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L’estradiol (E2) accélère la maturation pulmonaire et la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (17ßHSD2) inactive les estrogènes et les androgènes. L’expression de la 17ßHSD2 fluctue et culmine dans le poumon foetal murin au jour gestationnel 17,5. Les fluctuations de la 17ßHSD2 pulmonaire pourraient être associées aux niveaux de E2 foetal. La 17ßHSD2 placentaire pourrait alors réguler E2 foetal et maternel. Cette étude établit s’il existe une corrélation entre E2 foetal et la 17βHSD2 pulmonaire et compare les ratios (E2 foetal/ E2 maternel) avec l’expression de la 17βHSD2 placentaire. E2 fut dosé par spectrométrie de masse et l’ARNm de la 17βHSD2 fut mesuré par QPCR. Aucune corrélation entre E2 foetal et la 17ßHSD2 pulmonaire n’existe. Les ratios de E2 ne corrèlent pas avec la 17ßHSD2 placentaire. Ces résultats suggèrent un contrôle local de la 17ßHSD2 dans les poumons foetaux tandis que les ratios E2 pourraient être régulés par la 17βHSD1 placentaire. / Estradiol (E2) exerts a positive effect on fetal lung maturation. The 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (17ßHSD2) inactivates estrogens and androgens. 17ßHSD2 also presents a peak and an inter-litter variation of expression at gestational day 17.5 in the murine fetal lung. The variability of the pulmonary 17ßHSD2 mRNA levels could be explained by variations in fetal E2 levels. The placental 17ßHSD2 could regulate fetal and maternal E2. This study determined if a correlation exists between fetal E2 levels and pulmonary 17βHSD2 mRNA levels. A comparison was also made between E2 ratios (fetal / maternal) and the placental 17βHSD2 mRNA levels. E2 was measured by gas chromatography-mass spectrometry and 17βHSD2 was determined by quantitative PCR. There is no correlation between levels of fetal E2 and pulmonary 17ßHSD2 mRNA. Ratios of E2 levels do not correlate with placental 17ßHSD2 mRNA. These results suggest a local control of 17ßHSD2 mRNA levels in fetal lungs. Ratios of E2 could be regulated by the placental 17βHSD1.

La prééclampsie (PE) est une pathologie obstétricale complexe associée à un défaut de placentation. Selon la littérature, le placenta anormalement développé libèrerait des facteurs qui induiraient une dysfonction endothéliale maternelle. Nous avons émis comme hypothèse qu’une accumulation de sorbitol, un sucre hyperosmotique produit par la voie des polyols, pourrait induire la libération par le placenta de sFlt-1, un facteur anti-angiogénique antagoniste du VEGF en PE. Nous avons comparé les niveaux d’expression d’ARNm et de protéines de AKR1B1 et SORD, les deux enzymes impliquées dans la voie des polyols, dans les placentas de mères ayant eu une grossesse normotensive (groupe témoin) ou prééclamptique par RT-PCR quantitatif et par immunobuvardage respectivement. Nous les avons ensuite localisées par immunohistochimie. Nos résultats suggèrent que la voie des polyols serait altérée au niveau de la membrane amniochorionique des placentas issus de grossesses prééclamptiques, ce qui pourrait favoriser une accumulation de sorbitol à l’interface fœto-maternelle. / Preeclampsia (PE) is a complex obstetrical pathology associated to a defective placentation. The abnormally developed placenta is believed to release factors causing a maternal endothelial dysfunction. We hypothesized that an accumulation of sorbitol, a hyperosmotic sugar produced through the polyol pathway, could induce the release by the placenta of sFlt-1, an antagonist of the angiogenic factor VEGF in PE. We compared mRNA and protein expression levels of AKR1B1 and SORD, the two enzymes of the polyol pathway, in placentas from normotensive (control) and PE pregnancies by quantitative RT-PCR and immunoblotting respectively. Then, we localized the two enzymes by immunohistochemistry. Our results suggest that polyol pathway is altered in amniochorionic membranes from PE pregnancies, and that this phenomenon would promote sorbitol accumulation at the foeto-maternal interface.

