Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la formation d'une pourriture molle sur un large spectre de plantes hôtes. Sa virulence dépend principalement de la sécrétion d'exoenzymes (dont les pectinases et cellulases) qui vont dégrader la paroi des cellules végétales. L'objectif de cette thèse est de participer à la compréhension du rôle du périplasme dans la perception de l'environnement par la bactérie. Nous avons caractérisé génétiquement et biochimiquement le locus gan codant 9 protéines impliquées dans le transport et la dégradation des ß-galactanes (un des composants de la pectine). Les OPG (glucanes périplasmiques osmorégulés) sont essentiels pour la virulence d'E. chrysanthemi puisqu'un mutant opgG incapable de les synthétiser présente un phénotype pléïotrope dont la perte de virulence. Une mutation suppressive de la mutation opgG localisée dans le gène rcsC a été obtenue au laboratoire. Nous avons voulu préciser le rôle du système à deux composants RcsCDB dans le pouvoir pathogène de la bactérie. La mutation rcsC2 conduit à une diminution de la phosphorylation du régulateur RcsB due à une augmentation de l'activité phosphatase de RcsC. Pourtant RcsB n'est pas essentielle pour la virulence. Nous avons également montré que l'expression des gènes régulés par le système RcsCDB est influencée par la quantité des OPG. Une faible surexpression d'une version soluble de RcsF engendre une activation du système Rcs et que la faible surexpression de DjlA et IgaA n'a pas d'effet significatif. Enfin, nous avons entrepris de caractériser la structure de RcsF par mutagenèse dirigée. / Erwinia chrysanthemi is a phytopathogenic enterobacterium causing soft rot disease in a wide range of plant species. The maceration of plant tissues is essentially caused by the secretion of a set of plant cell wall degrading enzymes (including pectinases and cellulases). The aim is to participate to the understanding of the role of the periplasm in environment perception by bacteria. We characterised genetically and biochemically the gan locus encoding 9 proteins involved in galactan transport and catabolism (galactan is a pectic component). Osmoregulated periplasmic glucans (OPGs) are essential for E. chrysanthemi pathogenicity. An opgG mutant lacks OPGs and shows a pleiotropic phenotype including nonvirulence. A rcsC point mutation (rcsC2) suppresses the phenotype induced by OPGs defect. We wanted to clarify the role of the Rcs system in pathogenicity. The rcsC2 mutation leads to the reduction of transcriptional activity of RcsB caused by an increase of phosphatase activity of RcsC. Mutations in RcsCDB proteins show that RcsB is not essential to virulence. We have shown that genes expression regulated by RcsCBD phosphorelay is influenced by the quantity of OPGs in the periplasm. An ectopic overexpression of a soluble version of RcsF leads to a RcsCDB phosphorelay activation, while an ectopic overexpression of DjlA and IgaA has no significatives effects. Finally, we have characterized RcsF structures by site-directed mutagenesis and deletion mutagenesis.

L'enveloppe bactérienne est une cible majeure d'un grand nombre d'antibiotiques naturels. Certains provoquent d'importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d'autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l'action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l'antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l'ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d'une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu'il engendre), et, d'autre part, d'assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique.<br /><br />Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d'antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d'identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l'expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L'objectif de notre étude était de tester l'hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.<br /><br />La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l'undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l'undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. L'expression de l'opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l'UP et s'oppose ainsi à l'action de la bacitracine. L'expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires.<br />Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l'induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l'activation de l'expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d'UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l'expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l'UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n'est pas exclu, qu'en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l'activation du système.<br /><br />La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d'une part, des protéines similaires à BcrC, et, d'autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrC-like » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu'elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane. <br />Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d'antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.

