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A pré-eclâmpsia (PE) é a maior causa de mortalidade e morbidade materna e perinatal. Sua etiologia permanece desconhecida, o que torna impossível a realização de prevenção primária dessa doença. O entendimento do perfil de substâncias que estão alteradas na PE é de relevância para poder atuar preventivamente. Considerando que vários hormônios envolvidos na resposta imunológica participam da fisiopatologia da PE e que, como demonstrado recentemente, a melatonina tem papel relevante na fisiopatologia da inflamação aguda, nossa hipótese seria que este hormônio poderia também atuar fisiopatologia da PE. OBJETIVOS: avaliar o perfil de citocinas e hormônios no soro de pacientes com PE para estabelecer se o eixo imune-pineal estaria ativado nesta doença. MÉTODOS: Realizamos estudo prospectivo caso-controle, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de Outubro de 2010 a Outubro de 2013. O grupo experimental foi formado por pacientes com PE pura no momento do diagnóstico (sem medicação anti-hipertensiva inicial por 24h). Gestantes saudáveis e normotensas, pareadas por idade materna, idade gestacional e paridade, foram selecionadas como controles. Citocinas (TNF, IL-8, IL-6, IL-1beta, IL-4, IFN-y , VEGF , IL-10, IL-12p40, IL-17 e IL-2), cortisol, níveis séricos de melatonina pela manhã (08h-11h) e à noite (23h- 01h), assim como os níveis de 6-sulfatoximelatonina (6-SMT) nos diferentes períodos do dia (bl1:12h-18h, bl2:18h-24h,bl3:24h-06h,bl4:06-12h) foram avaliados por MULTIPLEX e ELISA. A diferença entre os grupos foi avaliada por Two-way ANOVA seguido de pós teste de Bonferroni. Foi considerada significativamente diferente quando a probabilidade da hipótese nula foi rejeitada (p < 0,05). A correlação entre parâmetros foi avaliada por regressão linear simples e teste de Pearson. RESULTADOS: De um total de 31 pacientes inicialmente avaliadas, 14 gestantes com PE e 12 controles foram incluídas. As características das pacientes (idade materna, paridade e idade gestacional) foram semelhantes em ambos os grupos (p > 0.05). A concentração plasmática de TNF e IL-8 foi significativamente maior em pacientes com PE do que em controles, e não foi detectada a presença de IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17, IL-12p40 em ambos os grupos. A concentração de IL-4 foi similar em ambos os grupos. Níveis séricos de IFNy tenderam a ser maiores em pacientes com PE. A análise dos dados mostrou uma correlação significativamente positiva entre as concentrações plasmáticas de melatonina e TNF; melatonina e IL-8; e TNF e IL-8 no grupo PE durante período diurno. Os níveis diurnos de cortisol foram mais altos em ambos os grupos quando comparados com os noturnos; entretanto pacientes com PE apresentam níveis significativamente reduzidos de cortisol pela manhã quando comparados com o grupo controle. Níveis séricos de melatonina na pré-eclâmpsia quando comparados com controles foram maiores pela manhã, mas não à noite. O grupo controle apresentou um padrão esperado do ritmo dia/noite de melatonina, enquanto a pré-eclâmpsia não apresentou diferença significativa entre dia e noite. O ritmo circadiano de 6-SMT foi constatado em ambos os grupos, porém o valor excretado durante o dia foi maior no grupo PE que no controle. CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que a PE altera negativamente o eixo hipotálamohipófise- adrenal, induzindo um aumento no TNF, que sinaliza uma resposta inflamatória aguda. Além disso, acredita-se que os altos níveis de IL-8 e TNF possam configurar um sistema de retroalimentação que contribui para o desenvolvimento do quadro e ativação do eixo-imune pineal. Portanto, este efeito pode estar associado com o aumento da melatonina diurna na PE, induzida por TNF em células imunocompetentes ativadas. Diante disso, nossos dados sugerem que o aumento tanto de melatonina como de 6-SMT nas pacientes com PE possa ser de origem extra-pineal / Preeclampsia (PE) is a major cause of maternal and perinatal mortality and morbidity. Since its etiology remains unknown, it is impossible to have a primary prevention of the disease. The understanding of the substance profiles that are altered in PE is important to prevent the disease. Considering that many hormones involved in immune response are involved in the physiopathology of PE and that melatonin has a relevant role in the acute inflammatory process, our hypothesis is that this hormone would also be involved in the physiopathology of PE. OBJECTIVES: To analyze the serum profile of cytokines and hormones in pregnant women with PE in order to evaluate