Universiẗat, Diss., 2005--Düsseldorf.

Es erfolgte eine Analyse der Regulation der chloroplastidären NADP-MDH und deren Rolle als poising-Mechanismus in Arabidopsis thaliana. Es wurden WT-Pflanzen im Kurztag (KT) oder im Langtag (LT) angezogen und dann einer Überreduktion durch Erhöhung der bereitgestellten Energie unterzogen. In KT- und LT-Pflanzen konnten unterschiedliche Strategien ermittelt werden, um überschüssige Elektronen zu entsorgen. Während KT-Pflanzen redox-vermittelte Akklimatisierungssignale benutzen, um eine bessere Lichtnutzung und ein optimiertes Redox-poising zu erreichen, herrscht in LT-Pflanzen der Schutz vor oxidativem Schaden vor. Es erfolgte eine Charakterisierung von im KT angezogenen NADP-MDH-knock-out-Pflanzen. Da schon unter Kontrollbedingungen erhöhte Aktivitäten von antioxidativen Enzymen vorlagen, reagieren NADP-MDH-KO-Pflanzen wie Pflanzen, die Starklicht-Intensitäten ausgesetzt sind. Die Kapazität der NADP-MDH wird transkriptional reguliert. Um die Signale und Interaktionspartner zu identifizieren, die die verstärkte Transkription der NADP-MDH vermitteln, wurde der Promotorbereich des Enzyms analysiert. Es konnten insgesamt 39 Proteine identifiziert werden, die möglicherweise die verstärkte Transkription der NADP-MDH vermitteln. Unter anderem wurde die Bindung von cytosolischer GAPDH innerhalb der kodierenden Sequenz des NADP-MDH-Gens wahrscheinlich gemacht und in vitro verifiziert. Die Bindestelle der cytosolischen GAPDH wurde auf einen 257 bp umfassenden Bereich eingegrenzt. Es wird postuliert dass es sich um einen regulierten Promotor mit upstream- und downstream-Elementen, sowie mit cis-Elementen innerhalb der CDS handelt. Daher handelt es sich bei dem Gen der NADP-MDH um einen null-core- oder einen distinct-INR-Promotor.

Ferredoxins are the major distributors for electrons to the various acceptor systems in plastids. In green tissues, ferredoxins are reduced by photosynthetic electron flow in the light. In this work Ds-T-DNA-insertion line of Arabidopsis thaliana for the coding region of the major leaf ferredoxin (Fd2, At1g60950) is used to create a situation of high electron pressure in the thylakoids. The highly reduced photosynthetic electron transport chain causes an extreme form of acclimation to high light, while the oxidized stroma leads to a re-adjustment of the chloroplast metabolism helping the plants to survive under these light-stress conditions. Redox homeostasis is achieved by regulation at both, the post-transcriptional and the transcriptional level. Alterations in gene expression due to acclimation via retrograte signalling are caused by a signal originating from the reduced photosynthetic electron flow. Using additionally Ds-T-DNA-insertion lines of A. thaliana for the coding region of Fd1 and transgenic approaches for gene silencing of Fd1, different functions of the two photosynthetic isoforms in A. thaliana are observed. Thereby Fd1 plays a significant role in Fd-dependent cyclic electron flow, and Fd2 predominantly drives the linear elelctron flow to generate NADPH. However, these specific functions are partly redundant. Using these transgenic lines of A. thaliana the essential function of ferredoxin-dependent cyclic electron flow in C3-plants became clear. In addition to the known ferredoxin isoforms in A. thaliana, the genome contains sequences coding for novel, unstudied ferredoxin-like proteins (FdC1 and FdC2) with extended C-termini, for which there are homologues in other photosynthetic organisms. In the Ds-T-DNA-insertion line of A. thaliana for the coding region of Fd2, the transcript level of FdC1 is increased. This implies an important role for FdC1 under conditions of high-electron pressure in the photosynthetic electron transport chain.