Les plantes sont de plus en plus confrontées à une diminution de la disponibilité en eau du sol, constituant une contrainte hydrique et osmotique impactant leur survie. La tolérance des plantes face à cette contrainte sera conditionnée par la perception de celle-ci. Un des mécanismes de signalisation de cette contrainte est appelé MultiStep Phosphorelay (MSP) et est composé de 3 partenaires : un récepteur Histidine-aspartate Kinase (HK), des protéines Histidine Phosphotransfert (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR), dont les facteurs de transcription RR-B. Chez Arabidopsis, un MSP constitué d’AHK1, AHP2 et ARR18 a été identifié dans le cadre de la contrainte osmotique. Pour le peuplier, HK1a et b, gènes paralogues et homologues à AHK1, ainsi que 10 et 9 gènes codant respectivement des HPt et des RR-B ont été isolés. La fonction d’osmosenseur d’HK1a a été avancée, et une voie de signalisation de la contrainte osmotique chez le peuplier constituée de ce récepteur, 3 HPt et 6 RR-B a été proposée. L’objectif de la thèse visait à déterminer et caractériser des facteurs de transcription RR-B liés à la contrainte osmotique de façon spécifique. Les résultats phares de cette thèse sont la mise en évidence de la fonction de facteur de transcription de deux RR-B, RR13 et RR19, via l’étude de leur capacité à dimériser et à transactiver ou non des gènes de réponses à la contrainte osmotique. Le RR13 semblerait spécifique de la voie cytokinines et le RR19 de la voie osmosensing. Ce travail étaye fortement l’implication du RR19 dans le MSP dédié à cette contrainte. De nombreuses études ont par ailleurs été initiées durant ce travail de thèse et pourront faciliter la caractérisation du MSP étudié. / Plants are increasingly faced with a decrease in soil’s water availability, leading to a hydric and osmotic stress and impacting on their survival. Plant tolerance to this stress will be dependent on its perception. One of the signaling mechanisms related to this stress is called MultiStep Phosphorelay (MSP) and is composed by 3 partners: a histidine-aspartate receptor kinase (HK), histidine phosphotransfer proteins (HPt) and response regulators (RR), including the B-type RR transcription factors. In Arabidopsis, an MSP with AHK1, AHP2 and ARR18 has been identified for osmotic stress signaling. For poplar, HK1a and b, paralogous genes and homologous with AHK1, 10 HPt and 9 B-type RR genes have been isolated respectively. The osmosensor function of HK1a was proposed, and an osmosensing signaling pathway composed by HK1a, 3 HPt proteins, and 6 B-type RR has been suggested. The purpose of this work was focused on the identification and characterization of B-type RR transcription factors specifically linked to osmotic stress in poplar. The main results of this work are the highlight of the transcription factor function of two B-type RR, RR13 and RR19, through the study of their ability to dimerize and transactivate or not osmotic stress-responsive genes. The RR13 seems to be specific for cytokinins signaling pathway, whereas the RR19 seems to be specific for the osmosensing one. This work strongly supports the involvement of RR19 in the osmosensing MSP. Many studies have also been initiated during this work and will facilitate the characterization of the studied MSP.

Les systèmes à deux composants jouent un rôle prépondérant dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et de caractériser des systèmes à deux composants chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum nécessaires à l'adaptation à la rhizosphère de sa plante-hôte. L'analyse de la distribution génomique des gènes appartenant à la famille des systèmes à deux composants dans les génomes d'Azospirillum disponibles a révélé l'existence d'un grand nombre de gènes codant des hisitidine kinases hybrides, et une analyse plus approfondie a montré une organisation multidomaines complexe de cette famille de protéines. Afin de comprendre leur rôle chez Azospirillum, nous avons, dans un premier temps, sélectionné et inactivé quatre gènes codant des histidine kinases hybrides présentant une architecture multidomaines complexe. A l'aide d'une approche multidisciplinaire combinant génétique, biochimie et phylogénie, nous avons mis en évidence pour la première fois chez Azospirillum, un système atypique à trois-composants nommé PreSKR contrôlant un grand nombre de processus impliqués dans la survie et la colonisation de la rhizosphère, qui agirait en modulant le taux intracellulaire de c-di-GMP. Dans un second temps, nous nous sommes focalisés sur une histidine kinase hybride exprimée au contact de la plante hôte ; cette protéine, appelée RsiK, s'avère être impliquée dans la perception de surfaces et la régulation de la formation de biofilms. L'analyse du régulon par RNA-seq a révèlé que 78 gènes étaient contrôlés par ce système. La prévalence de la famille des histidine kinases hybrides chez Azospirillum couplée à l'approche fonctionnelle réalisée sur deux d'entre elle souligne l'importance des phosphorelais encore largement méconnus chez les bactéries rhizosphériques / Bacterial two-component systems play an important role in the ability of bacteria to adapt