if the immune-pineal axis is activated in this disease. METHODS: A prospective case-control study was conducted at the Clinical Hospital USP between October 2010 and October 2013. Only patients with pure PE at the moment of diagnosis (without anti-hypertensive medication for the initial 24h after diagnosis) were included. Normotensive healthy pregnant women that were matched by maternal age, gestational age and parity were included as controls. Cytokines (IL-6, IL-1b, IL-8, TNF and IFNy), cortisol and serum melatonin levels in the morning (08h-11h) and at night (23h-01h), as well as 6-sulfatoximelatonin (6-SMT) levels in different periods of the day (bl1:12h- 18h, bl2:18h-24h, bl3:24h-06h, bl4:06-12h) were measured by MULTIPLEX and ELISA. Differences between groups were analyzed using two-way ANOVA followed by Bonferronis\'s test. Statistical difference was considered when the null hypothesis was rejected (p < 0.05). Correlations between parameters were analyzed using linear regression and Pearson test. RESULTS: From a total of 31 patients initially evaluated, 14 patients with PE and 12 controls were included. Demographics such as maternal age, parity, gestational age at the dosages, body-mass index were similar in both groups (p > 0.05). TNF and IL-8 levels were higher in the preeclampsia group than controls, while IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17 and IL-12p40 were not detected in both groups. IL-4 levels were similar in both groups. There was a tendency of higher levels of IFNy, in patients with PE when compared to controls. Our analysis revealed a positive correlation between melatonin and TNF, melatonin and IL-8, TNF and IL-8 in PE group. Daytime cortisol levels were higher in both groups when compared to nighttime; however, patients with preeclampsia had reduced morning levels of cortisol when compared to the control group. Melatonin serum level was higher at daytime, but not at nighttime, in patients with PE when compared to controls. Controls had the expected day/nighttime rhythm of the melatonin levels, while patients with PE did not have it. In contrast, 6-SMT rhythm was observed in both groups, but with higher daytime levels in patients with PE when compared to controls. CONCLUSION: Our results suggest that PE alters negatively the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, but induces an increase in TNF, which signalizes an acute inflammatory response. Furthermore, it is believed that high levels of IL-8 and TNF can configure a feedback system that contributes to the development of the disease and immune pineal axis activation. Therefore, this effect may be associated with increased daytime melatonin levels in PE, induced by TNF in immunocompetent cells. Thus, our data suggest that the increased melatonin and 6-SMT in patients with PE may be originated from an extra-pineal axis

Vitamin A is an essential dietary component which primarily acts through its active metabolite, retinoic acid (RA), a potent transcriptional regulator that also has non-genomic activities. There is increasing evidence for a role for vitamin A in the regulation of circadian rhythms, and previous studies suggest that it serves important roles in the pineal gland, an integral component of the circadian system due to its function of melatonin production. However very little is currently known about how these effects are mediated, or about RA signalling in the pineal gland. This study aimed to establish whether RA is synthesised in the rat pineal gland and determine its role here. This included investigating whether RA is subject to diurnal changes in synthesis and signalling, and examining its involvement in the key rhythms in this gland: melatonin synthesis, kinase activation and clock gene expression. Organotypic culture of rat pineal glands, qPCR and western blotting were among the techniques employed to do this, as well as RA quantification using a reporter cell line. The rat pineal gland was found to produce RA and robust diurnal changes in synthesis were detected. Furthermore, diurnal changes in expression of RA signalling genes suggested there are corresponding changes in RA activity. RA was not found to rapidly regulate Aanat transcription, melatonin synthesis or clock gene expression in vitro, however it was found to rapidly down-regulate extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 phosphorylation. Furthermore, strong cytoplasmic expression of RA receptor α was detected in pinealocytes. These results suggest RA has a non-genomic role in the pineal gland and may be involved in driving the diurnal rhythm in kinase activation.