Tocopherols, collectively known as vitamin E, are lipophilic antioxidants, which are synthesized only by photosynthetic organisms. Due to their enormous potential to protect cells from oxidative damage, tocopherols are used e.g. as nutraceuticals and additives in pharmaceuticals. The most biologically active form of vitamin E is α-tocopherol. Most tocopherols are currently produced via chemical synthesis. Nevertheless, this always results in a racemic mixture of different and less effective stereoisomers because the natural isomer has the highest biological activity. Therefore, tocopherols synthesized in natural sources are preferred for medical purposes. The annual sunflower (Helianthus annuus L.) is a well-known source for α-tocopherol. Within the presented work, sunflower callus and suspension cultures were established growing under photomixotrophic conditions to enhance α-tocopherol yield. The most efficient callus induction was achieved with sunflower stems cultivated on solid Murashige and Skoog medium supplemented with 30 g l-1 sucrose, 0.5 mg l-1 of the auxin 1-naphthalene acetic acid and 0.5 mg l-1 of the cytokinin 6-benzylaminopurine. Photomixotrophic sunflower suspension cultures were induced by transferring previously established callus into liquid medium. The effects of light intensity, sugar concentration and culture age on growth rate and α-tocopherol synthesis rate were characterized. A considerable increase (max. 230 %) of α-tocopherol production in the cells was obtained within the photomixotrophic cell culture compared to a heterotrophic cell culture. These results will be useful for improving α-tocopherol yields of plant in vitro cultures.

This thesis contains quantum chemical models and force field calculations for the RuBisCO isotope effect, the spectral characteristics of the blue-light sensor BLUF and the light harvesting complex II. The work focuses on the influence of the environment on the corresponding systems. For RuBisCO, it was found that the isotopic effect is almost unaffected by the environment. In case of the BLUF domain, an amino acid was found to be important for the UV/vis spectrum, but unaccounted for in experiments so far (Ser41). The residue was shown to be highly mobile and with a systematic influence on the spectral shift of the BLUF domain chromophore (flavin). Finally, for LHCII it was found that small changes in the geometry of a Chlorophyll b/Violaxanthin chromophore pair can have strong influences regarding the light harvesting mechanism. Especially here it was seen that the proper description of the environment can be critical. In conclusion, the environment was observed to be of often unexpected importance for the molecular properties, and it seems not possible to give a reliable estimate on the changes created by the presence of the environment. / Diese Arbeit beinhaltet quantenchemische und molekularmechanische Modelle zum Isotopeneffekt des Enzyms RuBisCO, der spektralen Charakterisierung des Blaulicht-Rezeptors BLUF und dem Lichtsammelkomplex II (LHCII). Es wurden vor allem die Einflüsse der Umgebung auf die entsprechenden Systeme untersucht. Für RuBisCO wurde gefunden, dass der Isotopeneffekt nur marginal von der Umgebung abhängt. Im Falle der BLUF Domäne wurde eine Aminosäure charakterisiert (Ser41), die bis dato experimentell noch nicht beschrieben war. Es wurde festgestellt, dass Ser41 hochmobil ist und einen systematischen Einfluss auf die spektrale Verschiebung des BLUF Chromophors (Flavin) hat. Schließlich wurde bei LHCII festgestellt, dass kleine Veränderungen in der Geometrie eines Chlorophyll b/Violaxanthin Chromophorenpaares bereits massive Einflüsse auf den Mechanismus des Lichtsammelprozesses haben können. Insbesondere hier zeigt sich, wie kritisch die genaue Beschreibung der Umgebung ist. Zusammenfassend wurde beobachtet, dass sich die Umgebung in oft unerwarteter Weise auf die molekularen Eigenschaften auswirken kann und es daher nicht möglich zu sein scheint, die entsprechenden Effekte vorher abzuschätzen.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2009 / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2008

Die Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung und Entwicklung definiert beleuchteter Photobioreaktorsysteme (klassische Systeme wie Schüttelkolben und Blasensäule als auch neuartige Konzepte) für reaktionskinetische Untersuchungen. Diese dienen zur Untersuchung des Einflusses des Lichts auf das Wachstum phototropher Organismen, als Modellorganismus wurde das Cyanobakterium Arthrospira platensis ausgewählt.