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L’obésité est un problème de santé majeur qui se traduit par un déséquilibre du métabolisme énergétique. La protéine stimulant l’acylation (ASP, C3adesArg) est une protéine produite par le tissu adipeux qui stimule la synthèse des triglycérides (TG) et le transport du glucose en se liant à son récepteur C5L2. Nos études précédentes ont établi que les souris avec le gène C3 invalidé (C3KO) sont des souris déficientes en ASP, hyperphagiques, mais de poids normal, affichant une dépense énergétique plus élevée que les souris sauvages. C’est à partir de ces résultats que nous avons basé notre objectif de déterminer le rôle de la voie ASP-C5L2 dans le métabolisme énergétique et cela autant au niveau du cerveau que des organes périphériques. Lors de notre première étude, nous avons observé qu’une injection centrale d’ASP au niveau du troisième ventricule chez des rats Wistar, amenait une diminution de la prise alimentaire et du poids corporel ainsi qu’une augmentation de l’expression d’ARNm du neuropeptide anorexigène pro-opiomélanocortine (POMC) dans la région du noyau arqué. Nos études révèlent également que les niveaux de lipides intramyocellulaires (IMCL) sont augmentés de six fois chez les souris déficientes en C5L2 (C5L2KO) par rapport aux souris sauvages (WT) suite à un régime riche en graisse. De plus, chez les sujets humains, l’expression protéique de C5L2 est réduite chez les patients diabétiques de type 2 par rapport aux témoins obèses. L'entraînement physique a augmenté l’expression protéique de C5L2 et la production d’ASP chez les hommes obèses insulino-résistants. Enfin, nos travaux avec les souris déficientes pour le récepteur du C5a (C5aRKO) montrent qu’après 12 semaines de diète riche en graisse et en sucre (DIO), les souris C5aRKO présentent une diminution du poids corporel ainsi que des dépôts adipeux gonadiques et inguinaux plus petits que leurs homologues WT. Des taux de triglycérides et d'acides gras non-estérifiés plasmatiques plus faibles et une clairance postprandiale plus rapide des triglycérides ont aussi été constatés. Nous avons donc démontré que la voie ASP/C5L2 représente une cible intéressante autant dans le contrôle de la prise alimentaire que dans le métabolisme des acides gras du muscle squelettique. / Obesity is a major health problem that results in an imbalanced energy metabolism. Acylation Stimulating Protein (ASP, C3adesArg) is a protein produced by the adipose tissue, which stimulates triglycerides (TG) synthesis and glucose transport by binding to its receptor C5L2. Our previous studies have shown that mice with a disabled C3 gene (C3KO) are ASP deficient, hyperphagic but of normal weight and demonstrate greater energy expenditure than wild-type mice. From these results, our goal was to determine the role of the ASP-C5L2 pathway in energy metabolism. In our first study, we observed that a central injection of ASP in the third ventricle of Wistar rats brought a reduction in food intake and body weight gain and an increased mRNA expression of the anorexigenic neuropeptide POMC in the region of the arcuate nucleus. Our studies also showed that the levels of intramyocellular lipids (IMCL) were increased six-fold in C5L2-deficient mice (C5L2KO) compared to wild mice (WT) after a high-fat diet. Furthermore, in humans, the protein expression of C5L2 is reduced in patients with type 2 diabetes compared with obese controls. Physical training increased protein expression of C5L2 and ASP output in obese insulin-resistant men. Finally, our work with C5a receptor-deficient mice (C5aRKO) showed that after 12 weeks of a high-fat and high-sugar diet (DIO), the C5aRKO mice exhibited reduced body weight and smaller gonadal and inguinal fat mass than their WT counterparts. This was accompanied with lower plasma levels of non-esterified fatty acids and triglycerides and faster postprandial triglyceride clearance. Our studies have demonstrated that the ASP/C5L2 pathway represents an attractive target in the control of food intake and skeletal muscle fatty acid metabolism.

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La 3-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase de type 3 humaine (3α-HSD3) a un rôle essentiel dans l’inactivation de la 5α-dihydrotestostérone (5α-DHT). Par une combinaison de la mutagenèse, de la cinétique et de la cristallographie par rayon-X, nous démontrons que la mutation de la Valine54 à la Leucine54 dans la 3α-HSD3 réduit sa capacité d’inactivation de la 5α-DHT et améliore une activité 20-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase. Par ailleurs, la structure cristalline de la 3α-HSD3 en complexe avec la 5α-androstane-3,17-dione/épi-androstérone (A-dione/epi-ADT) a été obtenue par la co-cristallisation, avec la 5α-DHT, ce qui implique que la 5α-DHT a des modes de liaison alternative avec la 3α-HSD3. La suppression de l’expression de la 3α-HSD3 par des ARNsi ne fait pas seulement qu’augmenter la concentration de la 5α-DHT dans les cellules MCF7, mais elle diminue aussi la prolifération cellulaire des cellules MCF7 en présence de 5α-DHT. Le récepteur des estrogènes de type alpha (ERα) contrôle le développement sexuel et les fonctions reproduction. Nous avons mis en place une méthode de purification du fragment de l’ERα incluant son domaine de liaison à l’ADN et de son domaine de liaison au ligand (DBD-LBD). La cristallogenèse préliminaire de l’ERα DBD-LBD en complexe avec les éléments de réponse à l’estrogène a été effectuée. Par ailleurs, nous avons rapporté une méthode de purification simple et efficace pour le domaine de liaison au ligand de l’ERα. / Human 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase type 3 (3α-HSD3) has an essential role in the inactivation of androgen 5α-dihydrotestosterone (5α-DHT). By a combination of mutagenesis, kinetics and X-ray crystallography, we demonstrate that the mutation of Valine54 to Leucine54 in 3α-HSD3 reduces its 5α-DHT inactivation ability and enhances a 20-alpha hydroxysteroid dehydrogenase activity. Furthermore, the crystal structure of 3α-HSD3 in complex with 5α-androstane-3,17-dione/epi-androsterone (A-dione/epi-ADT) is obtained by co-crystallization with 5α-DHT, which implies that 5α-DHT has the alternative binding mode within 3α-HSD3. Suppression of 3α-HSD3 expression by specific siRNA not only increases 5α-DHT concentration in MCF7 cells, but also decreases MCF7 cell proliferation in the presence of 5α-DHT. Estrogen receptor alpha (ERα) controls sexual development and reproductive functions. We establish a purification protocol of ERα fragment including its DNA binding domain and ligand binding domain (DBD-LBD). Preliminary crystallogenesis of ERα DBD-LBD in complex with estrogen response elements is carried out. Additionally, we report a simple and efficient purification method for ERα LBD.