A pré-eclâmpsia (PE) é a maior causa de mortalidade e morbidade materna e perinatal. Sua etiologia permanece desconhecida, o que torna impossível a realização de prevenção primária dessa doença. O entendimento do perfil de substâncias que estão alteradas na PE é de relevância para poder atuar preventivamente. Considerando que vários hormônios envolvidos na resposta imunológica participam da fisiopatologia da PE e que, como demonstrado recentemente, a melatonina tem papel relevante na fisiopatologia da inflamação aguda, nossa hipótese seria que este hormônio poderia também atuar fisiopatologia da PE. OBJETIVOS: avaliar o perfil de citocinas e hormônios no soro de pacientes com PE para estabelecer se o eixo imune-pineal estaria ativado nesta doença. MÉTODOS: Realizamos estudo prospectivo caso-controle, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de Outubro de 2010 a Outubro de 2013. O grupo experimental foi formado por pacientes com PE pura no momento do diagnóstico (sem medicação anti-hipertensiva inicial por 24h). Gestantes saudáveis e normotensas, pareadas por idade materna, idade gestacional e paridade, foram selecionadas como controles. Citocinas (TNF, IL-8, IL-6, IL-1beta, IL-4, IFN-y , VEGF , IL-10, IL-12p40, IL-17 e IL-2), cortisol, níveis séricos de melatonina pela manhã (08h-11h) e à noite (23h- 01h), assim como os níveis de 6-sulfatoximelatonina (6-SMT) nos diferentes períodos do dia (bl1:12h-18h, bl2:18h-24h,bl3:24h-06h,bl4:06-12h) foram avaliados por MULTIPLEX e ELISA. A diferença entre os grupos foi avaliada por Two-way ANOVA seguido de pós teste de Bonferroni. Foi considerada significativamente diferente quando a probabilidade da hipótese nula foi rejeitada (p < 0,05). A correlação entre parâmetros foi avaliada por regressão linear simples e teste de Pearson. RESULTADOS: De um total de 31 pacientes inicialmente avaliadas, 14 gestantes com PE e 12 controles foram incluídas. As características das pacientes (idade materna, paridade e idade gestacional) foram semelhantes em ambos os grupos (p > 0.05). A concentração plasmática de TNF e IL-8 foi significativamente maior em pacientes com PE do que em controles, e não foi detectada a presença de IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17, IL-12p40 em ambos os grupos. A concentração de IL-4 foi similar em ambos os grupos. Níveis séricos de IFNy tenderam a ser maiores em pacientes com PE. A análise dos dados mostrou uma correlação significativamente positiva entre as concentrações plasmáticas de melatonina e TNF; melatonina e IL-8; e TNF e IL-8 no grupo PE durante período diurno. Os níveis diurnos de cortisol foram mais altos em ambos os grupos quando comparados com os noturnos; entretanto pacientes com PE apresentam níveis significativamente reduzidos de cortisol pela manhã quando comparados com o grupo controle. Níveis séricos de melatonina na pré-eclâmpsia quando comparados com controles foram maiores pela manhã, mas não à noite. O grupo controle apresentou um padrão esperado do ritmo dia/noite de melatonina, enquanto a pré-eclâmpsia não apresentou diferença significativa entre dia e noite. O ritmo circadiano de 6-SMT foi constatado em ambos os grupos, porém o valor excretado durante o dia foi maior no grupo PE que no controle. CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que a PE altera negativamente o eixo hipotálamohipófise- adrenal, induzindo um aumento no TNF, que sinaliza uma resposta inflamatória aguda. Além disso, acredita-se que os altos níveis de IL-8 e TNF possam configurar um sistema de retroalimentação que contribui para o desenvolvimento do quadro e ativação do eixo-imune pineal. Portanto, este efeito pode estar associado com o aumento da melatonina diurna na PE, induzida por TNF em células imunocompetentes ativadas. Diante disso, nossos dados sugerem que o aumento tanto de melatonina como de 6-SMT nas pacientes com PE possa ser de origem extra-pineal / Preeclampsia (PE) is a major cause of maternal and perinatal mortality and morbidity. Since its etiology remains unknown, it is impossible to have a primary prevention of the disease. The understanding of the substance profiles that are altered in PE is important to prevent the disease. Considering that many hormones involved in immune response are