L'oxydase terminale plastidiale (PTOX) est présente uniquement chez les organismesphotosynthétiques. PTOX oxyde le plastoquinol (PQH2) et réduit l'oxygène en eau.PTOX est impliquée dans la synthèse des caroténoïdes, dans le transportphotosynthétique d'électrons et dans la chlororespiration. De plus, son activité estconsidérée comme pouvant jouer un rôle en tant que soupape de sécurité, permettant de maintenir oxydé le pool de plastoquinones (PQ) et d'éviter la surréduction duchloroplaste et ainsi la photoinhibition. Chez la majorité des plantes testées, les niveaux de PTOX sont plus élevés dans des conditions de stress (une exposition à forte intensité lumineuse, par exemple). D'autre part, la surexpression de PTOX chez Arabidopsis thaliana n'a pas rendu les plantes moins sensibles à la photoinhibition. Par ailleurs, il semble que PTOX surexprimée chez Nicotiana tabacum a induit la génération des espèces réactives de l'oxygène (ERO) et une photoinhibition importante sous forte lumière.Le but de cette thèse était la caractérisation de l'activité enzymatique de PTOX enutilisant la protéine purifiée et de comprendre pourquoi PTOX protège du stressphotooxydant dans certaines conditions et pourquoi elle augmente ce stress quand elle est surexprimée in planta.L'analyse biochimique de PTOX recombinante purifiée a démontré que l'enzymeexiste principalement sous forme tétramérique. Cette forme se dissocie partiellement,principalement en dimères. Le turnover maximal de l'enzyme purifié correspond à 320électrons par seconde et par molécule de PTOX. Nous avons démontré que PTOXgénère des ERO dans une réaction secondaire dépendante de la concentration dusubstrat (PQH2) et du pH de la solution. À pH 8 (représentant le pH du stroma deschloroplastes actifs), PTOX a une activité antioxydante quand la concentration de PQH2 est basse et prooxydante quand cette concentration est élevée.En mesurant la fluorescence de la chlorophylle a, nous avons démontré quePTOX est active lorsqu'elle est ajoutée aux membranes enrichies en PSII.L'attachement aux membranes dépend du pH et de cations de la solution: lorsque le pHdiminue ou lorsque la solution est riche en cations monovalents, la quantité de PTOXattachée à la membrane diminue.L'activité de PTOX in planta et son effet sur le transport des électronsphotosynthétiques ont été analysés en utilisant Arabidopsis thaliana surexprimant laphytoène désaturase bactérienne (CRTI) et Nicotiana tabacum surexprimant PTOX1 deChlamydomonas reinhardtii. Arabidopsis thaliana surexprimant CRTI a un niveau plusimportant de PTOX et de production d'ERO et le transport cyclique des électrons estsupprimé chez les transformants. Cela implique que PTOX est en compétition avec letransfert cyclique pour les électrons du pool PQ et que PTOX joue un rôle importantdans le contrôle de l'état rédox de ce pool. En utilisant Nicotiana tabacum surexprimant PTOX1, nous avons démontré que PTOX fait concurrence au transfert linéaire d'électrons photosynthétique, mais que PTOX est inactivée quand le pH du stroma est neutre. Grâce aux résultats obtenus, nous proposons un modèle où l'association de PTOX avec la membrane est contrôlée par le pH du stroma. Quand le pH est neutre, PTOX est soluble et n'est pas active, ce qui évite l'interférence avec le transfert linéaire d'électrons. Quand le pH du stroma est alcalin et la chaîne des transporteurs photosynthétiques est surréduite (lors des conditions du stress), PTOX s'attache à la membrane, devient active et joue le rôle de soupape de sécurité. / The plastid terminal oxidase PTOX is encoded by higher plants, algae and some cyanobacteria. PTOX is a plastid-localized plastoquinol (PQH2) oxygen oxidoreductase. PTOX was shown to be implicated in plant carotenoid biosynthesis, photosynthetic electron transport and chlororespiration and may act as a safety valve protecting plants against photo-oxidative stress. PTOX protein levels increase during abiotic stress indicating a function in stress acclimation. But overexpression of PTOX in Arabidopsis did not attenuate the severity of photoinhibition or, when overexpressed in tobacco, even increased the production of reactive oxygen species (ROS) and exacerbated photoinhibition.Biochemical analysis of recombinant purified PTOX (PTOX from rice fused to the maltose-binding protein) showed that the enzyme exists mainly as a tetramer, which dissociated to a certain extent during electrophoresis, mainly into a dimeric form. The PTOX activity was 320 electrons s−1 PTOX−1. It was also shown that PTOX generates ROS in a side reaction in