority of isolates, expression of int A gene were down regulated by the presence of bacteriocins, Oxgall 0.3%, pH4.5 and incubation at 5°C. Nonetheless, for one L. monocytogenes isolate (HU 471) expression of int A gene was eight times higher in presence of sucrose, indicating that food components can increase the infectiveness of L. monocytogenes.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é um dos principais responsáveis por infecções nosocomiais, sendo identificado também em infecções associadas à comunidade. Embora potentes fármacos anti-estafilocócicos estejam disponíveis, as infecções causadas por este patógeno continuam a apresentar significativa morbidade e mortalidade devido ao aparecimento de cepas com resistência a múltiplos fármacos, incluindo vancomicina e teicoplanina. Compostos 5-nitro-heterocíclicos com estrutura análoga à nifuroxazida, antimicrobiano utilizado em infecções gastrintestinais, têm apresentado satisfatória atividade in vitro frente a estas cepas multirresistentes, sendo importante e necessária a avaliação de sua biodisponibilidade oral como próximo estágio no desenvolvimento de um novo fármaco, visando à seleção eficiente e ao aprimoramento da estrutura molecular. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo empregar ensaios in vitro, utilizando células Caco-2, e métodos in silico, utilizando descritores moleculares VolSurf, a fim de analisar a permeabilidade de análogos à nifuroxazida com atividade antimicrobiana apresentando, principalmente, atividade potencial frente a cepas multirresistentes de S. aureus. Empregou-se o método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para a avaliação da citotoxicidade. Nos estudos de permeabilidade in vitro foram utilizadas membranas de células Caco-2 cultivadas em placas Transwel® por 21 dias. A quantificação das frações permeadas foi realizada por cromatografia a líquido de alta eficiência com detecção UV (CLAE-UV), com métodos validados de acordo com a Resolução 899/03. Os estudos in silico foram realizados por meio de análise exploratória, pelo método de consenso de análise de componentes principais (CPCA, Consensus Principal Component Analysis), e análise de regressão, por quadrados mínimos parciais (PLS, Partial Least Squares). As células Caco-2 apresentaram viabilidade adequada para a realização dos estudos de permeabilidade frente a todos os derivados da nifuroxazida, exceto o derivado MeTIO (5-nitro-2-tiofilideno 4-metilbenzidrazida). Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos para os análogos à nifuroxazida indicam que estes possuem alta permeabilidade. Os modelos obtidos por CPCA e PLS foram capazes de separar as moléculas em grupos de compostos de baixa, média e alta permeabilidade, sendo os análogos à nifuroxazida classificados como compostos de alta permeabilidade. Para os compostos em estudo, as propriedades determinantes da permeabilidade através de células Caco-2, de acordo com os modelos, seriam de natureza topológica e estérica, sendo possível a previsão externa qualitativa e quantitativa da permeabilidade através de células Caco-2. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections, also identified in community-associated infections. Although potent anti-staphylococcal drugs are available, infections caused by this bacteria continues to show significant morbidity and mortality due to the emergence of strains with resistance to multiple drugs, including vancomycin and teicoplanin. The 5-nitro-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, which is an antimicrobial used to treat gastrointestinal infections, have shown satisfactory in vitro activity against multidrug-resistant strains of S. aureus. As a next step in the development of a new drug, it is important and necessary the evaluation of the oral bioavailability to achieve an efficient selection and refinement of the molecular structure. In this context, this study aims to develop in vitro assays through Caco-2 cells, and in silico approaches, using VolSurf molecular descriptors, in order to analyze the permeability of 5-nitro-heterocyclic compounds analogues to nifuroxazide with antimicrobial activity, especially showing promising activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. The MTT (bromide 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) method was employed to perform the cytotoxicity evaluation. Caco-2 cell monolayers cultivated for 21 days in Transwel® plates were used for the in vitro permeability assays. The quantification of the permeated fractions was done by High Performance Liquid Chromatography with UV detection (HPLC-UV), with validated methods according to the Resolution 899/03. In silico studies were performed through exploratory analysis by consensus principal component analysis (CPCA) and regression analysis by partial least squares (PLS). Caco-2 cells showed suitable cell viability for the permeability studies against all nifuroxazide analogues except the MeTIO (5-nitro-2-thiophilydene 4-methylbenzidrazide). The nifuroxazide derivatives apparent permeability values (Papp) obtained indicate these are high permeable compounds. The models obtained by CPCA and PLS were able to separate the molecules into groups of low, medium and high permeabilities, and the nifuroxazide analogues were classified as high permeable substances. The identified properties for the permeability through Caco-2 cells to the studied compounds were topologic and sterical, and it is possible to perform qualitative and quantitative external predictions with these models for the permeability through Caco-2 cells.