involved in the physiopathology of PE and that melatonin has a relevant role in the acute inflammatory process, our hypothesis is that this hormone would also be involved in the physiopathology of PE. OBJECTIVES: To analyze the serum profile of cytokines and hormones in pregnant women with PE in order to evaluate if the immune-pineal axis is activated in this disease. METHODS: A prospective case-control study was conducted at the Clinical Hospital USP between October 2010 and October 2013. Only patients with pure PE at the moment of diagnosis (without anti-hypertensive medication for the initial 24h after diagnosis) were included. Normotensive healthy pregnant women that were matched by maternal age, gestational age and parity were included as controls. Cytokines (IL-6, IL-1b, IL-8, TNF and IFNy), cortisol and serum melatonin levels in the morning (08h-11h) and at night (23h-01h), as well as 6-sulfatoximelatonin (6-SMT) levels in different periods of the day (bl1:12h- 18h, bl2:18h-24h, bl3:24h-06h, bl4:06-12h) were measured by MULTIPLEX and ELISA. Differences between groups were analyzed using two-way ANOVA followed by Bonferronis\'s test. Statistical difference was considered when the null hypothesis was rejected (p < 0.05). Correlations between parameters were analyzed using linear regression and Pearson test. RESULTS: From a total of 31 patients initially evaluated, 14 patients with PE and 12 controls were included. Demographics such as maternal age, parity, gestational age at the dosages, body-mass index were similar in both groups (p > 0.05). TNF and IL-8 levels were higher in the preeclampsia group than controls, while IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17 and IL-12p40 were not detected in both groups. IL-4 levels were similar in both groups. There was a tendency of higher levels of IFNy, in patients with PE when compared to controls. Our analysis revealed a positive correlation between melatonin and TNF, melatonin and IL-8, TNF and IL-8 in PE group. Daytime cortisol levels were higher in both groups when compared to nighttime; however, patients with preeclampsia had reduced morning levels of cortisol when compared to the control group. Melatonin serum level was higher at daytime, but not at nighttime, in patients with PE when compared to controls. Controls had the expected day/nighttime rhythm of the melatonin levels, while patients with PE did not have it. In contrast, 6-SMT rhythm was observed in both groups, but with higher daytime levels in patients with PE when compared to controls. CONCLUSION: Our results suggest that PE alters negatively the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, but induces an increase in TNF, which signalizes an acute inflammatory response. Furthermore, it is believed that high levels of IL-8 and TNF can configure a feedback system that contributes to the development of the disease and immune pineal axis activation. Therefore, this effect may be associated with increased daytime melatonin levels in PE, induced by TNF in immunocompetent cells. Thus, our data suggest that the increased melatonin and 6-SMT in patients with PE may be originated from an extra-pineal axis

Des de principis del segle XX són innumerables els treballs realitzats intentant clarificar l'efecte dels camps electromagnètics continus en tot tipus d'espècies animals, entre elles l'embrió de pollastre.La glàndula pineal de les aus és un òrgan amb la funció situada entre la fotorreceptora dels rèptils i la neuroendocrina dels mamífers, pel que representa un interesant material d'estudi.En 1980 Semm, Schneider i Vollrath, plantegen per primera vegada el posible efecte dels CEM sobre la glándula pineal de les aus per considerar que la seva implicació en el procès d'orientació dels animals migratoris (relacionat amb el camp magnètic terrestre) la converteix en un òrgan especialment sensible a la variació dels camps electromagnètics. Des d'aquest moment són nombrossos els treballs que demostren la important acció moduladora que exerceixen els CEM sobre el funcionament de la glándula pineal, entre els que destaca la seva influencia en els nivells de secreció de melatonina. En estudis anteriors i centrant-nos en els estudis realitzats sobre la glándula pineal, s'ha observat que els