a substrate (decylPQH2) and pH-dependent manner when liposomes were used: at the basic stromal pH of photosynthetically active chloroplasts, PTOX was antioxidant at low decylPQH2 gaining prooxidant properties with increasing quinol concentrations. It is concluded that PTOX can act as a safety valve when the steady state [PQH2] is low while a certain amount of ROS is formed at high light intensities.It was shown by chlorophyll a fluorescence that recombinant purified PTOX is active when added to photosystem II (PSII)-enriched membrane fragments. PTOX attached tightly to the PSII-enriched membrane fragments. The amount of PTOX attaching to the membrane depended on pH and salts: an alkaline pH and monovalent compared to divalent cations increased PTOX attachment.PTOX activity in planta and its effect on photosynthetic electron transport were investigated using Arabidopsis expressing bacterial phytoene desaturase and tobacco expressing PTOX1 from Chlamydomonas. Arabidopsis expressing bacterial phytoene desaturase (CRTI lines) showed a higher PTOX content and increased PTOX related ROS generation. Furthermore, cyclic electron flow was suppressed in these lines. This implicates that PTOX competes efficiently with cyclic electron flow for PQH2 in the CRTI-expressing lines and that it plays a crucial role in the control of the reduction state of the plastoquinone pool. Using tobacco expressing PTOX1 from Chlamydomonas, it was shown that PTOX competes efficiently with photosynthetic electron flow, but gets inactive when the stromal pH is neutral. Based on the in vitro and in vivo results, a model is proposed, where the association of PTOX to the membrane is controlled by the stromal pH: When the stromal pH is neutral, PTOX exists as a soluble form and is enzymatically inactive avoiding the interference of PTOX with linear electron flow. When the stromal pH is alkaline and the photosynthetic electron chain is highly reduced under stress conditions as high light, PTOX binds to the membrane, gets enzymatically active and can serve as safety valve.

Die Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung und Entwicklung definiert beleuchteter Photobioreaktorsysteme (klassische Systeme wie Schüttelkolben und Blasensäule als auch neuartige Konzepte) für reaktionskinetische Untersuchungen. Diese dienen zur Untersuchung des Einflusses des Lichts auf das Wachstum phototropher Organismen, als Modellorganismus wurde das Cyanobakterium Arthrospira platensis ausgewählt.

Mathematical modeling of biological systems is a powerful tool to systematically investigate the functions of biological processes and their relationship with the environment. To obtain accurate and biologically interpretable predictions, a modeling framework has to be devised whose assumptions best approximate the examined scenario and which copes with the trade-off of complexity of the underlying mathematical description: with attention to detail or high coverage. Correspondingly, the system can be examined in detail on a smaller scale or in a simplified manner on a larger scale. In this thesis, the role of photosynthesis and its related biochemical processes in the context of plant metabolism was dissected by employing modeling approaches ranging from kinetic to stoichiometric models. The Calvin-Benson cycle, as primary pathway of carbon fixation in C3 plants, is the initial step for producing starch and sucrose, necessary for plant growth. Based on an integrative analysis for model ranking applied on the largest compendium of (kinetic) models for the Calvin-Benson cycle, those suitable for development of metabolic engineering strategies were identified. Driven by the question why starch rather than sucrose is the predominant transitory carbon storage in higher plants, the metabolic costs for their synthesis were examined. The incorporation of the maintenance costs for the involved enzymes provided a model-based support for the preference of starch as transitory carbon storage, by only exploiting the stoichiometry of synthesis pathways. Many photosynthetic organisms have to cope with processes which compete with carbon fixation, such as photorespiration whose impact on plant metabolism is still controversial. A systematic model-oriented review provided a detailed assessment for the role of this pathway in inhibiting the rate of carbon fixation, bridging carbon and nitrogen metabolism, shaping the C1 metabolism, and influencing redox signal transduction. The demand of understanding photosynthesis in its metabolic context calls for the examination of the