Ce mémoire est le fruit d’un travail de deux ans dans le laboratoire de Génomique des Cancer du Dr Simard. La première partie du mémoire est une mise en contexte sur le cancer du sein et sur les deux principales voies de réparation des cassures doubles brins de l’ADN, puis se poursuit par la problématique ayant menée à l’élaboration de mon projet. Cette partie s’achève par le descriptif des techniques de laboratoire et des outils d’analyse utilisés pour ce projet. En deuxième partie se trouve l’article scientifique rédigé à partir des résultats obtenus pendant mes recherches, avant de se terminer par une conclusion.

À cause de leur implication dans la biosynthèse des estrogènes et des androgènes, les enzymes de la famille des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) types 1, 3 et 5 sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement des cancers estrogéno-dépendants et androgéno-dépendants. Malgré l’existence d’inhibiteurs de la 17β-HSD1, il n’y a pas encore de traitement du cancer du sein basé sur leur utilisation. Le CC-156 est un inhibiteur connu de la 17β-HSD1; cependant, à cause de son noyau stéroïdien, ce composé de type estrane stimule la prolifération des cellules cancéreuses sensibles aux estrogènes, limitant ainsi son utilisation thérapeutique. Afin de développer des inhibiteurs non estrogéniques de la 17β-HSD1, nous avons synthétisé trois mimiques non stéroïdiennes du CC-156 à partir du bromhydrate du tétrahydro-isoquinolinol. Bien que ces composés inhibent peu la 17β-HSD1, ils sont non estrogéniques. Nous avons aussi développé une voie de synthèse pour préparer deux chimiothèques possédant chacune 75 mimiques de l’estradiol. Ces derniers, plus flexibles que les dérivés précédents, ont été conçus et synthétisés comme potentiels inhibiteurs de la stéroïde sulfatase ou pour agir comme modulateurs sélectifs du récepteur des estrogènes. L’inhibition de la 17β-HSD3 ou de la 17β-HSD5 permettrait de diminuer le taux des androgènes circulants et tumorals. En partant de l’androstérone (ADT), nous avons préparé une nouvelle famille d’inhibiteurs de la 17β-HSD3: des 3-spiromorpholinone-ADT et des 3-spirocarbamate-ADT ayant divers groupements hydrophobes sur leur cycle E supplémentaire. Afin de poser un premier jalon pour la synthèse d’inhibiteurs hybrides des 17β-HSD3 et 17β-HSD5, une spiromorpholinone ou un spirocarbamate a été ajouté en position C-3 d’une 17-spiro-δ-lactone. Brièvement, trente-deux 3-spiromorpholinone-ADT, cinq 3-spirocarbamate-ADT, trois 17-monospiro-δ-lactone-ADT et deux 3,17-dispiroandrostane-ADT ont été synthétisés. Quatre spiromorpholinones non stéroïdiennes ont aussi été synthétisées afin d’étudier le rôle du noyau androstane sur l’efficacité des inhibiteurs de la 17β-HSD3. Tous les produits finaux et les intermédiaires ont été caractérisés par spectrométries de RMN 1H, RMN 13C, IR et SM. Le potentiel inhibiteur de tous ces composés sur la 17β-HSD3 et leur androgénicité ont été mesurés. L’analyse des relations structure-activité a permis d’obtenir deux inhibiteurs efficaces et non androgéniques de la 17β-HSD3.