canvis produïts en les epífisis dels embrions exposats estan més encaminats cap a un procès d'acceleració del seu desenvolupament que a alteracions ultraestructurals.Per altra banda, els resultats també semblen indicar que l'efecte acumulatiu de l'acció dels CEMc varia en funció de la intensitat de camp aplicada.Aquesta última dada, ens va fer pensar en la posibilitat de l'existència del denominat "efecte finestra" ja postulat amb anterioritat per autors com Mulay IL y Mulay LM (1964), Adey WR (1980), Ubeda A y cols., (1983), Piera y cols., (1992, 2000). Malgrat tot, per poder confirmar o refutar aquest efecte ens sembla insuficient haver realitzat les nostres investigacions utilitzant solament dos intensitats de CEMc.Hipótesi i objectius: Basant-nos en la posibilitat de l'existència de l'efecte finestra, ens plantegem repetir alguns dels nostres estudis, utilitzant un ventall més ampli d'intensitats de CEMc, situades entre les utilitzades fins al moment: 9,1 mT; 13,6 mT; 22,7 mT; 26,2 mT; 31,1 mT. Per això es determinen, els efectes sobre el desenvolupament pondoestatural de l'embrió de pollastre (estadi, pes i talla). I sobre la glándula pineal: els efectes sobre la seva morfología, mida i sobre la distribució de les vesícul.les pineals en diferents regions als 10, 15 i 21 dies de desenvolupament.Material i Mètode: S'utilitzen un total de 220 ous fecundats de la raça White Leghorn: 180 exposats (incubats sota l'acció del camp des del dia 0 al sacrifici), les condicions d'incubació van ser rigurosament controlades durant tot el període) i 40 controls.Resultats i discusió: En resum podríem dir que, en general, les glàndules dels embrions expossats segueixen el mateix patró de desenvolupament que els controls malgrat que siguin més petites. Les diferencies detectades no segueixen una pauta que ens permeti establir l'existència de l'anomenat efecte finestra, ja que inclús els valors que han resultat estadísticament significatius, tampoc teníen una distribució uniforme ni constant en un determinat grup. En els grups de 15 díes, els embrions expossats presenten un nivell de diferenciació de la porció apical de la glándula, superior al dels controls i que es manté al llarg del desenvolupament per a fer-se més evident en els grups més alts d'exposició. Els canvis que es detecten reflexen variacions en el ritme de creixement i maduració de la glándula pineal i que de forma general interpretem com a accelaració dels seus processos de maduració. / Desde principios del siglo XX son innumerables los trabajos realizados intentando clarificar el efecto de los campos electromagnéticos continuos en todo tipo de especies animales, entre ellos el embrión de pollo.La glándula pineal de las aves es un órgano cuya función se sitúa entre la fotorreceptora de los reptiles y la neuroendocrina de los mamíferos, por lo que representa un interesante material de estudio.En 1980 Semm, Schneider y Vollrath, plantean por primera vez el posible efecto de los CEM sobre la glándula pineal de las aves por considerar que su implicación en el proceso de orientación de los animales migratorios (relacionado con el campo magnético terrestre) la convierte en un órgano especialmente sensible a la variación de los campos electromagnéticos. Desde dicho momento son numerosos los trabajos que demuestran la importante acción moduladora que ejercen los CEM sobre el funcionamiento de la glándula pineal, entre los que destaca su influencia en los niveles de secreción de melatonina. En estudios anteriores y centrándonos en los estudios realizados sobre la glándula pineal, se ha observado que los cambios producidos en las epífisis de los embriones expuestos están más encaminados hacia un proceso de aceleración de su desarrollo que a alteraciones ultraestructurales.Por otro lado, los resultados también parecen indicar que el efecto acumulativo de la acción de los CEMc varía en función de la intensidad de campo aplicado. Este último dato, nos hizo pensar en la posibilidad de la existencia del denominado " efecto ventana" ya postulado con anterioridad por autores como Mulay IL y Mulay LM (1964), Adey WR (1980), Ubeda A y cols., (1983), Piera y cols., (1992, 2000). Sin embargo, para poder confirmar o refutar dicho efecto nos parece insuficiente haber realizado