related processes of the primary carbon metabolism. To this end, the Arabidopsis core model was assembled via a bottom-up approach. This large-scale model can be used to simulate photoautotrophic biomass production, as an indicator for plant growth, under so-called optimal, carbon-limiting and nitrogen-limiting growth conditions. Finally, the introduced model was employed to investigate the effects of the environment, in particular, nitrogen, carbon and energy sources, on the metabolic behavior. This resulted in a purely stoichiometry-based explanation for the experimental evidence for preferred simultaneous acquisition of nitrogen in both forms, as nitrate and ammonium, for optimal growth in various plant species. The findings presented in this thesis provide new insights into plant system's behavior, further support existing opinions for which mounting experimental evidences arise, and posit novel hypotheses for further directed large-scale experiments. / Mathematische Modellierung biologischer Systeme eröffnet die Möglichkeit systematisch die Funktionsweise biologischer Prozesse und ihrer Wechselwirkungen mit der Umgebung zu untersuchen. Um präzise und biologisch relevante Vorhersagen treffen zu können, muss eine Modellierungsstrategie konzipiert werden, deren Annahmen das untersuchte Szenario bestmöglichst widerspiegelt und die dem Trade-off der Komplexität der zugrunde liegenden mathematischen Beschreibung gerecht wird: Detailtreue gegenüber Größe. Dementsprechend kann das System detailliert, in kleinerem Umfang oder in vereinfachter Darstellung im größeren Maßstab untersucht werden. In dieser Arbeit wird mittels verschiedener Modellierungsansätze, wie kinetischen und stöchiometrischen Modellen, die Rolle der Photosynthese und damit zusammenhängender biochemischer Prozesse im Rahmen des Pflanzenstoffwechsels analysiert. Der Calvin-Benson-Zyklus, als primärer Stoffwechselweg der Kohlenstofffixierung in C3-Pflanzen, ist der erste Schritt der Stärke- und Saccharoseproduktion, welche maßgeblich für das Wachstum von Pflanzen sind. Basierend auf einer integrativen Analyse zur Modellklassifizierung wurden aus der größten bekannten Sammlung von (kinetischen) Modellen des Calvin-Benson-Zyklus diejenigen ermittelt, die für die Entwicklung von Metabolic-Engineering-Strategien geeignet sind. Angeregt von der Fragestellung warum Kohlenstoff transitorisch vorwiegend in Form von Stärke anstatt Saccharose gespeichert wird, wurden die metabolischen Kosten beider Syntheseprozesse genauer betrachtet. Die Einbeziehung der Bereitstellungskosten der beteiligten Enzyme stützt die Tatsache, dass bevorzugt Stärke als temporärer Kohlenstoffspeicher dient. Die entprechende Untersuchung erfolgte einzig auf Grundlage der Stöchiometrie der Synthesewege. In vielen photosynthetisch-aktiven Organismen findet zudem Photorespiration statt, die der Kohlenstofffixierung entgegenwirkt. Die genaue Bedeutung der Photorespiration für den Pflanzenmetabolismus ist noch umstritten. Eine detaillierte Einschätzung der Rolle dieses Stoffwechselweges bezüglich der Inhibierung der Kohlenstofffixierungsrate, der Verknüpfung von Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus, der Ausprägung des C1-Stoffwechsels sowie die Einflussnahme auf die Signaltransduktion wurde in einer modell-basierten, kritischen Analyse vorgenommen. Um die Photosynthese in ihrem metabolischen Kontext verstehen zu können, ist die Betrachtung der angrenzenden Prozesse des primären Kohlenstoffmetabolismus unverzichtbar. Hierzu wurde in einem Bottom-up Ansatz das Arabidopsis core Modell entworfen, mittels dessen die Biomasseproduktion, als Indikator für Pflanzenwachtum, unter photoautotrophen Bedingungen simuliert werden kann. Neben sogenannten optimalen Wachstumsbedingungen kann dieses großangelegte Modell auch kohlenstoff- und stickstofflimitierende Umweltbedingungen simulieren. Abschließend wurde das vorgestellte Modell zur Untersuchung von Umwelteinflüssen auf das Stoffwechselverhalten herangezogen, im speziellen verschiedene Stickstoff-, Kohlenstoff- und Energiequellen. Diese auschließlich auf der Stöchiometrie basierende Analyse bietet eine Erklärung für die bevorzugte, gleichzeitige Aufnahme von Nitrat und Ammonium, wie sie in verschiedenen Spezies für optimales Wachstum experimentell beobachtet wurde. Die Resultate dieser Arbeit liefern neue Einsichten in das Verhalten von pflanzlichen Systemen, stützen existierende Ansichten, für die zunehmend experimentelle Hinweise vorhanden sind, und postulieren neue Hypothesen für weiterführende großangelegte Experimente.