to various environments. The aim of this thesis was to identify and characterize two-component systems involved in the adaptation of the phytostimulatory bacteria Azospirillum to its host plant. Analysis of the genomic distribution of genes encoding two-component systems across Azospirillum available genomes revealed the existence of a high number of genes encoding hybrid histidine kinases, and further analyses highlighted a complex multi-domain organization of this family of proteins. In order to understand their role in Azospirillum, as a first step we selected and inactivated four genes encoding complex hybrid histidines kinases. Using a multidisciplinary approach which combines genetics, biochemistry and phylogeny, we brought to light for the first time in Azospirillum, an atypical three-component system named PreSKR which controls a wide variety of processes involved in survival and rhizosphere colonization likely by modulating c-di-GMP levels. As a second step, we focused on a gene encoding a hybrid histidine kinase named RsiK which is induced in contact with its host plant. RsiK is involved in surface sensing and biofilm formation regulation. Transcriptomic analysis of rsiK regulon by RNA-seq showed that 78 genes were under the control of this system. The prevalence of genes encoding hybrid histidine kinase family in Azospirillum, coupled with the functional characterization of two of them, highlight the importance of phosphorelays, still largely unrecognized in rhizospheric bacteria

Les relais de phosphorylation de type histidine/aspartate constituent des voies de signalisation impliquées dans la perception et la transduction des signaux jusqu’à la mise en place de réponses spécifiques. Ils mettent en jeu un récepteur ou Histidine aspartate Kinase (HK), des protéines navettes en charge de la transmission du phosphate (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR). L’implication d’un tel système dans la transduction du signal de la contrainte osmotique est avérée chez la levure et fortement suspectée chez Arabidopsis. Ce travail de thèse visait d’une part à caractériser l’implication de cette voie de transduction de la contrainte osmotique chez le peuplier, avec l’identification de partenaires HPt et RR en aval du récepteur HK1 et d’autre part à caractériser le mode de fonctionnement d’un RR de type-B. HK1, un osmosenseur membranaire détecterait le signal et le transmettrait à trois HPt préférentielles. De plus, un partenariat d’interaction se dégagerait entre ces trois HPt et certains RR-B. La régulation transcriptionnelle observée lors d’une contrainte osmotique pour deux des représentants des RR-B témoigne d’une possible implication de ces RR dans cette voie. Ces protéines sont des facteurs de transcription dont la fonction a été confirmée in planta pour l’un d’entre eux. La dimérisation du domaine receveur du RR et son interaction avec le domaine de fixation à l’ADN ou domaine GARP apparaissent comme des points de contrôle clés dans la régulation de l’activité effectrice des RR-B. De plus, la capacité d’un RR-B à se fixer sur ses motifs de reconnaissance (boîtes AGAT) a pu être vérifiée in vitro et la présence de ces séquences a d’ailleurs été retrouvée dans des gènes régulés par la contrainte osmotique. Ce travail prospectif ouvre des perspectives concernant l’implication des RR-B dans la voie de transduction du signal de la contrainte osmotique, et propose notamment des mécanismes fins pour l’élaboration d’une réponse hautement spécifique. / Multistep His-to-Asp phosphorelay systems are signaling pathways devoted to signal perception and transduction for establishment of specific responses. These systems are composed of three successive partners: Histidine-aspartate Kinases (HKs), Histidine-containing Phosphotransfer proteins (HPts), and Response Regulators (RRs). One of the best characterized corresponding systems is the osmo-responsive pathway in yeast. Such systems are also suspected in Arabidopsis. This work aimed to characterize the involvement of an osmosensing pathway in Populus by identifying HPt and RR elements downstream of HK1 and to reveal the underlying mechanisms for the activity of a RR-B. HK1, membrane osmosensor, is expected to be responsible for signal detection and propagation by triggering the activation of three preferential HPt. Furthermore, an interacting partnership between those HPts and particular B-type RRs was observed. Two of them appear to be regulated by an osmotic stress, suggesting their possible involvement in this pathway. The B-type RR members, the final output elements of the pathway, act as transcription factors, as shown for at least for one of them in planta. Taken together, the dimerization of the RR receiver domain and its interaction with its DNA binding domain (GARP), are likely key checkpoints in the regulation of RR-B activity. Besides, the ability of one RR-B to bind its cognate specific DNA sequences (AGAT boxes) was confirmed in vitro and those were found in promoters of osmotic response genes. This work opens up prospects for the involvement of RR-B in the osmotic stress signaling pathway and suggests mechanisms tuning induction of specific responses.