nuestras investigaciones utilizando sólo dos intensidades de CEMc.Hipótesis y objetivos: Basándonos en la posibilidad de la existencia de dicho efecto nos planteamos repetir algunos de nuestros estudios, empleando un abanico más amplio de intensidades de CEMc, situadas entre las utilizadas hasta el momento: 9,1 mT; 13,6 mT; 22,7 mT; 26,2 mT; 31,1 mT. Para ello se determinan, los efectos sobre el desarrollo pondoestatural del embrión de pollo (estadio, el peso y la talla).Y sobre la glándula pineal: los efectos sobre su morfología, tamaño y sobre la distribución de las vesículas pineales en distintas regiones a los 10, 15 y 21 días de desarrollo.Material y Método: se emplean un total de 220 huevos fecundados de la raza White Leghorn. 180 expuestos (incubados bajo la acción del campo desde el día 0 al de sacrificio), cuyas condiciones de incubación fueron rigurosamente controladas durante todo el periodo) y 40 controles. Resultados y discusión: En resumen podríamos decir que, en general, las glándulas de los embriones expuestos siguen el mismo patrón de desarrollo que los controles aunque sean ligeramente más pequeñas. Las diferencias detectadas no siguen una pauta que nos permita establecer la existencia del denominado efecto ventana, ya que incluso los valores que han resultado estadísticamente significativos tampoco tenían una distribución uniforme ni constante en un determinado grupo. En los grupos de 15 días, los embriones expuestos presentan un nivel de diferenciación de la porción apical de la glándula, superior al de los controles y que se mantiene a lo largo del desarrollo para hacerse más evidente en los grupos más altos de exposición. Los cambios que se detectan reflejan variaciones en el ritmo de crecimiento y maduración de la glándula pineal y que de forma general interpretamos como aceleración de sus procesos de maduración.

Avian circadian clocks are composed of a distributed network of neural and peripheral oscillators. Three neural pacemakers, located in the pineal, the eyes, and the hypothalamus, control circadian rhythms of many biological processes through complex interactions with slave oscillators located throughout the body. This system, an astonishing reflection of the life history of this diverse class of vertebrates, allows birds to coordinate biochemical and physiological processes and harmonize them with a dynamic environment. Much work has been done to understand what roles these pacemakers have in avian biology, how they function, and how they interact to generate overt circadian rhythms. The experimental work presented in this dissertation uses the domestic chicken, Gallus domesticus, as a model to address these questions and carry forward current understanding about circadian biology in this species. To do so, we utilized a custom DNA microarray to investigate rhythmic transcription in cultured chick pineal cells. We then sought to identify genes which might be a component of the pineal clock by screening for rhythmic transcripts that are sensitive to a phase-shifting light stimulus. Finally, we surgically removed the eyes or pineal from chickens to examine the roles of these extra-SCN pacemakers in regulating central and peripheral rhythms in metabolism and clock gene expression. Using these methods, we show that the oscillating transcriptome is diminished in the chick pineal ex vivo, while the functional clustering of clock controlled genes is similar. This distribution reveals multiple conserved circadian regulated pathways, and supports an endogenous role for the pineal as an immune organ. Moreover, the robustness of rhythmic melatonin biosysnthesis is maintained in vitro, demonstrating that a functional circadian clock is preserved in the reduced subset of the rhythmic pineal transcriptome. In addition, our genomic screen has yielded a list of 28 genes that are candidates for functional screening. These should be evaluated to determine any potential role they may have as a component of the pineal circadian clock. Finally, we report that the eyes and pineal similarly function to reinforce rhythms in brain and peripheral tissue, but that metabolism and clock gene expression are differentially regulated in chick.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 1989.